幾種酶活及核桃長(zhǎng)勢(shì)對(duì)腐爛病脅迫的響應(yīng)

馮 雷，耿增超，徐萬里，薛泉宏，孫寧川，雇玉忠，唐光木

(1.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院 土壤肥料與農(nóng)業(yè)節(jié)水研究所，新疆 烏魯木齊 830092；2.西北農(nóng)林科技大學(xué) 資源環(huán)境學(xué)院，陜西 楊凌 712100；3.烏魯木齊永豐天農(nóng)農(nóng)業(yè)科技發(fā)展有限公司，新疆 烏魯木齊 830000)

核桃是世界四大干果之一，也是中國(guó)主要干果出口品種，主要分布在新疆、河北、陜西等省。腐爛病嚴(yán)重危害核桃生長(zhǎng)、發(fā)育和繁殖[1]，降低了核桃產(chǎn)量及品質(zhì)。腐爛病病害程度受寄主抗性、侵染性真菌與外部環(huán)境共同影響，但目前對(duì)不同腐爛病程度與植株葉片、韌皮部酶活變化和長(zhǎng)勢(shì)作用關(guān)系的研究較少。張志華等[2]研究了核桃根與葉中過氧化物酶(POD)活性與長(zhǎng)勢(shì)之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)根POD與植株莖粗之間呈顯著負(fù)相關(guān)，周斌等[3]、相昆等[4]分析了凍害與核桃植株抗寒性之間的關(guān)系，表明超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、脯氨酸(Pro)等酶參與了低溫對(duì)核桃的脅迫，而大多數(shù)腐爛病的調(diào)查研究表明，凍害是腐爛病暴發(fā)的重要誘導(dǎo)因素。目前，仍未見腐爛病病害程度與核桃生化代謝之間關(guān)系的研究。本研究通過分析4種程度腐爛病與核桃長(zhǎng)勢(shì)(基莖)、POD、Pro、苯丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(PAL)活性，以期為核桃腐爛病侵染程度的預(yù)判提供支持。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)樣地位于新疆溫宿縣核桃林場(chǎng)3隊(duì)12年生核桃園。2016年4月25日-5月7日，在園區(qū)隨機(jī)選取發(fā)病程度為健康(J)、輕度(Q)、中度(Z)和重度(B)病害的核桃樹各7株，測(cè)定每株基莖，分別在每株的東、南、西、北4個(gè)方向各截取3年生枝條，獲得枝條混合樣品28個(gè)；同時(shí)在每一方向采集健康葉片5～7片，獲得混合葉片樣品28袋，樣品置于-70 ℃超低溫冰箱中待測(cè)。

1.2 試驗(yàn)方法

核桃腐爛病發(fā)病程度參照Biggs等[5]和孫廣宇等[6]在桃和蘋果樹標(biāo)準(zhǔn)上加以修改。健康：無病疤或 1～2 年生小枝有少量病疤；輕度：2～4年生側(cè)枝有較輕的病疤；中度：主枝上有 1 個(gè)病疤，寬度占枝干周長(zhǎng)的 50% 以上；重度：主干或主枝上有 3 個(gè)病疤，寬度均占枝干周長(zhǎng)的50%以上，并測(cè)量病斑面積(SCA)。

葉片和韌皮部POD活性的測(cè)定參照文獻(xiàn)[7]。葉片和韌皮部Pro含量的測(cè)定參照張殿忠等[8]的磺基水楊酸法。PAL的提取參照王敬文等[9]所述的方法，材料在-15 ℃冷凍固定，加適量(1∶5，m/V)預(yù)冷的硼酸緩沖液<0.2 mol/L，pH值8.8(內(nèi)含5 mmol/L巰基乙醇)，冰浴勻漿，4層濾紙抽濾得粗提液。粗提液按照Koukol等[10]法檢測(cè)。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

首先，通過Duncan′s單因素方差分析不同病害程度植株葉片和3年生分枝韌皮部POD、Pro、PAL活性的差異顯著性。其次，對(duì)腐爛病病斑面積、POD、Pro、PAL活性和基莖周長(zhǎng)對(duì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)化，Pearson相關(guān)分析檢驗(yàn)植株葉片與病斑面積之間的相關(guān)性(P< 0.05)，然后將標(biāo)準(zhǔn)化后的病斑面積分別與標(biāo)準(zhǔn)后的葉片POD、Pro、PAL活性和植株基莖進(jìn)行線性擬合。圖中數(shù)據(jù)是平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤。

2 結(jié)果與分析

2.1 腐爛病發(fā)病程度對(duì)PAL活性的影響

由圖1可知，不同程度腐爛病植株葉片PAL活性差異顯著(P< 0.05)。輕度腐爛病植株(Q)葉片PAL活性最高，平均達(dá)到6 680.55 U/(g·h)，健康植株(J)葉片PAL活性最低，平均為2 995.83 U/(g·h)，不同病害植株葉片PAL活性排序?yàn)椋狠p度(Q)>中度(Z)>重度(B)>健康(J)。

不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。圖2，4，5，7，8同。Different lowercase shows a significant difference(P<0.05).The same as Fig.2,4,5,7,8.

如圖2，與葉片相比，隨著病害程度增加，核桃植株莖PAL活性增加略顯緩慢，相同病害程度，輕度腐爛病葉片PAL活性已達(dá)到最高值，莖韌皮部PAL活性僅為次高值，病害進(jìn)一步加強(qiáng)至中度腐爛病PAL活性最高。不同腐爛病程度核桃植株莖韌皮部PAL活性差異顯著(P<0.05)，其中，中度腐爛病PAL活性平均為9 069.59 U/(g·h)，是健康植株的3倍，輕度腐爛病的1.3倍，重度腐爛病的1.7倍。圖3線性回歸分析表明，SCA與PAL活性之間沒有明顯線性關(guān)系(P>0.60)。

圖2 不同程度腐爛病核桃植株莖PAL活性比較Fig.2 Comparative with PAL activity of stem at different levels of Jugladis canker

圖3 核桃植株病斑面積與葉PAL活性回歸分析Fig.3 Linear regression analysis with Jugladis canker area and PAL activity of leaf

2.2 腐爛病發(fā)病程度對(duì)POD活性的影響

如圖4，除中度腐爛病與重度病害葉片POD活性差異不顯著(P>0.05)，其他病害程度植株葉片POD活性之間存在顯著差異(P<0.05)。其中，健康植株葉片POD活性最高，平均為128.26 U/(g·h)，重度病害葉片POD活性最低，平均為8.29 U/(g·h)，不同病害植株葉片POD活性排序?yàn)椋航】?J)>輕度(Q)>中度(Z)>重度(B)。

圖4 不同程度腐爛病核桃植株葉片POD活性比較Fig.4 Comparative with POD activity of leaf at different levels of Jugladis canker

不同病害程度植株莖韌皮部POD活性有一定差異，其中中度腐爛病莖韌皮部POD活性最高，平均為4.72 U/(g·h)，與健康植株、輕度和重度腐爛病差異顯著(P<0.05)。分別是后三者的3.0，1.7，2.0倍，如圖5。

由圖6可知，SCA與葉片POD活性線性回歸方程y=3.66-0.66x，r=-0.76，P<0.001。同時(shí)，可看出POD活性<2.4，病斑面積與之呈超顯著負(fù)相關(guān)。由此說明，當(dāng)葉片POD活性增加，腐爛病病斑面積隨之減小。

圖5 不同程度腐爛病核桃植株莖POD活性比較Fig.5 Comparative with POD activity of stem at different levels of Jugladis canker

圖6 核桃植株病斑面積與葉POD活性回歸分析Fig.6 Linear regression analysis with Jugladis canker area and POD activity of leaf

2.3 腐爛病程度對(duì)Pro活性的影響

如圖7，核桃中度腐爛病植株葉片Pro活性與其他病害程度葉片差異顯著，其他腐爛病病害程度葉片間Pro活性差異不顯著(P>0.05)。中度腐爛病植株葉片Pro活性最高，平均為308.57 U/(g·h)，是輕度腐爛病植株葉片Pro活性15.7倍。不同病害植株葉片Pro活性排序?yàn)椋褐卸?Z)>重度(B)>健康(J)>輕度(Q)。

圖7 不同程度腐爛病核桃植株葉片Pro活性比較Fig.7 Comparative with Pro activity of leaf at different levels of Jugladis canker

莖Pro活性與其他組織差異較大，表現(xiàn)為輕度腐爛與健康植株差異顯著(P<0.05)，中度腐爛病和重度腐爛病差異顯著(P<0.05)；健康植株與中度腐爛病差異不顯著(P>0.05)，輕度與重度差異不顯著(P>0.05)，如圖8。

由圖9可知，SCA 與葉片Pro活性線性回歸方程：y=0.56x+1.77,r= 0.52，P<0.004。同時(shí)，可看出2.4

由表1相關(guān)分析可知，SCA與POD活性和植株基莖周長(zhǎng)呈極顯著負(fù)相關(guān)，與Pro活性呈極顯著正相關(guān)(P<0.01)，與PAL活性相關(guān)性不顯著(P>0.05)。PAL活性與POD活性呈極顯著負(fù)相關(guān)，與Pro活性呈極顯著正相關(guān)(P<0.01)。表1顯示腐爛病致病菌侵染程度受POD、Pro、植株基莖極顯著影響，上述因子影響腐爛病致病菌侵染程度的強(qiáng)弱依次是：核桃基莖>POD活性>Pro活性。

圖8 不同程度腐爛病核桃植株莖Pro活性比較Fig.8 Comparative with Pro activity of stem at different levels of Jugladis canker

圖9 核桃植株病斑面積與葉Pro活性回歸分析Fig.9 Linear regression analysis with Jugladis canker area and Pro activity of leaf

表1 腐爛病病斑面積與PAL、POD、Pro、基莖周長(zhǎng)的相關(guān)性分析(P<0.05)Fig.1 Pearson correlation Jugladis canker with PAL，POD，Pro activity and stem circumference

3 結(jié)論與討論

PAL 是次生代謝物質(zhì)合成過程中的關(guān)鍵酶，能促使植物體產(chǎn)生次生代謝物質(zhì)抵抗病原菌的侵染，從而起到抗病作用，被認(rèn)為是植物的防御酶之一。研究認(rèn)為 PAL 活性與植物的抗病性呈正相關(guān)[11]。而劉佳[12]在研究南瓜時(shí)發(fā)現(xiàn)，隨著病害程度增加，PAL活性降低，并未顯示出相關(guān)性，且染病比抗病植株活性高。本試驗(yàn)表明，4種病害程度核桃植株葉片和韌皮部PAL活性存在顯著差異，與前人研究結(jié)果一致[13]。但輕度病害程度核桃植株葉片和中度病害程度莖韌皮部PAL活性分別達(dá)到最高，這與前人研究不同，可能是因?yàn)槿~片對(duì)于腐爛病病菌侵染更為敏感，葉片缺少合成PAL前體物質(zhì)，而莖的韌皮部截留或富集一定量合成PAL前體的物質(zhì)，如木質(zhì)素、黃酮、異黃酮、生物堿。另外一方面，植物為抵抗外界生物脅迫，優(yōu)先將抗性物質(zhì)輸送至病害或者潛在病害處。

POD作為一種植物抗性酶，其活性一定程度可以反映植物的抗病性[14]。陳臻等[15]研究了黃腐酸對(duì)蘋果腐爛病防御酶POD活性影響，試驗(yàn)結(jié)果表明，其活性先上升后降低。但也有研究認(rèn)為二者沒有顯著線性或負(fù)相關(guān)關(guān)系：如劉普等[16]認(rèn)為，梨樹腐爛病病害程度與枝條韌皮部POD酶活性無顯著關(guān)系；張新慧等[17]發(fā)現(xiàn)，連作后當(dāng)歸葉片POD酶活性降低。本試驗(yàn)表明，POD酶活性與核桃腐爛病病斑面積呈極顯著負(fù)相關(guān)，這與張新慧等[17]研究結(jié)果相同。Pro含量及活性的變化能夠表征植物抗逆性。湛蔚等[18]發(fā)現(xiàn)，菌根誘導(dǎo)下楊樹病害部位Pro含量顯著降低，表明病害程度可能與Pro含量存在正相關(guān)關(guān)系。本試驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)隨著病害程度增加，Pro活性顯著提高。

本研究顯示，腐爛病與核桃生長(zhǎng)勢(shì)呈極顯著負(fù)相關(guān)，與多數(shù)研究結(jié)果一致。吳玉霞等[19]研究發(fā)現(xiàn)，梨樹生長(zhǎng)勢(shì)增強(qiáng)，腐爛病發(fā)病率顯著降低。樊祥倫[20]通過調(diào)查指出：減輕枝干傷疤從而增強(qiáng)樹勢(shì)可以降低病害發(fā)生。亦有研究顯示：蘋果腐爛病發(fā)生程度與樹勢(shì)相關(guān)[21]。馮雷等[22]研究了核桃腐爛病發(fā)病程度與核桃體內(nèi)元素比例關(guān)系，礦質(zhì)元素P/K<0.28，核桃植株長(zhǎng)勢(shì)更好，未見病菌進(jìn)一步侵染。李美美等[23]通過修剪方式控制樹勢(shì)，降低了腐爛病發(fā)病率。因此說明，增強(qiáng)樹勢(shì)可顯著降低植物病害發(fā)病程度。

通過分析不同病害程度植株葉片，病害部位抗氧化酶，結(jié)果顯示，葉片POD和Pro活性均可指示腐爛病侵染過程，葉片POD活性能更好反映核桃腐爛病發(fā)生過程。通過增強(qiáng)核桃植株長(zhǎng)勢(shì)可以降低腐爛病侵染程度。