檳榔江水牛BMP4基因分離鑒定、組織表達(dá)及生物信息學(xué)分析

郭文博，哈 福，江明星，張自芳，錢林東，保志鵬，苗永旺

(1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，云南 昆明 650201；2.云南農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院 畜牧獸醫(yī)學(xué)院，云南 昆明 650212)

骨形態(tài)發(fā)生蛋白(Bone morphogenetic protein, BMP)是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(Transforming growth factor-beta, TGF-β)超家族成員，在脊椎動(dòng)物胚胎干細(xì)胞分化和器官發(fā)生過(guò)程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用[1-2]。BMP作為TGF-β超家族中最大的配體亞家族，最早發(fā)現(xiàn)于1965年，迄今已經(jīng)識(shí)別和鑒定出的BMP成員不下20種[3]。BMP4基因是BMP基因家族中的重要成員，其編碼產(chǎn)物和其他骨形態(tài)發(fā)生蛋白一樣，參與骨和軟骨組織的發(fā)育。已有研究顯示，BMP4在生殖細(xì)胞發(fā)育過(guò)程中也發(fā)揮重要作用[4]。Li等[5]研究結(jié)果揭示BMP4通過(guò)參與BMP4/Smad信號(hào)通路在精原干細(xì)胞分化的調(diào)控過(guò)程中起重要作用。BMP4參與的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)是由細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白Smad介導(dǎo)的，BMP4通過(guò)與細(xì)胞表面2種絲氨酸/蘇氨酸激酶受體(Ⅰ型和Ⅱ型)結(jié)合形成異源復(fù)合物，Ⅱ型受體使Ⅰ型受體轉(zhuǎn)磷酸化，后者的激活導(dǎo)致Smad 1/5/8的磷酸化，然后導(dǎo)致Smad 1/5/8與Smad 4發(fā)生寡聚，并以復(fù)合物的形式轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核并發(fā)揮轉(zhuǎn)錄因子的作用[6]。人類BMP4參與體內(nèi)復(fù)雜的調(diào)控過(guò)程，BMP4基因突變與人類眼球缺血性小眼病(Anophthalmia microphthalmia，AM)及SHORT綜合征等疾病的發(fā)生有關(guān)[7-8]。存在于哺乳動(dòng)物體細(xì)胞和生殖細(xì)胞中的BMP4/Smad信號(hào)通路在精子生成和原始卵泡發(fā)育過(guò)程中的重要調(diào)控作用已得到證實(shí)[5,9-10]。

迄今，關(guān)于BMP4基因的研究多集中于人和小鼠上，該基因在其他動(dòng)物上的研究報(bào)道較少。人類BMP4基因定位于染色體14q22.2-q23，編碼區(qū)全長(zhǎng)1 227 bp，編碼408個(gè)氨基酸[7]。小鼠BMP4基因包括5個(gè)外顯子和4個(gè)內(nèi)含子，其編碼區(qū)全長(zhǎng)1 227 bp，編碼408個(gè)氨基酸[11]。有報(bào)道稱BMP4參與豬的卵泡發(fā)育過(guò)程[12]。從長(zhǎng)白×大白雜交育肥豬的腎臟和脊髓中分離得到豬的BMP4編碼區(qū)序列，長(zhǎng)度為1 230 bp，編碼409個(gè)氨基酸[13]。由NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)上(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)已發(fā)表的數(shù)據(jù)顯示，普通牛BMP4基因定位于10號(hào)染色體上，含有3個(gè)外顯子，2個(gè)內(nèi)含子，編碼區(qū)全長(zhǎng)1 230 bp，編碼409個(gè)氨基酸。

水牛是我國(guó)南方極具開發(fā)潛力和價(jià)值的家畜，可以奶用、肉用和役用，但水牛繁殖效率低，發(fā)情周期長(zhǎng)，發(fā)情癥狀不明顯，生殖細(xì)胞發(fā)育遲緩等在一定程度上限制了水牛產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，是目前水牛養(yǎng)殖過(guò)程中急需解決的問題。卵巢內(nèi)卵泡的發(fā)生發(fā)育對(duì)水牛發(fā)情周期具有顯著影響。已有研究顯示，BMP4基因在哺乳動(dòng)物卵巢生殖細(xì)胞成熟發(fā)育過(guò)程中起著重要的調(diào)節(jié)作用。因此，對(duì)BMP4基因的研究，有助于深入了解水牛卵巢發(fā)育和繁殖性狀的遺傳基礎(chǔ)。本研究對(duì)檳榔江水牛BMP4基因進(jìn)行了分離及功能生物信息學(xué)和多個(gè)組織差異表達(dá)分析，以期揭示水牛BMP4基因的分子特征和生物學(xué)功能，為深入了解水牛BMP4在生殖細(xì)胞成熟過(guò)程中的作用機(jī)制提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

5頭雄性和5頭雌性的成年、健康的檳榔江水牛各采自云南騰沖市，它們相互之間無(wú)直接血緣關(guān)系。每頭牛屠宰后，分別迅速取心臟、肝臟、脾臟、肺、腎、肌肉、小腸、瘤胃、子宮、卵巢和睪丸組織，置于液氮中，帶回實(shí)驗(yàn)室。

1.2 組織總RNA提取和cDNA合成

組織樣品總RNA提取采用RNAiso Plus(TaKaRa，中國(guó)大連)。通過(guò)核酸定量?jī)x和瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其濃度和完整性。cDNA第一鏈合成采用 Oligo(dT)18(500 μg/mL)和逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒(Invitrogen M-MLV，TaKaRa，中國(guó)大連)。將cDNA 母液稀釋成 50 ng/μL 的工作液，置于-20 ℃冰箱備用。

1.3 BMP4基因序列分離及多組織表達(dá)譜檢測(cè)

根據(jù)已公布的普通牛BMP4基因序列(NM_001045877)，采用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)分別用于分離該基因完整編碼區(qū)及多組織差異表達(dá)分析的引物。以水牛18SrRNA基因序列(JN412502)設(shè)計(jì)內(nèi)參基因PCR引物。設(shè)計(jì)的引物送上海生物工程有限公司合成。引物信息見表1。

表1 PCR及半定量RT-PCR引物信息Tab.1 Primer information of PCR and Semi-quantitative RT-PCR

進(jìn)行基因分離采用的PCR體系包含： 10×Buffer(Mg2+15 mmol/mL )4 μL，上、下游引物(10 μmol/μL)各0.7 μL， dNTP(2.5 mmol/mL)2 μL， rTaqDNA聚合酶(5 U/μL)0.25 μL(TaKaRa，中國(guó)大連)，DNA模板2 μL(約100 ng)，ddH2O補(bǔ)至25 μL。擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s→退火30 s→72 ℃延伸2 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃后延伸10 min。

各組織差異表達(dá)分析采用半定量RT-PCR 方法進(jìn)行檢測(cè)，反應(yīng)體系包含： 10×Buffer(Mg2+15 mmol/mL )2.5 μL，上、下游引物(10 μmol/μL)各0.5 μL， dNTP(2.5 mmol/mL)2 μL， rTaqDNA聚合酶(5 U/μL)0.25 μL(TaKaRa，中國(guó)大連)，DNA模板2 μL(約100 ng)，ddH2O補(bǔ)至25 μL。擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s→退火30 s→72 ℃延伸40 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃后延伸5 min。

PCR產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行拍照記錄。

1.4 數(shù)據(jù)分析

應(yīng)用ORF finder程序(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorfi/orf.html)，對(duì)獲得的基因序列進(jìn)行開放閱讀框預(yù)測(cè)，獲得編碼區(qū)全序列。將所獲得的CDS序列為查詢序列，應(yīng)用Blast程序(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)進(jìn)行基因同源性搜索，確定獲得序列的基因?qū)傩?。采用在線軟件Prosite、MART、Protparam、ProtScale、SignalP 4.0 server、TMHMM-2.0 server、 ProtComp、SOPA、SWISS-MODEL分別預(yù)測(cè)BMP4蛋白質(zhì)功能位點(diǎn)、功能結(jié)構(gòu)域、理化性質(zhì)及氨基酸組成、疏水性、信號(hào)肽預(yù)測(cè)、跨膜結(jié)構(gòu)域、亞細(xì)胞定位、二級(jí)、三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)。利用EditPlus軟件進(jìn)行序列編輯；利用Bioedit和DNAStar(DNAStar Inc.)軟件包進(jìn)行序列拼接比對(duì)；利用MEGA 6進(jìn)行物種間氨基酸序列比較、N-J系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建及突變位點(diǎn)輸出。

采用Quantity One 軟件分析BMP4基因在各組織中的表達(dá)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 水牛BMP4基因PCR分離

獲得目的擴(kuò)增片段為1 476 bp，結(jié)果清晰無(wú)雜帶，見圖1。

M. DL2000分子量；1.水牛BMP4基因RT-PCR產(chǎn)物。M.Marker DL2000; 1.RT-PCR product of buffalo BMP4 gene.

2.2 BMP4 CDS區(qū)序列分析

獲得水牛BMP4基因的CDS序列為1 230 bp，編碼409個(gè)氨基酸(圖2)。通過(guò)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行同源搜索比對(duì)，水牛序列與普通牛(NM_001045877)、野牦牛(XM_005901928)、綿羊(NM_001110277)、山羊(NM_001285646)的BMP4基因序列長(zhǎng)度相同，序列同源性皆為99%，確定其為水牛BMP4基因序列(獲登錄號(hào)KF312880)。水牛BMP4基因CDS區(qū)A、G、T、C堿基的組成分別為22.68%，28.86%，19.51%，28.94%。在基因結(jié)構(gòu)上，水牛BMP4基因與普通牛的相似，含有3個(gè)外顯子，2個(gè)內(nèi)含子。

2.3 水牛BMP4分析

2.3.1 基本理化特征 檳榔江水牛與普通牛BMP4蛋白(NP_001039342)序列差異較小，基本理化特征相似，但普通牛BMP4蛋白穩(wěn)定性略高(表2)。

2.3.2 信號(hào)肽、細(xì)胞定位和跨膜結(jié)構(gòu)域分析 檳榔江水牛BMP4蛋白具有1個(gè)信號(hào)肽序列(圖3-A)，該信號(hào)肽序列最大可能裂解位點(diǎn)在24-25位氨基酸。該蛋白不含跨膜結(jié)構(gòu)域，最大疏水位點(diǎn)位于第14位半胱氨酸處(2.978)，最大親水位點(diǎn)位于第307位賴氨酸處(-3.300)，屬親水性蛋白(圖3-B)。亞細(xì)胞定位分析顯示，水牛BMP4蛋白屬胞外分泌型蛋白。

2.3.3 結(jié)構(gòu)域與結(jié)構(gòu)分析 在水牛BMP4蛋白上發(fā)現(xiàn)2個(gè)結(jié)構(gòu)域，與普通牛保守結(jié)構(gòu)域一致，在39-276位氨基酸處為TGFβ前導(dǎo)肽(TGFβ_propeptide)結(jié)構(gòu)域，在309-409位氨基酸處為TGF-β超家族結(jié)構(gòu)域，如圖4。在BMP4蛋白TGF-beta超家族結(jié)構(gòu)域中，水牛與其他物種一致，均含有7個(gè)保守半胱氨酸殘基，半胱氨酸在不同物種蛋白序列上的位置見圖5。

陰影部分為保守結(jié)構(gòu)域：39-276位氨基酸為TGF-beta前導(dǎo)肽結(jié)構(gòu)域；309-409位氨基酸為TGF-beta超家族結(jié)構(gòu)域；*.終止密碼子。The shaded part is a conserved domain: amino acids 39-276 belong to the TGF-beta propeptide domain;Amino acids 309-409 belong to the TGF-beta superfamily domain; *. Stop codon.

基本理化特征Basic physical and chemical properties水牛Buffalo普通牛Cattle氨基酸數(shù) Number of amino acids409409分子質(zhì)量/ku Molecular weight 46.6446.64等電點(diǎn)/PI Isolectric point 8.578.57 分子式FormulaC2054H3225N619O596S16C2053H3223N619O596S16強(qiáng)酸性氨基酸殘基Strongly acidic amino acids (D,E)4646強(qiáng)堿性氨基酸殘基Strongly basic amino acids (K,R)5050疏水性氨基酸Hydrophobic amino aciads (A,I,L,F,W,V)128128極性氨基酸Polar amino acids (N,C,Q,S,T,Y)102102不穩(wěn)定系數(shù)Instability index59.4959.02脂肪系數(shù)Aliphatic index80.5480.54平均親水系數(shù)Grand average of hydropathicity (GRAVY)-0.543-0.543

SignalP-4.1 prediction(euk networks): Sequence.由SignalP-4.1程序預(yù)測(cè)(euk networks)的用戶氨基酸序列的信號(hào)肽；ProtScale output for user_sequence.由ProtScale程序輸出的用戶氨基酸序列的疏水性。

圖4 水牛BMP 4的保守結(jié)構(gòu)域Fig.4 Putative conserved domain of buffalo BMP 4

- - - - - -.不同物種間完全相同的氨基酸序列；陰影部分為保守半胱氨酸殘基。- - - - - -.The same amino acid sequence between different species; The shaded part indicates the conserved Cysteine residue.

二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，水牛BMP4有24.45%的氨基酸構(gòu)成α-螺旋(Alpha helices)，18.09%的氨基酸構(gòu)成延伸鏈(Extended strands)，2.20%的氨基酸構(gòu)成β-轉(zhuǎn)角(Beta turns)，55.26%的氨基酸構(gòu)成無(wú)規(guī)則卷曲(Random coils)。進(jìn)行蛋白質(zhì)同源建模搜索顯示，水牛BMP4蛋白序列與Swiss-Model數(shù)據(jù)庫(kù)中的同源序列一致性小于30%，同源建模可信度較低。

2.3.4 功能位點(diǎn)預(yù)測(cè) 水牛與普通牛BMP4蛋白(NP_001039342)功能位點(diǎn)完全一致，預(yù)測(cè)結(jié)果見表3。

表3 蛋白功能位點(diǎn)預(yù)測(cè)Tab.3 The prediction of protein functional sites

2.3.5 同源性分析 將水牛BMP4氨基酸序列輸入NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行同源搜索，獲得下列物種的一致序列：牦牛(Bosmutus，XP_005901990)、普通牛(Bostaurus，NP_001039342)、綿羊(Ovisaries，NP_001103747)、山羊(Caprahircus，NP_001272575)、野豬(Susscrofa，NP_001094501)、犬(Canislupusfamiliaris，NP_001274099)、小鼠(Musmusculus，NP_031580)、狒狒(Papioanubis，NP_001162558)、人(Homosapiens，NP_001193)、馬(Equuscaballus，NP_001157442)。各物種BMP4蛋白氨基酸序列一致性比對(duì)結(jié)果見表4。水牛與牦牛的氨基酸序列完全一致，與其他?？莆锓N序列一致性超過(guò)99%，與非牛科物種間序列一致性超過(guò)97%?；谝陨衔锓NBMP4蛋白的氨基酸序列構(gòu)建了NJ-系統(tǒng)發(fā)育樹以揭示不同物種間BMP4蛋白的進(jìn)化關(guān)系，結(jié)果表明，?？莆锓N聚在一起，且有較高的支持率(85%)(圖6)。

表4 不同物種間BMP4氨基酸序列一致性與分歧度Tab.4 Amino acid sequence consistency and divergence of BMP4 between different species %

注：對(duì)角線上方數(shù)值表示序列一致性，對(duì)角線下方數(shù)值表示序列分歧度。

Note: Data above the diagonal line represent the percent identify and below the diagonal line represent the sequential divergence.

圖6 水牛與其他物種BMP4氨基酸序列N-J系統(tǒng)樹Fig.6 N-J phylogenetic tree of BMP4 amino acid sequences in buffalo and other species

2.4 組織差異表達(dá)分析

采用半定量RT-PCR法，以18SrRNA作為內(nèi)參，檢測(cè)BMP4在檳榔江水牛11個(gè)組織中的差異表達(dá)。結(jié)果顯示(圖7)，BMP4基因只在水牛子宮、卵巢和睪丸中表達(dá)，其中在睪丸組織中表達(dá)水平最高。

18S rRNA表達(dá)作為內(nèi)參。M.DL2000 DNA Marker。1.子宮；2.卵巢；3.肝臟；4.瘤胃；5.小腸；6.肌肉；7.腎；8.肺；9.脾臟；10.睪丸；11.心臟。The expression level of 18S rRNA served as an internal control. M.DL2000 DNA Marker; 1. Testis; 2. Ovary; 3. Uterus; 4. Rumen; 5. Small intestine; 6. Muscle; 7. Kidney; 8. Lung; 9. Spleen; 10. Liver; 11. Heart.

3 討論

本研究分離獲得檳榔江水牛BMP4基因的編碼區(qū)序列長(zhǎng)為1 230 bp，編碼409個(gè)氨基酸，與普通牛BMP4基因編碼區(qū)序列長(zhǎng)度相同，序列一致性為99%。生物信息學(xué)分析顯示，檳榔江水牛BMP4蛋白含有一個(gè)信號(hào)肽，平均親水系數(shù)為-0.543，為親水性蛋白，不具有跨膜結(jié)構(gòu)域，屬于胞外分泌型蛋白；水牛BMP4含有TGF-beta前導(dǎo)肽和TGF-beta超家族結(jié)構(gòu)域。氨基酸序列比對(duì)結(jié)果顯示，水牛與野牦牛、普通牛、人、犬和小鼠等其他10個(gè)物種BMP4序列一致性在97%以上。物種間BMP4蛋白序列一致性較高，揭示了BMP4蛋白序列在進(jìn)化上具有保守性。水牛與普通牛的BMP4基本理化特征、結(jié)構(gòu)和功能位點(diǎn)極相似；在構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹上，水牛與野牦牛、普通牛、山羊和綿羊聚在一起，表明水牛與?？破渌锓N的BMP4在功能上更接近。

作為BMP/Smad信號(hào)通路的重要激活因子，BMP4在不同組織和器官內(nèi)廣泛存在并被特異性激活，進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞增殖、黏附、遷移、分化和凋亡等一系列細(xì)胞代謝過(guò)程，在胚胎發(fā)生和組織內(nèi)穩(wěn)態(tài)過(guò)程發(fā)揮著重要作用[5]。BMP4所含有的2個(gè)結(jié)構(gòu)域中，TGF-β前導(dǎo)肽結(jié)構(gòu)域又稱潛在相關(guān)肽(Latency associated peptide，LAP)，LAP與BMP4在體內(nèi)的組織特異性表達(dá)和傳導(dǎo)范圍有關(guān)，是產(chǎn)生具備穩(wěn)定功能活性的成熟BMP4蛋白所必需的調(diào)節(jié)肽[14]；TGF-β結(jié)構(gòu)域存在7個(gè)保守的半胱氨酸，其中6個(gè)形成3個(gè)分子內(nèi)二硫鍵，稱為胱氨酸結(jié)，第7個(gè)半胱氨酸通過(guò)另一個(gè)單體結(jié)合形成共價(jià)二硫鍵，從而形成生物活性信號(hào)分子，并通過(guò)與Ⅰ型和Ⅱ型絲氨酸或蘇氨酸激酶受體結(jié)合來(lái)啟動(dòng)信號(hào)傳遞[3]。人類BMP4基因的移碼突變(c.226del2，p.S76fs104X)發(fā)生于TGF-β前體結(jié)構(gòu)域N-末端，個(gè)體表現(xiàn)出AM、視網(wǎng)膜營(yíng)養(yǎng)不良、近視、多指/并指和原發(fā)性腦發(fā)育障礙等癥狀[7]。大量研究表明，BMP系統(tǒng)在卵泡發(fā)生和排卵的過(guò)程中起著重要調(diào)節(jié)的作用，在原始卵泡、初級(jí)卵泡、次級(jí)卵泡和腔卵泡的卵母細(xì)胞中均有磷酸化Smad1/5的表達(dá)，表明BMP4/Smad信號(hào)通路促進(jìn)原始卵泡發(fā)育啟動(dòng)和原始卵泡存活[10]。免疫組化試驗(yàn)表明，BMP4、BMP6、BMP7及其受體BMPRIB、BMPRII、ActRII和ActRIIB等在牛卵泡膜細(xì)胞中均有表達(dá)，這些受體可與BMP-4、BMP-6和BMP-7結(jié)合并形成功能性信號(hào)傳導(dǎo)復(fù)合物，從而激活Smad介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，調(diào)控卵泡膜細(xì)胞的增殖，肽類激素分泌等細(xì)胞反應(yīng)[15]。免疫組化試驗(yàn)證實(shí)，BMP4、BMP6、BMP7及其受體BMPR1和BMPR2在成年女性顆粒細(xì)胞內(nèi)表達(dá)[16]。BMP4是目前確認(rèn)的唯一一個(gè)調(diào)控成人支持細(xì)胞發(fā)育和功能的自分泌因子，內(nèi)源性BMP4通過(guò)激活Smad1/5和ID2/3通路，促進(jìn)成人支持細(xì)胞增殖及雄激素受體等精子生成必需蛋白的合成，其活性異常與人類非阻塞性無(wú)精癥有關(guān)[17]。本研究所得水牛BMP4序列也具有TGF-beta前導(dǎo)肽結(jié)構(gòu)域和TGF-beta超家族結(jié)構(gòu)域，與人類、普通牛等物種的BMP4保守結(jié)構(gòu)域相同，功能位點(diǎn)種類一致，特別值得一提的是在BMP4蛋白TGF-beta超家族結(jié)構(gòu)域中，水牛與其他物種都含有7個(gè)保守半胱氨酸殘基，其所構(gòu)成的半胱氨酸結(jié)構(gòu)基序是BMP4蛋白發(fā)揮功能的重要結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。表明水牛BMP4蛋白與其他物種BMP4的功能相近，推測(cè)其可能參與水牛體內(nèi)BMP4/Smad信號(hào)通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)，在水牛骨骼形成、卵泡發(fā)育和精子形成等過(guò)程中發(fā)揮重要調(diào)控功能。

BMP4在小鼠多種卵巢細(xì)胞類型中表達(dá)，在卵泡膜、黃體、卵巢表面上皮、性索和部分血管內(nèi)皮細(xì)胞中mRNA表達(dá)水平最高，在發(fā)育中的優(yōu)勢(shì)卵泡膜中mRNA表達(dá)水平較高，在閉鎖卵泡中mRNA表達(dá)水平非常低或不可檢測(cè)[18]。Fatehi等[19]研究發(fā)現(xiàn)，BMP4基因mRNA在牛竇卵泡所有腔體中都有表達(dá)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示，BMP4在牛退化胚胎中的表達(dá)量較囊胚高，母體卵巢內(nèi)BMP4基因型與體外培養(yǎng)的囊胚率顯著相關(guān)，表明BMP4在胚胎和母體水平上對(duì)著床前胚胎發(fā)育起著重要的調(diào)節(jié)作用[20]。本研究顯示，BMP4基因在檳榔江水牛的卵巢、子宮組織中均有表達(dá)，揭示該基因在水牛這些組織中發(fā)揮功能，特別是在卵巢中可能參與了卵泡成熟過(guò)程。Hu等[21]發(fā)現(xiàn)，BMP4的mRNA主要表達(dá)于雄性小鼠精母細(xì)胞和支持細(xì)胞中，且在附睪發(fā)育過(guò)程中持續(xù)表達(dá)，在C57BL/6背景的BMP4雜合子雄性小鼠中出現(xiàn)生殖細(xì)胞退化、精子數(shù)量減少和精子活力下降等現(xiàn)象。RT-PCR顯示BMP4及其3種受體基因的轉(zhuǎn)錄本在新鮮分離的成人支持細(xì)胞和睪丸組織中表達(dá)。本研究發(fā)現(xiàn)，BMP4在水牛睪丸組織中表達(dá)且表達(dá)量最高，推測(cè)BMP4基因在水牛雄性生殖細(xì)胞發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮重要功能。鑒于BMP4基因在水牛生殖過(guò)程中的重要作用，進(jìn)一步了解其具體的調(diào)控機(jī)制將有助于解析水牛繁殖性狀的形成機(jī)理，可為水牛繁殖性狀的選育提供依據(jù)。