利用干細(xì)胞篩選中藥神經(jīng)保護(hù)作用活性成分的新方法＊

譚 睿，趙 騫，盧 瓊，馬曉玲，李金圣，蔡少青

（1.西南交通大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院/醫(yī)學(xué)院 成都 610031；2.北京大學(xué)藥學(xué)院 北京 100191）

中藥是中醫(yī)防病治病的物質(zhì)基礎(chǔ)，中藥藥效物質(zhì)是其所含具有防病治病作用的化學(xué)物質(zhì)，也是質(zhì)量控制的物質(zhì)基礎(chǔ)。然而，大部分中藥活性成分尚不明確或只是部分清楚，中藥藥效物質(zhì)不明確、指標(biāo)性成分與功效相關(guān)性不強(qiáng)、單指標(biāo)或少數(shù)指標(biāo)性成分的含量測定難以有效控制整體質(zhì)量等問題普遍存在，嚴(yán)重限制了中藥作用機(jī)制的闡明和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提高。

因此，研究中藥復(fù)雜體系藥效物質(zhì)的方法和技術(shù)有待提高。尤其是，如何對中藥中具有顯著生理活性、有望成為創(chuàng)新藥物研究重要源頭分子的微量成分進(jìn)行可靠的活性評價(jià)？本文介紹一種利用干細(xì)胞篩選中藥中微量活性物質(zhì)的新方法——“分子靶向篩選+干細(xì)胞定向誘導(dǎo)模型”，僅需要μg 級(jí)單體化合物即可進(jìn)行潛在的活性篩選。

“分子靶向篩選+干細(xì)胞定向誘導(dǎo)模型”以啟動(dòng)子為篩選序列（靶點(diǎn)）進(jìn)行質(zhì)粒初篩，配合干細(xì)胞體外驗(yàn)證手段，觀察中藥單體化合物與干細(xì)胞共培養(yǎng)過程中，所表現(xiàn)出對某種病灶的修復(fù)傾向。根據(jù)顯示出可能潛在的相關(guān)活性，高效、明確地指向該中藥微量成分的藥效和機(jī)制，借以判斷單體化合物活性。其根本原理在于利用干細(xì)胞可塑性強(qiáng)、可分化成多種類型細(xì)胞的特質(zhì)。

干細(xì)胞具有分化能力恢復(fù)因病死亡的細(xì)胞，也具有旁分泌能力調(diào)節(jié)治療因病損傷的細(xì)胞，因此在再生治療方面有廣泛的應(yīng)用。干細(xì)胞的分化具有多能性。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的治療機(jī)制分為細(xì)胞分化和旁分泌作用，涵蓋面廣。針對細(xì)胞治療過程中特定的細(xì)胞，或者研究基礎(chǔ)較少、機(jī)制較不明確的生物標(biāo)志物，可以選取分化的目的細(xì)胞所特有的標(biāo)志物，來達(dá)到有的放矢的效果。這樣，根據(jù)研究目的而構(gòu)建的獨(dú)特細(xì)胞系，就可以使篩選的條件盡可能符合研究者想要的藥效。

該模型系首次將干細(xì)胞技術(shù)應(yīng)用于藥效篩選模型構(gòu)建；借以突破中藥微量成分藥效學(xué)檢測瓶頸，從種類多、含量低的化合物群中快捷確定活性單體化合物，為中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的發(fā)現(xiàn)和闡釋提供科學(xué)依據(jù)，為中藥微量成分的轉(zhuǎn)化和應(yīng)用提供廣闊前景。

1 再生醫(yī)學(xué)干細(xì)胞技術(shù)用于快速篩選中藥藥效成分背景

間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cell，MSC）廣泛存在于動(dòng)物成體結(jié)締組織和器官間質(zhì)中，根據(jù)來源主要有骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞等類型。MSC 易于分離培養(yǎng)，在體外可以向各種類型的細(xì)胞分化，可分化為中胚層細(xì)胞，如脂肪細(xì)胞、骨細(xì)胞和軟骨細(xì)胞；可分化成外胚層和內(nèi)胚層細(xì)胞，如皮膚、神經(jīng)細(xì)胞、肝細(xì)胞、胰腺胰島等，其表面標(biāo)志基因不盡相同。

本模型所用骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs），是來自SD大鼠成體的非造血干細(xì)胞，具自我更新和分化能力如：脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞[1]等，且簡便易得。我們以此為工具細(xì)胞，通過建立神經(jīng)保護(hù)單體化合物篩選或血管保護(hù)單體化合物模型，詳細(xì)闡釋“分子靶向篩選+干細(xì)胞定向誘導(dǎo)模型”的原理、建立方法和應(yīng)用。

研究發(fā)現(xiàn)，在體外特定培養(yǎng)條件下，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可向神經(jīng)干細(xì)胞、神經(jīng)元細(xì)胞及少突膠質(zhì)細(xì)胞等神經(jīng)樣細(xì)胞分化，為神經(jīng)損傷后的修復(fù)再生提供了有利支持。二甲基亞砜（DMSO）[2,3]、丁羥基茴香醚（BHA）[2,3]、β-巰基乙醇[4-6]、全反式維甲酸（RA）[2,7]、堿性成纖維細(xì)胞生長因子（bFGF）[8,9]等化合物或細(xì)胞因子均可誘導(dǎo)BMSCs 向神經(jīng)樣細(xì)胞分化，說明小分子化合物具備誘導(dǎo)BMSCs 向神經(jīng)樣細(xì)胞分化潛力[10,11]。也有研究發(fā)現(xiàn)，土木香內(nèi)酯、辛伐他汀等小分子化合物可以誘導(dǎo)BMSCs 向血管內(nèi)皮細(xì)胞分化的潛力[12,13]。本文的篩選模型旨在篩選和發(fā)現(xiàn)具有誘導(dǎo)分化神經(jīng)細(xì)胞或血管細(xì)胞的天然小分子化合物。

2 材料

2.1 細(xì)胞、藥物和試劑

HEK-293 細(xì)胞（來源于美國ATCC）；胎牛血清（Gibco，批號(hào)：1908121）；DMEM 低糖培養(yǎng)基（Hyclone，批號(hào)：J180003）；胰蛋白酶（Hyclone,批號(hào)：J180003）；鹽酸克倫特羅（aladdin，37148-27-9）；維甲酸（南京生利德生物科技，302-79-4）；白楊素（普思生物科技，480-40-0）；楊芽黃素（普思生物科技，520-28-5）；圓柚酮（成都嘉葉生物科技，4674-50-4）；PCR 擴(kuò)增試劑盒，Lipofectamine?2000（Thermo Fisher，11668019）；兔抗神經(jīng)生長因子（Beyotime，AF1411）；兔抗半乳糖神經(jīng)酰胺（Solarbio，K003717P）；兔抗波形蛋白(Beyotime，AF1975）；兔抗巢蛋白（Beyotime，AF2215）；兔抗神經(jīng)元特異性烯醇化酶（Beyotime，AF2164）、Total RNA Isolation Kit、二步法RT-PCR 試劑盒（成都福際生物技術(shù)有限公司，RE-03113）。

2.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF 級(jí)2-4 周齡雄性SD 大鼠2 只（由成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供），平均體質(zhì)量為120-140 g，用于制備骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。

3 “分子靶向篩選+干細(xì)胞定向誘導(dǎo)模型”藥物篩選模型的構(gòu)建

該模型分為兩部分：分子靶向的高通量篩選、干細(xì)胞定向誘導(dǎo)驗(yàn)證。利用干細(xì)胞可塑性強(qiáng)且可分化成多種類型細(xì)胞的特質(zhì)，結(jié)合干細(xì)胞在單體化合物給藥后的分化趨向和旁分泌作用，高效、快速判斷中藥微量成分可能具有的活性和機(jī)制。

3.1 分子靶向的高通量篩選

作為神經(jīng)細(xì)胞或血管內(nèi)皮細(xì)胞生長的標(biāo)志性基因，神經(jīng)生長因子（NGF）或血管生長因子（VEGF）的轉(zhuǎn)錄水平，可表明對神經(jīng)或血管的修復(fù)作用；“分子靶向篩選”是以VEGF 或NGF 啟動(dòng)子為篩選序列（靶點(diǎn)）進(jìn)行質(zhì)粒初篩，將是否促進(jìn)干細(xì)胞啟動(dòng)VEGF 或NGF 基因的轉(zhuǎn)錄，作為初步判斷單體化合物是否具有神經(jīng)或血管保護(hù)作用的依據(jù)。

（1）分別克隆神經(jīng)元的保護(hù)/再生及血管新生的主要功能基因NGF、VEGF的啟動(dòng)子片段，各自與紅色熒光蛋白（E2）或者熒光素酶（Luc）表達(dá)基因片段整合，后接報(bào)告基因，構(gòu)建能定性和定量評估這兩個(gè)基因啟動(dòng)子功能的質(zhì)粒；

（2）使用Lipofectamine?2000，將含有NGF、VEGF啟動(dòng)子的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK-293細(xì)胞，建立穩(wěn)定的單克隆細(xì)胞株，形成具有神經(jīng)或血管保護(hù)的單體化合物高通量篩選體系（圖1），完成前部分“分子靶向篩選”質(zhì)粒模型構(gòu)建。

圖1 NGF/VEGF高通量篩選模型的構(gòu)建

圖1 紅色熒光顯示，以鹽酸克倫特羅（CLE）為陽性藥物進(jìn)行刺激，質(zhì)粒中的紅色熒光蛋白（E2）被啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄，確認(rèn)該高通量篩選體系構(gòu)建成功。有報(bào)道顯示[14]，對于神經(jīng)興奮毒素紅藻氨酸誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡模型中，定量PCR等方法顯示鹽酸克倫特羅可以上調(diào)NGF的轉(zhuǎn)錄水平，從而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。由于腦缺血的過程中由于缺血、缺氧等，也伴隨著神經(jīng)細(xì)胞的死亡，因此鹽酸克倫特羅能夠較好的作為腦缺血神經(jīng)保護(hù)的陽性藥物使用，一定程度上反映出細(xì)胞模型的準(zhǔn)確性。

質(zhì)粒中的熒光素酶被啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄的情況（表1）?？瞻捉M為未轉(zhuǎn)入質(zhì)粒的HEK293細(xì)胞。對照組組為轉(zhuǎn)入含有相應(yīng)啟動(dòng)子和熒光素酶基因的質(zhì)粒。相對熒光素酶單位的結(jié)果對比顯示，該質(zhì)粒被成功轉(zhuǎn)入細(xì)胞模型。CLE 組為加入鹽酸克倫特羅（CLE）后的熒光強(qiáng)度，是對照組的156%，顯示明顯的提高。

當(dāng)待測藥物處理使啟動(dòng)子被激活時(shí)，則啟動(dòng)紅色熒光蛋白表達(dá)或者熒光素酶活性提高，借以快速直觀反映單體化合物潛在的神經(jīng)或血管保護(hù)活性。

3.2 干細(xì)胞定向誘導(dǎo)驗(yàn)證模型

將3.1“分子靶向篩選”顯陽性的單體化合物，與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）共培養(yǎng)，檢測BMSCs 上標(biāo)志基因NGF 和VEGF 轉(zhuǎn)錄，推測單體是否潛在的神經(jīng)或血管保護(hù)活性；當(dāng)然，單體化合物也可能具有誘導(dǎo)BMSCs 分泌治療因子作用，但無論是單體化合物的直接誘導(dǎo)分化，還是促進(jìn)相關(guān)因子分泌，均顯示該單體化合物具潛在神經(jīng)保護(hù)或血管保護(hù)活性。

上述兩部分整合，即為“分子靶向篩選+干細(xì)胞定向誘導(dǎo)模型”，可用于中藥微量單體（微克級(jí)）篩選，并同時(shí)準(zhǔn)確指向單體化合物的藥效作用及潛在機(jī)制。

表1 轉(zhuǎn)入NGF啟動(dòng)子質(zhì)粒的HEK293細(xì)胞受CLE誘導(dǎo)熒光素酶的變化

我們建立的神經(jīng)保護(hù)/再生“分子靶向篩選+干細(xì)胞定向誘導(dǎo)”模型，其機(jī)理在于：神經(jīng)生長因子（NGF）、干細(xì)胞、小分子藥物等都是[15]促使神經(jīng)功能再生[16]的重要因素，NGF能促進(jìn)突觸和軸突重塑及定向再生，通過藥物誘導(dǎo)機(jī)體干細(xì)胞分化或分泌，補(bǔ)充NGF，使之與靶細(xì)胞形成功能連接，達(dá)到修復(fù)受損神經(jīng)細(xì)胞、改善神經(jīng)功能缺損癥狀的目的[17,18]。

據(jù)報(bào)道，目前將成纖維細(xì)胞逆分化為多能干細(xì)胞，并誘導(dǎo)成神經(jīng)細(xì)胞，并檢測到神經(jīng)分化相關(guān)的指標(biāo)等的重大發(fā)現(xiàn)[19]，均系采用多種體內(nèi)已知的、活性明確的化合物聯(lián)合誘導(dǎo)所得；而本課題組則是首次單獨(dú)采用來源于中藥的單一天然小分子化合物進(jìn)行大鼠BMSCs誘導(dǎo)，并檢測到神經(jīng)分化相關(guān)指標(biāo)等，具有重大的意義；也是首次將干細(xì)胞作為模式細(xì)胞運(yùn)用于中藥單體化合物活性篩選。這可為如何從含有化合物種類多、含量低但臨床療效確切的中藥中尋找活性成分，闡釋中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)提供新方法和新思路，為中藥藥理學(xué)和中藥質(zhì)量控制研究提供新借鑒。

4 采用“分子靶向篩選+干細(xì)胞定向誘導(dǎo)模型”篩選中藥神經(jīng)保護(hù)成分的實(shí)例

我們以中藥益智為例，展示如何構(gòu)建神經(jīng)保護(hù)活性的“分子靶向篩選+干細(xì)胞定向誘導(dǎo)模型”，對益智的3個(gè)黃酮類成分進(jìn)行抗神經(jīng)損傷化學(xué)成分的篩選。

圖2 益智仁中3個(gè)中藥單體誘導(dǎo)bMSC基因轉(zhuǎn)錄強(qiáng)度的定量RCR檢測

表2 使用NGF啟動(dòng)子篩選體系檢測得到三種化合物和對照組相比相對熒光強(qiáng)度

4.1 實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果

4.1.1 NGF高通量模型的構(gòu)建

HEK-293 細(xì)胞（人胚腎上皮細(xì)胞）是真核蛋白表達(dá)常用的細(xì)胞之一，它具有以下優(yōu)勢：更快的生長速度，更高的生長密度、轉(zhuǎn)染效率和外源蛋白表達(dá)量。因此，廣泛應(yīng)用于外源性基因轉(zhuǎn)染的載體，以及蛋白表達(dá)體系的構(gòu)建等。通過lipo2000 將構(gòu)建成功的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進(jìn)入HEK-293 細(xì)胞，成功構(gòu)建穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株（圖1）。當(dāng)啟動(dòng)子被激活，可促進(jìn)熒光素酶基因的轉(zhuǎn)錄并提高其蛋白的表達(dá)，通過檢測熒光素酶的活性來直觀快速顯示單體化合物是否可能具有神經(jīng)或血管保護(hù)活性。

4.1.2 具有上調(diào)NGF作用的中藥單體化合物的篩選

針對益智仁的3個(gè)黃酮類單體化合物（白楊素、楊芽黃素和圓柚酮），以維甲酸（RA）為對照，采用前述分子靶向篩選高通量模型，測試各單體是否具有刺激細(xì)胞模型中NGF啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄作用。3個(gè)被測單體化合物的熒光素酶表達(dá)強(qiáng)度均高于對照品維甲酸，且圓柚酮的表達(dá)量最強(qiáng)（表2）。

4.1.3 單體對BMSCs神經(jīng)樣細(xì)胞分化的誘導(dǎo)

為進(jìn)一步驗(yàn)證單體化合物活性，以10 μmol·L-1的濃度，將各單體分別與BMSCs 共培養(yǎng)1-7 d，測定其基因轉(zhuǎn)錄水平，觀察是否具有神經(jīng)樣或血管內(nèi)皮樣細(xì)胞分化的潛力。經(jīng)3 個(gè)單體化合物的誘導(dǎo)培養(yǎng)，BMSCs表面的5個(gè)神經(jīng)細(xì)胞標(biāo)志蛋白：神經(jīng)生長因子（NGF）、半乳糖神經(jīng)酰胺（GalC）、巢蛋白（Nestin）、神經(jīng)元特異烯醇化酶（NSE）、波形蛋白（Vimenti）所對應(yīng)的基因轉(zhuǎn)錄明顯上調(diào)，說明BMSCs 經(jīng)過藥物誘導(dǎo)后，具有向神經(jīng)樣細(xì)胞分化的作用，推測該3個(gè)單體化合物白楊素、楊芽黃素和圓柚酮可能具有神經(jīng)保護(hù)活性（圖2）。

本實(shí)驗(yàn)設(shè)3種單體化合物實(shí)驗(yàn)組（白楊素、楊芽黃素和圓柚酮組），陽性對照（維甲酸組），陰性對照（DMSO 組），用各單體化合物處理BMSCs，檢測在BMSCs細(xì)胞表面前述5種標(biāo)志基因的mRNA轉(zhuǎn)錄水平變化。將陰性組（DMSO）的基因轉(zhuǎn)錄情況視為1，其他的每組轉(zhuǎn)錄情況除以陰性組轉(zhuǎn)錄情況，計(jì)算得到各組的相對轉(zhuǎn)錄強(qiáng)度。

由圖2 數(shù)據(jù)可見：各組與陽性對照維甲酸RA 相比，誘導(dǎo)趨勢基本一致；第3 天，各實(shí)驗(yàn)組誘導(dǎo)BMSCs產(chǎn)生NSE基因相對轉(zhuǎn)錄水平均達(dá)峰值；第5天，白楊素（chrysin）組產(chǎn)生的NGF、Nestin和Vimentin基因轉(zhuǎn)錄水平均達(dá)峰值，GalC 則在第7 天達(dá)峰值；楊芽黃素（tectochrysin）組各基因轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)量幾乎都弱于對照維甲酸RA。本數(shù)據(jù)作為基因轉(zhuǎn)錄水平，反映了細(xì)胞內(nèi)對應(yīng)的神經(jīng)相關(guān)mRNA 的轉(zhuǎn)錄效率，對應(yīng)當(dāng)天該蛋白增加的情況。對于NGF、NSE、Vimentin 來說，若3 d已經(jīng)合成了足夠多的蛋白并在細(xì)胞內(nèi)積累達(dá)到飽和，則不需要繼續(xù)保持高轉(zhuǎn)錄強(qiáng)度，也能發(fā)揮該蛋白的功能。因此部分基因在5 d或者7 d后相對轉(zhuǎn)錄水平發(fā)生下降。數(shù)據(jù)顯示BMSCs 在受到白楊素、圓柚酮干預(yù)后，神經(jīng)細(xì)胞特征性和分化相關(guān)的多種基因轉(zhuǎn)錄水平均發(fā)生了上調(diào)，推測兩種單體化合物白楊素、圓柚酮具有提高BMSCs中某些神經(jīng)細(xì)胞分化基因的轉(zhuǎn)錄水平、促進(jìn)神經(jīng)分化的生物活性，是益智仁發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)組成部分。

4.1.4 單體化合物的體內(nèi)藥效學(xué)驗(yàn)證

針對單味中藥和復(fù)方成藥中的神經(jīng)保護(hù)活性成分，我們采用“分子靶向篩選+干細(xì)胞定向誘導(dǎo)模型”，各自進(jìn)行相應(yīng)單體化合物篩選，然后，逐一進(jìn)行體內(nèi)藥效實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

（1）單味中藥的神經(jīng)保護(hù)單體化合物驗(yàn)證

從中藥益智仁中，篩選出2 個(gè)具神經(jīng)保護(hù)作用單體，依次為白楊素、圓柚酮。為驗(yàn)證體內(nèi)藥效，課題組采用腦缺血-再灌注模型體內(nèi)藥效實(shí)驗(yàn)，進(jìn)行了白楊素對腦缺血-在灌注損傷神經(jīng)保護(hù)作用和機(jī)制的相關(guān)研究驗(yàn)證，詳見本刊“白楊素對腦缺血-再灌注損傷的神經(jīng)保護(hù)機(jī)制研究”一文。通過建立腦缺血-再灌注大鼠模型考察了不同劑量白楊素給藥組神經(jīng)功能評分、腦梗死體積、腦含水量的變化，結(jié)果顯示白楊素具有減輕缺血-再灌注損傷中神經(jīng)損傷的作用，同時(shí)對各組腦缺血半暗帶進(jìn)行組織學(xué)染色，觀察到給藥后組織空泡減少，聯(lián)系緊密，病變減輕。綜上所述，體內(nèi)藥效實(shí)驗(yàn)證實(shí)：白楊素通過上調(diào)腦缺血-再灌注損傷組織部位中NGF 和BDNF 蛋白表達(dá)，促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞的再生，減輕神經(jīng)損傷癥狀，發(fā)揮治療神經(jīng)元損傷的作用。

（2）經(jīng)典成方十五味木香丸神經(jīng)保護(hù)活性成分驗(yàn)證

針對臨床應(yīng)用廣泛的藏藥經(jīng)典名方，我們追蹤到病人入血成分之一，一種倍半萜內(nèi)酯類化合物--木香烴內(nèi)酯（costunolide）。以木香烴內(nèi)酯為誘導(dǎo)劑，用“分子靶向篩選+干細(xì)胞定向誘導(dǎo)模型”體外檢測出其對BMSCs 向神經(jīng)樣細(xì)胞分化的誘導(dǎo)作用，用腦缺血-再灌注損傷大鼠模型體內(nèi)驗(yàn)證其神經(jīng)保護(hù)藥效，詳見本刊“木香烴內(nèi)酯誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞用于腦缺血再灌注損傷治療”一文，也與臨床療效和文獻(xiàn)報(bào)道[20]不謀而合；

（3）經(jīng)典名方如意珍寶丸神經(jīng)保護(hù)活性成分驗(yàn)證

我們對中動(dòng)脈阻斷缺血大鼠進(jìn)行藏藥名方灌胃給藥，采用HPLC進(jìn)行口服給藥前后血液成分對比，追蹤到血清中兩種含量較大的單體成分鞣花酸（ellagic）和木犀草素（luteolin），將2種單體化合物加入至E2高通量篩選模型中，均可上調(diào)HEK-293 細(xì)胞中的E2 熒光素酶表達(dá)，顯示具神經(jīng)保護(hù)作用；又與BMSCs 共培養(yǎng)后，經(jīng)誘導(dǎo)后的BMSCs顯著性地上調(diào)了神經(jīng)細(xì)胞的標(biāo)志性基因的轉(zhuǎn)錄水平，說明單體鞣花酸和木犀草素可誘導(dǎo)BMSCs 向神經(jīng)樣細(xì)胞分化或具有神經(jīng)保護(hù)樣作用。最后，進(jìn)行體內(nèi)神經(jīng)保護(hù)藥效實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，單體鞣花酸和木犀草素均能顯著減少缺血再灌注引起的腦組織梗死體積（TTC染色），減輕腦水腫率，保持組織結(jié)構(gòu)完整（H&E 染色），顯著性的減少損傷部位細(xì)胞凋亡，從而降低神經(jīng)元損傷，證實(shí)了從藏藥名方如意珍寶丸中提取得到的單體鞣花酸、木犀草素能減輕腦缺血損傷癥狀，具有神經(jīng)保護(hù)活性[21-23]。

綜上所述，運(yùn)用“分子靶向篩選+干細(xì)胞定向誘導(dǎo)模型”篩選，可對單味中藥和復(fù)方成藥中的微量單體化合物進(jìn)行活性篩選，且結(jié)果均準(zhǔn)確、可靠。

5 結(jié)論

我們以質(zhì)粒初篩配合干細(xì)胞體外誘導(dǎo)，建立“分子靶向篩選+干細(xì)胞定向誘導(dǎo)模型”，快速發(fā)現(xiàn)中藥單味藥和復(fù)方中潛在的神經(jīng)保護(hù)或血管修復(fù)活性成分，該微量成分活性篩選方法，簡潔、快速，具有較好準(zhǔn)確性和可靠性；由于時(shí)間有限，我們僅僅進(jìn)行了神經(jīng)保護(hù)/血管保護(hù)活性的模型構(gòu)建，即：以NGF 啟動(dòng)子質(zhì)粒模型結(jié)合BMSCs 共培養(yǎng)，檢測5 種神經(jīng)標(biāo)志基因用于神經(jīng)保護(hù)活性單體的篩選；和通過VEGF 啟動(dòng)子質(zhì)粒模型結(jié)合BMSCs 共培養(yǎng)，檢測3 種血管標(biāo)志基因用于血管保護(hù)活性單體的發(fā)現(xiàn)（數(shù)據(jù)已發(fā)表[23]），另外，關(guān)于肝臟、腎臟保護(hù)修復(fù)其他活性單體篩選模型和驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)正在進(jìn)行。

值得一提的是，神經(jīng)損傷和血管損傷為腦缺血兩個(gè)主要要素，采用我們的“分子靶向篩選+干細(xì)胞定向誘導(dǎo)模型”，配合體內(nèi)中動(dòng)脈阻斷-再灌注經(jīng)典模型藥效實(shí)驗(yàn)，為尋找新的抗腦缺血候選藥物分子提供新思路和新工具。

6 討論

傳統(tǒng)單體化合物活性篩選方式多以模型細(xì)胞的存活率作為藥物活性的評判標(biāo)準(zhǔn)（如MTT，CCK8），其優(yōu)勢為通過給藥濃度與細(xì)胞生存率等直觀指標(biāo)，快速判斷單體化合物活性，但若需明確作用靶點(diǎn)及機(jī)制，則必須進(jìn)行體內(nèi)藥效實(shí)驗(yàn)研究，單體消耗量大、作用靶點(diǎn)難以明確。

圖3 來自三個(gè)藏藥的17個(gè)小分子化合物對NGF基因表達(dá)的影響

此外，亦有利用親和色譜法通過單體化合物與作用靶點(diǎn)的特異性吸附，對與靶點(diǎn)相結(jié)合的藥物進(jìn)行洗脫、鑒定是目前篩選微量活性化合物的熱點(diǎn)方案，相對于傳統(tǒng)藥物篩選模式具有一定優(yōu)勢，但僅能鎖定對作用靶點(diǎn)具特異性靶向作用的單體化合物，若系因調(diào)節(jié)其他生物因子間接起效的單體分子，則會(huì)漏篩，而且可與靶點(diǎn)結(jié)合的小分子不一定都是活性成分，可能并不引起下游生物通路的改變，甚至起到相反抑制作用。因此，該方法實(shí)質(zhì)上并未完全突破中藥微量成分活性研究瓶頸，其準(zhǔn)確性和效率有待提高。

以單基因作為指標(biāo)進(jìn)行篩選的模型，多以靶基因調(diào)控序列中特定轉(zhuǎn)錄因子或受體的結(jié)合位點(diǎn)為靶點(diǎn)，靶點(diǎn)單一、篩選得到僅針對單結(jié)合位點(diǎn)的活性成分。而基因啟動(dòng)子序列中往往含多個(gè)、多種不同調(diào)控因子的結(jié)合位點(diǎn)，故本文模型前部分以啟動(dòng)子為篩選序列（靶點(diǎn)），有望獲得影響該基因表達(dá)大類成分，擴(kuò)大了篩選范圍，后利用干細(xì)胞可塑性強(qiáng)、可分化成多種類型細(xì)胞的特質(zhì)，測定干細(xì)胞表面表達(dá)的特定標(biāo)志基因，借以高效、快速判斷微量單體化合物活性和可能機(jī)制。該方法相對傳統(tǒng)方法具有可篩選范圍廣、效率高、準(zhǔn)確性高的優(yōu)勢。例如本課題組對來自三個(gè)藏藥（如意珍寶丸、二十味沉香丸、二十五味珊瑚丸）的17種小分子化合物使用NGF-293 細(xì)胞模型進(jìn)行篩選。這17 種化合物覆蓋了黃酮類，萜類，苯丙素類、胡蘿卜素類等多種類別。結(jié)果顯示，其中有3種化合物（分別為1種黃酮類、2 種萜類）對NGF 啟動(dòng)子有較為明顯的上調(diào)作用（圖3）。進(jìn)一步使用干細(xì)胞研究的結(jié)果（圖4），1和16兩種化合物對bMSC細(xì)胞中NGF啟動(dòng)子有較好的上調(diào)作用[24]。這證明了本篩選體系在待測化合物較多的時(shí)候仍然能有保持較高的效率，并可以驗(yàn)證得到有促進(jìn)神經(jīng)相關(guān)因子分泌提高的化合物。此外，本課題組針對VEGF 也建立了不同的藥物篩選干細(xì)胞模型，檢測了木香烴內(nèi)酯、芒果苷等4 種化合物對VEGF-293 細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄激活作用，以及對bMSC 中CD31、α-SMA 等與血管再生有關(guān)的基因轉(zhuǎn)錄水平[25]。同時(shí)，本研究在體外建立了基于干細(xì)胞技術(shù)的藥物篩選模型。首次發(fā)現(xiàn)，在中藥單一天然小分子誘導(dǎo)下，大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可向神經(jīng)細(xì)胞分化，并轉(zhuǎn)錄了與神經(jīng)干細(xì)胞、神經(jīng)元、少突膠質(zhì)細(xì)胞等分化相關(guān)的基因。這不僅為神經(jīng)損傷后修復(fù)以及再生提供了有利的證據(jù)，有助于含量低的中藥化學(xué)成分生物活性的發(fā)現(xiàn)，也可以通過干細(xì)胞的多能性、選擇性，為中藥微量成分的臨床應(yīng)用和干細(xì)胞移植提供參考。

面對現(xiàn)今中藥藥效物質(zhì)不明確、指標(biāo)性成分和藥效關(guān)聯(lián)性不強(qiáng)、少數(shù)指標(biāo)成分的含量測定無法控制整體質(zhì)量等關(guān)鍵問題，本技術(shù)有助于發(fā)現(xiàn)更多來自中藥的小分子活性化合物，強(qiáng)化整體控制、多成分控制、特征專屬性控制，為完善中藥質(zhì)量評價(jià)模式、提高中藥標(biāo)準(zhǔn)水平、闡釋中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，提供了具有原創(chuàng)性和實(shí)用性的研究思路和方法體系。

圖4 來自三個(gè)藏藥的兩個(gè)化合物對bMSC細(xì)胞NGF基因轉(zhuǎn)錄水平的影響