韓國(guó)赤芝全基因組重測(cè)序分析＊

朱風(fēng)麗，徐曉蘭，陳體強(qiáng)，石林春，繆曉青＊＊，蘭 進(jìn)

（1.福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院 福州 350002；2.福建農(nóng)林大學(xué)蜂學(xué)學(xué)院 福州 350002；4.中國(guó)醫(yī)3.學(xué)?？平▽W(xué)省院農(nóng)北業(yè)京科協(xié)學(xué)和院醫(yī)食學(xué)用院菌藥研用究植所物 研福究州所3 5北0 0京1 4 ；1 00193）

靈芝（Ganoderma）也被稱為“不朽的蘑菇”、“傳統(tǒng)中藥的象征”，是著名的藥用真菌之一?！吨腥A人民共和國(guó)藥典》（2015 年版）中收錄赤芝（Ganoderma lucidum）和紫芝（G.sinense）為靈芝的藥材來源。靈芝能夠產(chǎn)生大量的生物活性物質(zhì)，現(xiàn)有400多種化合物被鑒定，主要是三萜和多糖類物質(zhì)。靈芝種類較多，栽培種主要為赤芝[1]。近年來，由于野生靈芝資源的破壞較為嚴(yán)重，使得具有重要藥用價(jià)值的野生靈芝種質(zhì)資源瀕臨滅絕。我國(guó)靈芝的主栽品種部分來自韓國(guó)和日本等地，由于與引進(jìn)品種產(chǎn)地的氣候環(huán)境相差較大，菌種的長(zhǎng)時(shí)間栽培導(dǎo)致品種衰退，出現(xiàn)產(chǎn)量下降、品質(zhì)降低、抗病蟲及雜菌能力較差等缺點(diǎn)。因此應(yīng)大力推動(dòng)自主選育的適于我國(guó)生長(zhǎng)的優(yōu)良品種[2]。目前選育技術(shù)方法傳統(tǒng)、育種周期長(zhǎng)、遺傳改良效率偏低。2011年，赤芝CGMCC5.0026 基因組測(cè)序的完成推進(jìn)了赤芝基因組學(xué)的研究進(jìn)程[3]，使赤芝在基因組范圍內(nèi)進(jìn)行遺傳分析成為可能，為分子標(biāo)記輔助育種提供技術(shù)手段，這為赤芝新品種的選育打下基礎(chǔ)。

近年來，隨著測(cè)序技術(shù)的發(fā)展及許多物種基因組測(cè)序的不斷完成，重測(cè)序技術(shù)也得到了廣范的應(yīng)用，利用全基因組重測(cè)序技術(shù)可以在全基因組范圍內(nèi)挖掘單核苷酸多態(tài)性（SNP）、插入缺失標(biāo)記（InDel）、結(jié)構(gòu)變異（SV）和基因拷貝數(shù)變異（CNV），并廣泛應(yīng)用于變異檢測(cè)、遺傳圖譜構(gòu)建、性狀定位和群體進(jìn)化研究等[4]。Shin 等[5]將韓牛重測(cè)序數(shù)據(jù)分別與UMD 3.1 和Btau 4.6.1兩個(gè)牛的參考基因組進(jìn)行比對(duì)，分別發(fā)現(xiàn)了46 301和28 613 個(gè)SNP，這些SNP 是韓牛特有的可能與產(chǎn)奶機(jī)制、多汁性以及黃色的牛毛有關(guān)，同時(shí)發(fā)現(xiàn)了大多數(shù)的SNP 位于啟動(dòng)子區(qū)域，這表明SNP 調(diào)控了與性狀相關(guān)基因的表達(dá)。Zhang 等人[6]通過全基因組重測(cè)序技術(shù)，將芥菜中與花色相關(guān)的基因BjPC2 定位到了染色體B04 上。Varshney 等人[7]將包含選育品系、地方品種、野生種等在內(nèi)的292種木豆進(jìn)行基因組重測(cè)序，在基因組上發(fā)現(xiàn)了幾個(gè)可能與馴化、育種相關(guān)的區(qū)域。并通過基因組關(guān)聯(lián)分析，確定了一些后選基因與農(nóng)藝重要性狀之間的相關(guān)性。Lee 等人[8]將起源于韓國(guó)的早花大豆突變株系進(jìn)行全基因組重測(cè)序共篩選出了30個(gè)與開花相關(guān)的SNPs和25個(gè)Indels。

為了研究韓國(guó)赤芝菌株的基因組序列情況，應(yīng)用二代測(cè)序的方法對(duì)韓國(guó)赤芝菌株進(jìn)行了全基因組重測(cè)序。本文將韓國(guó)赤芝基因組重測(cè)序數(shù)據(jù)與赤芝CGMCC5.0026（參考基因組）進(jìn)行比較以揭示其在SNP、InDel、SV存在的變異，旨在發(fā)現(xiàn)韓國(guó)赤芝菌株特有的序列特征，為研究不同來源的菌株之間的差異提供數(shù)據(jù)。并且初步探索了與菌絲生長(zhǎng)速度和靈芝三萜合成相關(guān)的基因變異，為赤芝的分子標(biāo)記育種及完善藥用真菌模式體系提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

赤芝CGMCC5.0026[3]保存于本實(shí)驗(yàn)室，韓國(guó)赤芝（韓芝）由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所蘭進(jìn)教授饋贈(zèng)。兩種菌株均為二倍體。

1.2 方法

1.2.1 赤芝菌絲的生物量

將2 個(gè)赤芝菌株在28℃恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行活化，將活化好的菌株轉(zhuǎn)接至PDA培養(yǎng)基中，當(dāng)菌絲生長(zhǎng)至直徑為5-6 cm 時(shí)，用打孔器在菌絲邊緣處打孔，并將10個(gè)直徑為1 cm的菌絲塊轉(zhuǎn)接至PDA液體培養(yǎng)基中，28℃，180 rpm黑暗下培養(yǎng)8 d，然后用超純水沖洗至洗脫液為無色。45℃烘干至恒重。每個(gè)實(shí)驗(yàn)平行3次。

1.2.2 靈芝三萜含量的測(cè)定

菌絲的PDA 液體培養(yǎng)方法同“1.2.1”項(xiàng)下。將清洗干凈的菌絲液氮研磨成細(xì)粉后烘干至恒重。根據(jù)實(shí)驗(yàn)室前期得到的提取靈芝三萜的條件，采用香草醛-高氯酸顯色法測(cè)定靈芝三萜含量。稱取0.05 g左右干燥的靈芝菌絲細(xì)粉，加入3 mL 80%的乙醇浸提4 h，然后在溫度為60℃下超聲提取20 min。將提取液定容至10 mL，取1 mL 水浴揮干后加入0.2 mL 5%的香草醛-冰醋酸和0.8 mL的高氯酸溶液，70℃水浴15 min，冷卻至室溫，最后加入4 mL 的冰醋酸，搖勻后在560 nm 處測(cè)定吸光度值。

1.2.3 韓芝的全基因組重測(cè)序

用植物基因組DNA 提取試劑盒（天根生化科技（北京）有限公司）進(jìn)行DNA的提取。將提取的質(zhì)量較好的DNA 送至北京百邁客生物科技有限公司進(jìn)行全基因組重測(cè)序。首先對(duì)提取的基因組DNA進(jìn)行檢測(cè)，合格后用超聲波法將DNA 片段化，然后將片段化的DNA 進(jìn)行片段純化、末端修復(fù)、3'端加A、連接測(cè)序接頭，然后用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行片段大小選擇，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增以形成測(cè)序文庫，建好的文庫先進(jìn)行文庫質(zhì)檢，質(zhì)檢合格的文庫用Xten進(jìn)行測(cè)序。對(duì)測(cè)序得到的原始reads(雙端序列)進(jìn)行質(zhì)量評(píng)估，并過濾得到Clean Reads，用于后續(xù)生物信息學(xué)分析。用bwa 軟件[9]將Clean Reads 與參考基因組序列進(jìn)行比對(duì)，基于比對(duì)結(jié)果進(jìn)行SNP、Small InDel、SV 的檢測(cè)和注釋，并對(duì)DNA水平差異基因進(jìn)行挖掘與注釋分析。

1.2.4 韓芝與赤芝CGMCC5.0026 基因組間變異的檢測(cè)與注釋

根據(jù)韓芝的Clean Reads 在赤芝CGMCC5.0026 基因組[3]上的定位結(jié)果，用GATK 軟件工具包[10]進(jìn)行SNP和Small InDel 的檢測(cè)，其中SNP 的檢測(cè)是根據(jù)Clean Reads 在參考基因組的定位結(jié)果，使用Picard（http://sourceforge.net/projects/picard/.(Picard)）進(jìn) 行 去 重 復(fù)（Mark Duplicates）、GATK 進(jìn) 行 局 部 重 比 對(duì)（Local Realignment）、堿基質(zhì)量值校正（Base Recalibration）等預(yù)處理，以保證檢測(cè)得到的SNP準(zhǔn)確性，再使用GATK進(jìn)行SNP的檢測(cè)，過濾，并得到最終的SNP位點(diǎn)集。并用SnpEff 軟件[11]進(jìn)行SNP 和Small InDel 變異的注釋與預(yù)測(cè)。使用breakDancer 檢測(cè)SV變異，并對(duì)SV進(jìn)行注釋。

1.2.5 DNA水平變異基因的挖掘與功能注釋

尋找韓國(guó)赤芝與赤芝CGMCC5.0026 間發(fā)生的非同義突變SNP、CDS區(qū)發(fā)生的InDel與SV的基因，將這些變異基因通過BLAST[12]與NR[13]、SwissProt[13]、GO[14]、COG[15]、KEGG[16]功能數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)，并對(duì)這些基因的功能進(jìn)行注釋。

1.2.6 RT-PCR檢測(cè)

將“1.2.1”中培養(yǎng)的菌絲使用TranZol UP（北京全式金）提取RNA，然后用TaKaRa PrimeScript TM RT reagent Kit with gDNA Eraser Kit（購自TaKaRa）反轉(zhuǎn)錄成cDNA。根據(jù)靈芝全基因組測(cè)序的結(jié)果，找出本實(shí)驗(yàn)中注釋到的9 個(gè)與生長(zhǎng)相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子的CDS 序列，使用Primer premier 5 軟件設(shè)計(jì)引物，引物序列（表1），以靈芝菌絲cDNA 為模板，用SYBR?Premix Ex Taq TM Ⅱ（Tli RNaseH Plus）（購自TakaRa）進(jìn)行PCR。反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性30 s，94℃變性5 s，60℃退火30 s，共40個(gè)循環(huán)。熒光定量用甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GPD）作為內(nèi)參基因，基因的相對(duì)表達(dá)量用2-ΔΔCT計(jì)算。

表1 RT-PCR引物序列

圖1 兩種菌絲的生物量

圖2 兩種菌絲的三萜含量

1.2.7 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)分析使用SPSS17.0，顯著性分析采用單因素方差分析和多重比較。P ＜0.05為差異性顯著，P ＜0.01為差異性極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 兩種赤芝菌株的菌絲生物量

液體搖培8 天后，兩種赤芝的菌絲干重（圖1）所示，赤芝CGMCC5.0026 的菌絲干重為0.51 g 是韓芝的1.97倍，并在統(tǒng)計(jì)學(xué)上表現(xiàn)為顯著性差異。

2.2 三萜含量的比較

對(duì)赤芝CGMCC5.0026 和韓芝菌絲的三萜含量進(jìn)行比較，結(jié)果表明（圖2），韓芝菌絲的三萜含量為20.00 mg·g-1是赤芝CGMCC5.0026的1.30倍，在統(tǒng)計(jì)學(xué)表現(xiàn)為極顯著差異。

2.3 韓芝的全基因組重測(cè)序

對(duì)重測(cè)序的Q30、GC 含量、與參考基因組的比對(duì)率、平均覆蓋深度進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，其統(tǒng)計(jì)結(jié)果（表2）。得到的reads 數(shù)目有7 679 704 個(gè)，將重測(cè)序結(jié)果與赤芝CGMCC5.0026基因組比較，發(fā)現(xiàn)與參考基因組的匹配率為87.79%，測(cè)序深度為44倍。

2.4 韓芝SNP的檢測(cè)與注釋

韓芝的SNP 檢測(cè)結(jié)果表明，總共檢測(cè)到的SNP 數(shù)量為291212 個(gè)，其中SNP 的Ti/Tv（轉(zhuǎn)換/顛換）的比值為2.81，其中雜合類型的SNP比例為62.87%。SNP變異的基因數(shù)量為13 914，占靈芝預(yù)測(cè)總基因的86.35%。對(duì)SNP的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行注釋，發(fā)現(xiàn)，SNP的變異主要發(fā)生在CDS區(qū)（37.04%），在CDS區(qū)中主要的突變類型為同義編碼突變（58.57%）和非同義編碼突變（40.53%）（表3）。

2.5 韓芝的Small InDel檢測(cè)與注釋

根據(jù)樣品的Clean Reads 在參考基因組上的定位結(jié)果，檢測(cè)韓芝與參考基因組間在CDS區(qū)的Small InDel變異，其變異總數(shù)為9 458個(gè)（表4）。根據(jù)檢測(cè)得到的Small InDel 位點(diǎn)在參考基因組上的位置信息，對(duì)比參考基因組的基因、CDS 位置等信息，對(duì)InDel 位點(diǎn)進(jìn)行功能或類型的分類，結(jié)果（表5）所示。從表中可以看出，InDel 變異多發(fā)生在基因的上游（37.31%）、下游（33.43%）區(qū)域和CDS 區(qū)域（12.71%），在CDS 區(qū)中，發(fā)生的變異大多為移碼突變（50.58%）。

2.6 韓芝的SV的檢測(cè)與注釋

使用breakDancer 對(duì)SV 進(jìn)行檢測(cè)的結(jié)果表明，韓芝的結(jié)構(gòu)變異總數(shù)為3925，其中，變異最多的為缺失類型變異，其數(shù)量為1437（表6）。根據(jù)檢測(cè)到的SV變異在參考基因組上的位置信息，對(duì)比參考基因組的基

因、CDS位置等信息，對(duì)韓芝SV變異進(jìn)行位置的注釋，并對(duì)缺失（DEL）、插入（INS）、反轉(zhuǎn)（INV）三種類型的結(jié)構(gòu)變異進(jìn)行注釋，其結(jié)果（表7）所示，從表中可以看出，SV的變異主要發(fā)生在外顯子區(qū)域。

表2 赤芝5.644 測(cè)序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

表3 SNP注釋結(jié)果

表4 Small Indels的CDS區(qū)統(tǒng)計(jì)

表5 Small Indel注釋結(jié)果

表6 SV統(tǒng)計(jì)

表7 SV注釋

2.7 韓芝DNA水平變異的分析

在CDS區(qū)發(fā)生的變異可能會(huì)引起基因功能的變化，檢測(cè)到韓芝與參考基因組間發(fā)生的非同義突變SNP、CDS 區(qū)發(fā)生的InDel 與SV 的基因數(shù)量分別為10 607、4 774、1 428。共有9 649個(gè)變異基因得到了注釋，COG共注釋到了4061個(gè)變異基因，其中存在較多變異基因的功能類為氨基酸運(yùn)輸和代謝（361 個(gè)）、次生代謝物的生物合成、運(yùn)輸和分解代謝（352個(gè)）、碳水化合物的運(yùn)輸和代謝（315 個(gè)）（圖3）。將得到的9649 個(gè)變異基因進(jìn)行KEGG 分析，這些變異基因主要注釋到的代謝通路為碳代謝（79 個(gè)）、氨基酸的生物合成（72 個(gè)）和RNA轉(zhuǎn)運(yùn)（70個(gè)）（圖4）。

這些變異基因中有86個(gè)為轉(zhuǎn)錄因子，目前對(duì)于靈芝中轉(zhuǎn)錄因子的研究，分析與靈芝菌絲生長(zhǎng)及靈芝三萜含量相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子GlSwi6[17]和GlPacC[18]發(fā)現(xiàn)，兩個(gè)基因CDS 區(qū)發(fā)生的變異類型分別為密碼子刪除和非同義編碼突變。除此之外，從這些變異的轉(zhuǎn)錄因子中還發(fā)現(xiàn)了4個(gè)可能與韓芝菌絲生長(zhǎng)相關(guān)的候選基因PacC/Rim101、Zap1、Spt8 和Bfr2。這 些 轉(zhuǎn) 錄 因 子 的CDS區(qū)均發(fā)生了非同義編碼突變（表8）。

注釋為細(xì)胞色素P450 的變異基因有195 個(gè)，與已報(bào)道的[3]和羊毛甾醇合酶（LSS）高度相關(guān)的78 個(gè)CYP基因相比，有70 個(gè)相同的基因，其中有12 個(gè)CYP512和1個(gè)CYP5144，這13個(gè)基因在CDS區(qū)均發(fā)生了變異，變異類型為非同義編碼突變、移碼突變、終止密碼子獲得、密碼子改變+密碼子刪除及密碼子（3 的整數(shù)倍）插入（表9）。對(duì)基因GL15605 的變異進(jìn)行圖示，該基因DNA 序列2186核苷酸處發(fā)生單堿基突變（圖5 A），使得氨基酸從精氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)橘嚢彼幔▓D5 B）。

圖3 變異基因COG注釋圖

圖4 變異基因的KEGG注釋圖

表8 與生長(zhǎng)相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子的變異

表9 細(xì)胞色素P512和P5144家族的變異

圖5 基因GL15605序列比對(duì)

2.8 對(duì)注釋的與生長(zhǎng)相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子的RT-PCR檢測(cè)結(jié)果

對(duì)注釋的與生長(zhǎng)相關(guān)的6 個(gè)轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行RTPCR分析，結(jié)果表明（圖6），韓芝的基因表達(dá)量高于赤芝CGMCC5.0026，注釋為PacC/Rim101（GL27476）和Zap1（GL21797）的基因，在兩種菌絲中的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。其它4個(gè)基因的表達(dá)量差異不顯著。

3 討論

隨著越來越多生物的基因組被測(cè)序，其基因組重測(cè)序技術(shù)已成為分子育種研究的重要手段。本文對(duì)韓芝進(jìn)行基因組重測(cè)序，得到了大量的變異基因，在COG注釋中，這些變異基因主要注釋到了氨基酸的運(yùn)輸和代謝，次生代謝物的生物合成、運(yùn)輸和分解代謝，碳水化合物的運(yùn)輸和代謝。

變異基因中，注釋到的轉(zhuǎn)錄因子共有86 個(gè)，主要的類型為bZIP、C2H2、CBF、HTH、MADS、TFII_related和一些真菌特有的轉(zhuǎn)錄因子。其中，C2H2類型轉(zhuǎn)錄因子PacC 的缺失對(duì)真菌菌絲的生長(zhǎng)和分生孢子的產(chǎn)量具有一定的抑制作用[19,20]。赤芝轉(zhuǎn)錄因子GlPacC 沉默，對(duì)菌絲生長(zhǎng)速度、子實(shí)體發(fā)育和靈芝酸合成具有抑制作用。韓芝中該基因CDS 區(qū)發(fā)生了密碼子刪除（3的整數(shù)倍），CGCCCCCGC堿基缺失。在韓芝中還發(fā)現(xiàn)了另一個(gè)pH響應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子PacC/Rim101（GL27476）在CDS 區(qū)也發(fā)生了非同義編碼突變。此外，Swi6 轉(zhuǎn)錄因子屬于APSES 家族，是真菌特有的一個(gè)蛋白家族[21]。有研究表明，赤芝中轉(zhuǎn)錄因子GlSwi6基因沉默菌株降低了菌絲生長(zhǎng)速度，增加了菌絲分支，并且抑制了原基和子實(shí)體的形成，降低了靈芝酸的含量[17]，本研究發(fā)現(xiàn)韓芝中該基因CDS 區(qū)發(fā)生了非同義編碼突變。除此之外，還發(fā)現(xiàn)了一些與生長(zhǎng)相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子Zap1、Spt8和Bfr2在CDS區(qū)也發(fā)生了非同義編碼突變。有研究表明，酵母菌在鋅受限型培養(yǎng)基中生長(zhǎng)受到限制，這與Zap1 轉(zhuǎn)錄因子的靶基因有關(guān)[22]。SPT 包括SPT3、SPT7、SPT8 和SPT20，是SAGA 復(fù)合體的重要成分蛋白。禾谷鐮刀菌中，與野生型相比，F(xiàn)gspt3 和Fgspt8缺失突變株的菌絲生長(zhǎng)明顯受到抑制，并且不能產(chǎn)生分生孢子，同時(shí)與孢子形成相關(guān)的基因FgFlbC和FgRen1的表達(dá)量也下調(diào)[23]。Bfr2基因?qū)?xì)胞生長(zhǎng)周期具有調(diào)控作用[24]。菌絲生長(zhǎng)受很多基因和通路的調(diào)控，調(diào)控過程比較復(fù)雜。轉(zhuǎn)錄因子在結(jié)合區(qū)域產(chǎn)生的SNP可能會(huì)影響轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合特性，影響轉(zhuǎn)錄因子在等位基因上的結(jié)合強(qiáng)度，從而影響SNP 所在基因的表達(dá)情況[25]。在研究中我們發(fā)現(xiàn)，赤芝CGMCC5.0026 的生物量高于韓芝。對(duì)靈芝中注釋的與生長(zhǎng)相關(guān)的6個(gè)轉(zhuǎn)錄因子，通過RT-PCR 檢測(cè)發(fā)現(xiàn)赤芝CGMCC5.0026 的表達(dá)量均低于韓芝，由于在RT-PCR中使用甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GPD）作為內(nèi)參基因，該內(nèi)參基因在不同靈芝中的表達(dá)量有所差異，本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)韓芝中的GPD表達(dá)量（Cq值為24.5）要高于赤芝CGMCC5.0026（Cq值為22.17），因此在計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)時(shí)，韓芝中基因的表達(dá)量要高于赤芝CGMCC5.0026。這6個(gè)轉(zhuǎn)錄因子的變異是否會(huì)參與靈芝菌絲的生物量以及如何參與菌絲生長(zhǎng)的調(diào)控還需要后續(xù)實(shí)驗(yàn)的進(jìn)一步驗(yàn)證。

圖6 不同菌絲的基因相對(duì)表達(dá)量

肌動(dòng)蛋白骨架在真菌細(xì)胞極性生長(zhǎng)、產(chǎn)孢、應(yīng)激和維持細(xì)胞形態(tài)等方面發(fā)揮重要作用。本文中，韓芝中部分肌動(dòng)蛋白相關(guān)蛋白CDS 區(qū)發(fā)生了非同義編碼突變、移碼突變。肌動(dòng)蛋白相關(guān)蛋白（ARP5）缺陷型植物表現(xiàn)出植株矮小和細(xì)胞大小異常[26]，本研究注釋到的兩個(gè)肌動(dòng)蛋白相關(guān)蛋白（ARP5）均發(fā)生了非同義編碼突變。

此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，注釋為細(xì)胞色素P450 的變異基因有195個(gè)，這些基因在KOG分類注釋中，有135個(gè)變異基因參與次生代謝產(chǎn)物的生物合成，轉(zhuǎn)運(yùn)和分解代謝，4 個(gè)變異基因參與了能量的產(chǎn)生和轉(zhuǎn)化。與Chen 等人研究中78 個(gè)可能和赤芝三萜合成相關(guān)的CYP450相比，發(fā)現(xiàn)有70個(gè)相同的CYP450，其中，有12個(gè)CYP512 和1 個(gè)CYP5144，研 究 表 明，在 動(dòng) 物 中CYP512 和CYP5144 對(duì)甾體激素和睪酮等激素的結(jié)構(gòu)具有修飾作用，并且這兩個(gè)P450家族與羊毛甾醇合酶（LSS）共表達(dá)[3]，由于細(xì)胞色素P450 基因變異較多，因此本實(shí)驗(yàn)對(duì)不同菌株菌絲的三萜含量進(jìn)行測(cè)定，發(fā)現(xiàn)韓芝菌絲三萜含量明顯高于赤芝CGMCC5.0026，這說明韓芝中大量細(xì)胞色素P450 的變異可能會(huì)影響赤芝三萜的含量。這將為細(xì)胞色素P450 參與三萜的合成提供新的證據(jù)。

赤芝全基因組測(cè)序的完成為靈芝成為藥用模式真菌奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)[3]。靈芝生長(zhǎng)發(fā)育和發(fā)酵與栽培的研究為靈芝的一般生物學(xué)研究奠定了基礎(chǔ)[27]。靈芝的藥用成分豐富，目前已分離出400多種活性物質(zhì)，包括多糖、萜類、甾醇類、生物堿等[28]。靈芝的基因組分析進(jìn)一步證實(shí)了靈芝具有三萜、聚酮、倍半萜等多條次生代謝合成途徑[27]，目前研究較多的是合成靈芝三萜的MVA 途徑，其上游途徑中的一些關(guān)鍵酶基因如AACT[29]、HMGS[30]、HMGR[31]、FPS[32]、MVD[33]、LSS[34]和SQS[35]已被克隆及進(jìn)行基因過表達(dá)研究。赤芝基因組測(cè)序的完成篩選出600 多個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白和219 個(gè)CYP450 編碼基因[3]。目前，靈芝遺傳轉(zhuǎn)化的研究也進(jìn)一步開展，如電擊法[36]、PEG介導(dǎo)法[37]以及農(nóng)桿菌介導(dǎo)法[38]。這為靈芝功能基因組學(xué)的研究奠定了基礎(chǔ)。本研究進(jìn)行韓芝全基因組重測(cè)序，篩選出一些潛在的與菌絲生長(zhǎng)相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，并且對(duì)細(xì)胞色素P450對(duì)三萜含量的影響具有指導(dǎo)意義，這對(duì)完善靈芝模式真菌研究體系提供了基礎(chǔ)。

綜上所述，本研究通過全基因組重測(cè)序篩選了韓國(guó)赤芝與中國(guó)赤芝間變異的轉(zhuǎn)錄因子和細(xì)胞色素P450，并對(duì)韓芝菌絲生長(zhǎng)和三萜合成相關(guān)基因的變異進(jìn)行初步挖掘和分析，對(duì)揭示赤芝菌絲生長(zhǎng)和三萜合成的遺傳機(jī)制具有重要意義，而這些變異基因的具體功能還有待進(jìn)一步驗(yàn)證。