葆生精改善少弱精子癥模型大鼠生殖功能的實(shí)驗(yàn)研究

張 哲 金滋潤(rùn) 楊宇卓 張海濤1, 祝雨田1, 張洪亮,5 毛加明

劉德風(fēng)2 趙連明1,2 唐文豪1,2,5 林浩成1,2 洪 鍇1,2 邢國(guó)剛3,4,* 姜 輝1,2,5,*

1．北京大學(xué)第三醫(yī)院泌尿外科（北京 100191）；2.北京大學(xué)第三醫(yī)院男科；3.北京大學(xué)神經(jīng)科學(xué)研究所；4.北京大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院神經(jīng)生物系；5.北京大學(xué)第三醫(yī)院精子庫(kù)

近年來(lái)隨著環(huán)境污染的加劇、生活節(jié)奏的加快和生育年齡的延遲，不育癥的發(fā)病率逐年升高，已經(jīng)成為了一個(gè)重大公共健康問(wèn)題[1,2]。全球約有10%～15%的育齡期夫婦受到不育癥的困擾，其中男性因素占不育原因的一半左右[3]。少弱精子癥是導(dǎo)致男性不育的主要原因之一，目前雖然針對(duì)少弱精子癥的藥物治療取得了一定進(jìn)展，但仍有部分患者的療效不盡人意[4]。本研究擬通過(guò)生殖毒性藥物奧硝唑（ornidazole,ORN）建立少弱精子癥大鼠模型，觀察葆生精對(duì)少弱精子癥模型大鼠生殖功能的影響，探索葆生精治療少弱精子癥的機(jī)制，為臨床男性不育的藥物治療提供理論基礎(chǔ)。

材料與方法

一、試劑與儀器

奧硝唑（ORN，貨號(hào)：MB1173，大連美侖生物技術(shù)有限公司），羧甲基纖維素鈉（貨號(hào)：30036365，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），0.9%氯化鈉注射液（NS，石家莊四藥有限公司），谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-Px）檢測(cè)試劑盒（貨號(hào)：A005,南京建成生物科學(xué)研究所）、超氧化物歧化酶（SOD）檢測(cè)試劑盒（貨號(hào)：S0109,碧云天生物技術(shù)有限公司），抗Bcl-2兔多克隆抗體 （貨號(hào)：bs-4563R，Bioss）、抗Caspase3兔多克隆抗體 （貨號(hào)：bs-0081R，Bioss），精子計(jì)數(shù)板（南寧松景天倫生物科技有限公司），水浴鍋（北京市長(zhǎng)風(fēng)儀器有限公司），計(jì)算機(jī)輔助精子分析系統(tǒng) （北京偉力新世紀(jì)科技發(fā)展有限公司，型號(hào)：WLJY-9000）。 普通光學(xué)顯微鏡（Olympus），臺(tái)式冷凍離心機(jī)（型號(hào)：5417R，eppendorf）。

二、動(dòng)物分組與實(shí)驗(yàn)

34只健康成年雄性SD大鼠，體質(zhì)量200～230g，由北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)：SCXK（京）2006-0008。將大鼠按體質(zhì)量隨機(jī)分為溶劑對(duì)照組（vehicle）7 只、少弱精子癥模型組（ORN）8 只，生理鹽水對(duì)照模型組 （ORN+NS）9只和葆生精治療模型組（ORN+BSJ）10只。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。大鼠均自由采食、飲水，飼養(yǎng)過(guò)程中，每天換水，隔日換籠中的墊料以保持清潔干燥。環(huán)境溫度20～25℃，光照:白天12 h/夜晚 12 h。 （1）ORN 組：奧硝唑溶液灌胃， 400mg/（kg·d），連續(xù)灌胃至治療結(jié)束[5]。（2）vehicle組：給與等體積的0.2%羧甲基纖維素鈉溶液。奧硝唑溶液制備：0.25g奧硝唑加入1 mL 0.2%羧甲基纖維素鈉溶液 （0.2g羧甲基纖維素鈉加入100 mL滅菌的雙蒸水，同時(shí)加入兩滴100μLTween-20）置于干凈研缽中研碎至糊狀。以快速前向運(yùn)動(dòng)的a級(jí)精子數(shù)和慢速前向運(yùn)動(dòng)的b級(jí)精子數(shù)之和小于50%，或快速前向運(yùn)動(dòng)的a級(jí)精子數(shù)小于25%作 為 造 模 成 功 的標(biāo)準(zhǔn)。（3）ORN+BSJ組：從奧硝唑灌胃的第15天開(kāi)始，給與大鼠沙棘汁灌胃，ORN 400 mg/（kg·d）+BSJ 514 mg/（kg·d）。 （4）ORN+NS 組：從奧硝唑灌胃的第15天開(kāi)始，給與大鼠生理鹽水灌胃，ORN 400 mg/（kg·d）+ 等體積 NS。大鼠每日稱量，藥物現(xiàn)用現(xiàn)配，每日一次，連續(xù)3周。

三、標(biāo)本采集與精子活力檢測(cè)

各組大鼠在治療結(jié)束后1 d腹腔注射過(guò)量水合氯醛處死，應(yīng)用擴(kuò)散法收集附睪尾精子進(jìn)行精子活力分析實(shí)驗(yàn)[6]。將雙側(cè)附睪尾部放入標(biāo)記好的含2 mL（37℃預(yù)熱）0.9%氯化鈉溶液的一次性培養(yǎng)皿中，用小剪刀在附睪尾部，輕輕地剪3刀，37℃水浴鍋中放置2 min，輕輕混勻，取20 μL加到37℃預(yù)熱的精子計(jì)數(shù)板上，選取6個(gè)視野，于2 min內(nèi)完成測(cè)試。運(yùn)用計(jì)算機(jī)輔助精子分析系統(tǒng)檢測(cè)主要測(cè)試指標(biāo)：精子密度、精子活力、a級(jí)精子比例、（a+b）級(jí)精子比例、曲線運(yùn)動(dòng)速度(VCL)、直線運(yùn)動(dòng)速度(VSL)、平均路徑速度(VAP)、直線性(LIN)、前向性(STR)、精子頭側(cè)擺幅度(ALH)。

四、大鼠睪丸組織勻漿GSH-Px及SOD活性測(cè)定

取1側(cè)睪丸組織按質(zhì)量(g)：體積(mL)=1∶9的比例加入9倍體積的勻漿介質(zhì)(PBS)，冰水浴條件下剪碎組織后一起加入勻漿管中。將玻璃勻漿管置于冰水浴條件下，手動(dòng)勻漿，30 s/次，重復(fù)6～8次，制成10%的勻漿液，4℃、2 500×g離心10 min，取上清液，按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作方法測(cè)定GSH-Px和SOD活性。

五、大鼠睪丸組織中4-HNE、Bcl-2、Caspase3蛋白表達(dá)檢測(cè)

取1側(cè)睪丸組織按質(zhì)量(g)：體積(mL)=1∶9的比例加入9倍體積的RIPA裂解液，用勻漿器將組織充分研磨成不可見(jiàn)顆粒，冰上裂解1 h；然后將組織勻漿液離心 12 000×g，4 ℃，10 min， 取上清。 用 BCA(bicinchoninic acid)蛋白質(zhì)測(cè)定試劑盒(美國(guó)Pierece公司)進(jìn)行蛋白定量，在Model680酶標(biāo)儀 （美國(guó)BIO·RAD公司）上讀板，測(cè)量波長(zhǎng)為570 nm；以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，校正吸光度為縱坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線。按照標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出蛋白濃度。將蛋白加入10%的SDS-PAGE凝膠中電泳，將分離出的蛋白100V恒壓轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。完畢，將有蛋白的PVDF膜用5%脫脂牛奶室溫封閉I h。取出封閉好的PVDF膜孵育相應(yīng)一抗，4℃冰箱孵育過(guò)夜。第2天，取出一抗反應(yīng)結(jié)束的PVDF膜，TBST洗3次，室溫孵育相應(yīng)二抗1 h。結(jié)合二抗后的PVDF膜用TBST洗3次后顯色觀察蛋白表達(dá)的含量變化。之后采用Quantity One軟件統(tǒng)計(jì)蛋白灰度。

六、大鼠睪丸組織形態(tài)學(xué)檢測(cè)

將睪丸組織于4%溶液中固定24 h后，20%蔗糖脫水，依次用乙醇脫水，二甲苯透明，浸蠟，石蠟包埋，5 μm厚切片，二甲苯和酒精梯度脫蠟，蘇木素和伊紅染色，脫水，透明，樹(shù)膠封片，置于光鏡下觀察玻片。

七、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

各組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Prism7.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤（±s）表示。各組間比較采用單因素方差分析，及Bonferroni post-hoc檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、葆生精可顯著改善少弱精子癥模型大鼠的精子質(zhì)量

與正常對(duì)照組相比，模型大鼠附睪精子質(zhì)量，包括精子密度、活力和直線速率、曲線速率等運(yùn)動(dòng)參數(shù)都明顯下降（P＜0.01），說(shuō)明成功構(gòu)建了少弱精子癥大鼠模型。給予葆生精治療后，少弱精子癥大鼠附睪精子的各項(xiàng)指標(biāo)均有顯著改善，精子活力、精子密度及運(yùn)動(dòng)參數(shù)都有明顯的增加（見(jiàn)表1及表2）。

二、大鼠睪丸組織形態(tài)學(xué)變化

由圖1可以看出，正常對(duì)照組大鼠睪丸組織中各級(jí)生精細(xì)胞排列整齊，生精小管基底膜完整，管腔內(nèi)充滿精子;少弱精子癥模型組大鼠睪丸組織中部分生精細(xì)胞脫落，層次排列紊亂，生精上皮細(xì)胞變薄，管腔內(nèi)精子數(shù)量明顯減少。給予葆生精治療后，雖然各級(jí)生精細(xì)胞排列略稀疏，但生精上皮形態(tài)基本恢復(fù)，各級(jí)生精細(xì)胞及管腔內(nèi)精子數(shù)目都有明顯增加。

三、葆生精可改善少弱精子癥大鼠睪丸中的氧化應(yīng)激狀態(tài)

與正常對(duì)照組相比，模型大鼠睪丸組織中SOD的酶活力和GSH-Px的酶活力都明顯下降（P＜0.01），而給予葆生精治療后，大鼠睪丸組織中SOD的酶活力及GSH-Px的酶活力則都較對(duì)照組有明顯的增加（P＜0.01）。見(jiàn)表3。

四、葆生精可減少少弱精子癥大鼠的生精細(xì)胞凋亡

如圖2所示，與正常對(duì)照組相比，模型大鼠睪丸組織中抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)有所下降，葆生精治療模型組（ORN+BJS組）大鼠睪丸組織中抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)明顯增加（P＜0.01）。同時(shí)我們觀察到少弱精子癥模型組大鼠睪丸組織凋亡蛋白Caspase-3的表達(dá)明顯增加 （P＜0.05），給予葆生精治療后大鼠凋亡蛋白Caspase-3 的表達(dá)明顯下降（P＜0.05）。

表1 葆生精對(duì)少弱精子癥模型大鼠精子活力及密度的影響

表2 葆生精對(duì)少弱精子癥模型大鼠精子運(yùn)動(dòng)參數(shù)的影響

表3 各組大鼠睪丸組織抗氧化應(yīng)激酶活性的比較

圖1 各組大鼠睪丸組織形態(tài)學(xué)改變（HE:×200）

圖2 各組大鼠睪丸組織中Bcl-2及Caspase-3的蛋白表達(dá)

討 論

少弱精子癥的發(fā)病原因十分復(fù)雜，如精索靜脈曲張、內(nèi)分泌調(diào)節(jié)異常和不良生活習(xí)慣等均可引起精子的數(shù)量減少和活力減弱[7,8]。多項(xiàng)流行病學(xué)調(diào)查統(tǒng)計(jì)均發(fā)現(xiàn)少弱精子癥約占男性不育的一半以上，少弱精子癥一直是男性不育治療的重點(diǎn)和熱點(diǎn)。構(gòu)建合適的少弱精子癥動(dòng)物模型，可用于少弱精子癥新的治療方法和作用機(jī)制的探索。奧硝唑（ORN）是一種硝基咪唑類厭氧菌抗生素，臨床上主要應(yīng)用于預(yù)防和治療脆弱擬桿菌、狄氏擬桿菌等敏感厭氧菌所引起的多種感染性疾病，但同時(shí)發(fā)現(xiàn)ORN對(duì)生殖系統(tǒng)有一定的毒性作用。研究發(fā)現(xiàn)低劑量的ORN能可逆性地抑制大鼠附睪精子活力，高劑量的ORN可破壞睪丸的生精功能，精子密度和活力均顯著下降，其病理變化接近男性不育患者的臨床特征[9,10]。本研究中少弱精子癥模型大鼠睪丸生精細(xì)胞脫落，層次排列紊亂，管腔內(nèi)精子數(shù)量明顯減少，其造模效果與之前研究相似，說(shuō)明少弱精子癥模型制備成功。

氧化還原系統(tǒng)動(dòng)態(tài)平衡調(diào)控對(duì)精子發(fā)生和男性生育力維持具有重要的調(diào)控作用[11]。精原干細(xì)胞的自我更新需要活性氧（reactive oxygen species，ROS）來(lái)維持，二倍體的精原細(xì)胞分化為單倍體精子細(xì)胞的過(guò)程也需要一定濃度的ROS。睪丸中細(xì)胞分裂活躍，且酶類調(diào)控系統(tǒng)復(fù)雜，位于線粒體嵴的呼吸鏈氧化磷酸化酶復(fù)合體，如黃嘌呤、NADPH氧化酶、細(xì)胞色素P450等多種途徑均可產(chǎn)生ROS，這就意味著線粒體氧消耗和ROS產(chǎn)生速率均較高；且睪丸中富含非飽和脂肪酸易受ROS的攻擊而導(dǎo)致功能損傷[12,13]。為了防止ROS產(chǎn)生過(guò)多所帶來(lái)的損傷效應(yīng)，睪丸中具有包括超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）在內(nèi)的多種抗氧化酶系統(tǒng)和抗氧化小分子。但如果ROS產(chǎn)生過(guò)多超過(guò)了睪丸的抗氧化能力時(shí)，睪丸就會(huì)處于氧化應(yīng)激狀態(tài)，導(dǎo)致組織細(xì)胞內(nèi)線粒體崩解脫落、膜脂質(zhì)過(guò)氧化等，損害細(xì)胞的正常生理功能[14,15]。越來(lái)越多的研究表明氧化應(yīng)激損傷在男性不育的發(fā)病過(guò)程中起著重要作用，在臨床上使用維生素E、左卡尼丁等抗氧化劑治療男性不育也取得了一定療效[16-18]。

葆生精是一種新型的天然多元小分子營(yíng)養(yǎng)素，主要成分蔓越莓和沙棘具有抗炎、抗氧化作用。葆生精經(jīng)微生物復(fù)合發(fā)酵工藝獲取多組分抗氧化營(yíng)養(yǎng)素，克服了傳統(tǒng)抗氧化劑單組分或多組分簡(jiǎn)單疊加無(wú)法全面平衡人體復(fù)雜結(jié)構(gòu)性氧化應(yīng)激的技術(shù)瓶頸；其特有的網(wǎng)絡(luò)抗氧化能力，經(jīng)機(jī)體代謝途徑可直接清除體內(nèi)多種過(guò)量氧自由基，并同步抑制其鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。臨床研究初步發(fā)現(xiàn)葆生精可改善男性不育患者的精液質(zhì)量，但其具體的分子機(jī)制仍尚未完全闡明。我們通過(guò)構(gòu)建大鼠少弱精子癥動(dòng)物模型發(fā)現(xiàn)，ORN可通過(guò)降低抗氧化酶SOD和GSH-Px的活性，誘導(dǎo)生精細(xì)胞凋亡并嚴(yán)重?fù)p傷大鼠的精子質(zhì)量。SOD是催化超氧化物歧化反應(yīng)的金屬酶，通過(guò)將超氧化物轉(zhuǎn)化為破壞性較弱的分子氧和過(guò)氧化氫以消除ROS引起的氧化損傷；GSH-Px是體內(nèi)分解過(guò)氧化物的主要酶類，對(duì)過(guò)氧化氫具有較強(qiáng)的清除能力[19]。給予葆生精治療后，少弱精子癥大鼠睪丸內(nèi)SOD和GSH-Px的酶活力明顯增加，說(shuō)明葆生精可增加大鼠生殖系統(tǒng)的抗氧化能力。我們進(jìn)一步觀察到睪丸組織中凋亡蛋白Caspase-3的表達(dá)下降而抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)量明顯增加，在睪丸組織形態(tài)學(xué)上我們也能觀察到大鼠生精小管管腔內(nèi)的生精細(xì)胞和精子數(shù)目也都有所恢復(fù)，同時(shí)使用葆生精治療組大鼠附睪的精子數(shù)目和活力也得到了明顯提升。

綜上所述，葆生精可通過(guò)提高少弱精子癥模型大鼠的抗氧化能力，修復(fù)生殖系統(tǒng)的氧化損傷，抑制生精細(xì)胞凋亡，從而提高精子濃度和活力。本研究結(jié)果表明，葆生精對(duì)生育力受損的少弱精子癥大鼠模型有明顯的生殖保護(hù)作用，對(duì)臨床少弱精子癥患者的治療具有一定的參考價(jià)值。但本研究未觀察不同藥物劑量的治療效果，葆生精發(fā)揮生殖保護(hù)作用的具體機(jī)制不夠詳盡，仍需進(jìn)一步研究探索。