瞬時受體電位M4通道與心臟電活動及心律失常的研究進展*

尹琳 黃從新

瞬時受體電位M4(transient receptor potential melastatin 4 ,TRPM4)是一種在心臟中廣泛表達的、與多種心血管疾病相關(guān)的陽離子通道。TRPM4具有胞內(nèi)鈣離子和電壓門控雙重依賴性，但與許多其他TRP通道不同，其僅對單價陽離子是可通透性的。多項研究發(fā)現(xiàn)TRPM4是心臟電活動的重要參與者，現(xiàn)筆者對此做一綜述。

1 TRPM4通道的結(jié)構(gòu)

最近有科學(xué)家相繼揭示人類TRPM4蛋白的原子結(jié)構(gòu)：TRPM4是由四個相同亞基圍成的離子通道，其中每個亞基包含多個跨膜和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域，大致分為三個區(qū)域：N端為TRP通道家族的同源區(qū)域(MHRs)，由MHR1～4組成；C端(CTD)有兩個螺旋區(qū)域；跨膜區(qū)域(TMD)包括S1～S6區(qū)和TRP區(qū)(圖1)。

2017年12月Winkler等[1]通過低溫電子顯微鏡揭示了TRPM4通道的“王冠樣結(jié)構(gòu)”——C端的其中一個卷曲螺旋區(qū)域(coiled-coil domain)組成王冠的“頂”，而另一螺旋結(jié)構(gòu)類似于王冠的“骨架”穿過MHRs，并與MHRs和TMD共同形成王冠的“帽狀”(圖2為平行于細胞膜平面的三維重建結(jié)構(gòu)，四個亞基分別用四種不同的顏色標(biāo)記)。幾乎同一時間Autzen及其團隊[2]利用脂質(zhì)體包含鈣離子結(jié)合的人類TRPM4和鈣離子未結(jié)合的人類TRPM4，再用低溫電子顯微鏡對這兩者結(jié)構(gòu)上的不同進行分析，揭示了TRP區(qū)和S1～S4結(jié)構(gòu)域的基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)，確定了S1～S4存在Ca2+的結(jié)合位點。他們提出當(dāng)Ca2+結(jié)合至TRPM4通道時使得第905位點的精氨酸向位于第790位點的脯氨酸移動，造成了TRPM4通道的閉合狀態(tài)與Ca2+未結(jié)合時的狀態(tài)不同，即鈣結(jié)合誘導(dǎo)構(gòu)象變化，從而使得TRPM4通道具有電壓依賴性。

圖1人類TRPM4單個亞基的平面簡圖(來源于doi:10.1038/nature24674)

圖2人類TRPM4的三維結(jié)構(gòu)重建圖 (來源于doi:10.1038/nature24674)

除了上述hTRPM4的結(jié)構(gòu)外，guo等[3]采用相同的方式揭露了小鼠的TRPM4在ATP結(jié)合及未結(jié)合狀態(tài)下的原子結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)其亞基的分區(qū)及整體的四聚體結(jié)構(gòu)大致與人類的相似，只是對各區(qū)域的命名有少許差異，其將mTRPM4整個蛋白大致分為3層。底層結(jié)構(gòu)位于胞質(zhì)區(qū)，主要包含N末端核苷酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域(NBD)、錨定蛋白重復(fù)序列(ARD)和C末端卷曲螺旋。中層是連接子螺旋區(qū)域(LHD)，包含12個連接子(LH1-LH12)，形成了亞基內(nèi)多個域間相互作用的支架。S1-S6六個跨膜區(qū)域和TRP區(qū)域形成亞基的最頂層，與其他的大多數(shù)經(jīng)典的六個跨膜四聚體陽離子通道一樣，可將其分為兩個部分：S1-S4的電壓感應(yīng)域(VSD)和由S4-S5連接子螺旋連接的S5-S6孔結(jié)構(gòu)域。

2 TRPM4通道在心臟中的表達

心臟是TRPM4表達的主要組織之一。近來一些研究發(fā)現(xiàn)TRPM4 mRNA或蛋白質(zhì)表達有種屬差異性：在正常人類心房當(dāng)中可檢測到TRPM4的蛋白和電流[4]，通過對人類心臟中的TRPM4的mRNA的評估發(fā)現(xiàn)其主要表達于浦肯野纖維，而在心室肌細胞中表達量很少[5]；牛心中的TRPM4蛋白在室間隔的心內(nèi)膜表達量較心房、心室高[6]。在大鼠心臟中，TRPM4的mRNA、蛋白和電流主要出現(xiàn)于病理性心室肌當(dāng)中，如低氧再灌注損傷[7]和自發(fā)性高血壓模型[8]。小鼠的竇房結(jié)細胞也高表達TRPM4的mRNA和蛋白，其次是心房，心室表達量最少[9]。在功能層面上，TRPM4電流已在嚙齒動物[10]以及哺乳動物[11]心肌細胞記錄到。除了心肌細胞外，TRPM4的mRNA還存在于大鼠心室成纖維細胞[12]和血管平滑肌細胞[13]中。

3 TRPM4與心臟電活動

3.1TRPM4與竇房結(jié) 竇性心律是心臟電活動的起點，來源于竇房結(jié)細胞產(chǎn)生的自發(fā)的舒張期去極化( diastolic depolarization，DD)。DD是由超極化激活的環(huán)核苷酸門控通道(hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated ion channel，HCN)[14]和局部鈣釋放激活的內(nèi)向電流[15]所介導(dǎo)的。急性分離的小鼠竇房結(jié)細胞中存在功能性的TRPM4單通道離子流[9]，且TRPM4基因突變的病人表現(xiàn)為心動過緩[16]，因此TRPM4被認(rèn)為是局部鈣釋放激活的內(nèi)向電流的一個候選通道。

在急性分離的小鼠右房中，包含有竇房結(jié)，能產(chǎn)生自發(fā)的動作電位(action potential，AP)，TRPM4抑制劑9-菲酚能減慢心率，然而在TRPM4敲除的動物模型當(dāng)中卻不能產(chǎn)生效應(yīng)，說明9-菲酚是通過抑制TRPM4而不是其他離子通道起作用[17]。另外，在兔的竇房結(jié)中，9-菲酚能降低DD的斜率。但上述實驗均是在離體的心房所進行，它失去了內(nèi)源性神經(jīng)-激素的影響，而且分離的心房肌的搏動頻率比在體的心率慢(300次/分 vs 500次/分)，所以并不能真正意義上說明TRPM4對竇房結(jié)的影響。Demion等[10]將12周至32周鼠齡的雄性小鼠隨機分為兩組：TRPM4基因敲除組(Trpm4-/-組)與對照組(Trpm4+/+組)，予以12 h的夜間心電圖(ECG)監(jiān)測表明：Trpm4-/-組比Trpm4+/+組的竇性停搏的發(fā)生的次數(shù)多[(1.41±0.3)次, (n=18) vs (0.33±0.2)次,(n=13) ；P<0.05]，這說明了TRPM4對維持穩(wěn)定的在體竇性心律有一定的作用。竇房結(jié)中精確的局部鈣離子釋放水平現(xiàn)在還未知，計算機仿真實驗表明1 umol/L的鈣離子濃度變化將足夠激活TRPM4，并且激活的TRPM4電流能夠增加竇房結(jié)細胞的DD斜率[18]。

更有趣的是，9-菲酚的效應(yīng)和內(nèi)源性心率成負(fù)相關(guān)[17]：內(nèi)源性心率越低，9-菲酚減慢心率的效果越明顯,這說明了TRPM4僅僅在心臟節(jié)律降低的時候被激活，從而起到拮抗心動過緩的作用。此也能進一步解釋為什么Mathar等[19]通過基因重組的方式將第一代(R1)大鼠中胚胎干細胞的TRPM4基因與 Cre-loxP-重組產(chǎn)生TRPM4無效等位基因，再經(jīng)過反向雜交得到純合子(全身性TRPM4基因敲除)于第八代(R8)用于實驗，ECG卻發(fā)現(xiàn)全身性基因敲除大鼠的心率與正常組的心率無明顯差異[(524.6±10.3)次/分，(n=21) vs (502.5±2.6)次/分,(n=19)；P<0.05]。另外，Kecskes等[20]的研究也印證了上述觀點，該研究ECG示心臟特異性敲除TRPM4(TRPM4CKO)的小鼠與正常小鼠之間RR間期無明顯統(tǒng)計學(xué)意義[(99.9±1.6)ms，(n=18) vs (97.5±0.9)ms，(n=13)；P= 0.24]。為了獲得TRPM4CKO小鼠，其團隊將Trpm4L3F2小鼠與EIIa-Cre小鼠雜交。選擇后代Trpm4flox小鼠進行進一步繁殖。隨后，將Trpm4flox小鼠與MLC2a-Cre小鼠雜交，這導(dǎo)致TRPM4基因第15位、16位的外顯子其編碼TRPM4蛋白的第一跨膜結(jié)構(gòu)域的心臟特異性缺失，進而成功產(chǎn)生TRPM4CKO小鼠(其中Trpm4L3F2小鼠為經(jīng)過基因工程處理后帶有特異性片段的小鼠；Trpm4flox小鼠為Trpm4L3F2小鼠與EIIa-Cre小鼠雜交，其后代中帶有某種特殊位點的小鼠；基因片段詳情請參考具體文獻)。

由于人類的心率約為60～100次/分，所以相對于小鼠而言，9-菲酚的效果可能在人類心臟中較大。例如TRPM4的Y790H位點突變[16]能引起心動過緩，但遺憾的是關(guān)于該突變型的電生理學(xué)性質(zhì)未有進一步研究，且關(guān)于TRPM4突變病人的系統(tǒng)評價[21]也沒有提供TRPM4與心率相關(guān)的數(shù)據(jù)，這可能是缺少大數(shù)據(jù)研究病例造成的。

3.2TRPM4與工作心肌細胞 TRPM4也參與心房、心室肌AP的形成。Hu等[22]的研究表明：在離體的心房肌細胞(HL-1細胞)和心室肌細胞(Luo-Rudy心室肌細胞)中，TRPM4是鈣離子和電壓雙重依賴性的，僅僅數(shù)倍(3～5倍)的TRPM4激活就足夠延長AP復(fù)極化時程，進一步增加TRPM4的電流密度(≥6倍)能引起早期后除極(EADs)的疊加，從而產(chǎn)生一個EADs樣的刺激易化去極化。這與血管緊張素Ⅱ作用于該兩種細胞的效應(yīng)相同，且這兩者產(chǎn)生的效應(yīng)均能被9-菲酚所逆轉(zhuǎn)。在小鼠的TRPM4敲除模型當(dāng)中，異丙腎上腺素能增加其心率[19]，但在該動物模型分離的右房當(dāng)中腎上腺素對其心率的影響不大[17]，說明在體的腎上腺素刺激引起的心率增加可能不是直接通過調(diào)節(jié)TRPM4的活動所產(chǎn)生的結(jié)果。TRPM4對心肌AP的作用仍未完全明確，上述各個研究結(jié)果的差異性，可能是由于小鼠品系、取材部位或者檢驗手段不同引起。

現(xiàn)在關(guān)于TRPM4在心肌AP中扮演的角色主要概括為三點[23-24]：①TRPM4通道開放能加快去極化，因此出現(xiàn)在動作電位的起始部分；②TRPM4是被鈣離子所激活，所以在AP過程中能進一步增強；③TRPM4對Na+和K+的通透性是同等的，推測在膜電位為負(fù)的時候，其為Na+通透性的內(nèi)向電流，參與去極化，而在膜電位為正的時候其轉(zhuǎn)為K+通透性的外向電流。因此，TRPM4激活使膜電位趨向零，這也是心肌AP平臺期的膜電位。目前關(guān)于TRPM4對工作心肌細胞作用的研究局限于小鼠，而人類工作心肌細胞平臺期(約占AP的1/2)[25]相對于小鼠(約占AP的1/3)來說占據(jù)AP的大部分時程，因此關(guān)于TRPM4在人類心肌細胞AP中扮演的角色值得深入探究。

4 TRPM4突變引起的心律失常

4.1傳導(dǎo)阻滯 TRPM4突變能引起人類心臟傳導(dǎo)性疾病最早被發(fā)現(xiàn)是在一個攜帶有常染色體顯性遺傳基因的束支傳導(dǎo)阻滯的家庭當(dāng)中，其中E7K突變被確定為TRPM4的突變位點[5]，緊接著其他的突變位點相繼被發(fā)現(xiàn)，如Stallmeyer等[16]通過對160位無遺傳關(guān)系的心律失常的病人的基因型分析確定的Q131H、A432T、G582S、Y790H、K914R以及l(fā)iu等[6]在法國和黎巴嫩一些家族中發(fā)現(xiàn)的R164W、A432T與G844D。這些突變位點大約占右束支阻滯的1/4、占房室傳導(dǎo)阻滯的1/10。Liu表示TRPM4結(jié)構(gòu)中的N端和胞內(nèi)的環(huán)形結(jié)構(gòu)的功能突變表現(xiàn)為進行性地傳導(dǎo)阻滯，與心臟猝死有關(guān)，能引起心臟浦肯野纖維的變性。

上述提到的Demion等[10]的研究發(fā)現(xiàn)Trpm4-/-組小鼠表現(xiàn)出了多水平的傳導(dǎo)阻滯，包括一度和二度I型房室傳導(dǎo)阻滯。Trpm4-/-組小鼠二度Ⅱ型房室傳導(dǎo)阻滯中PR間期進行性延長往往伴隨著心率變異性短期評價指標(biāo)——正常相鄰RR間期差異性的平方根(RMSSD)的增加，這表明二度房室傳導(dǎo)阻滯可能是由于發(fā)作性的副交感神經(jīng)超速驅(qū)動所引起。為了進一步證實該猜測，該團隊采取阿托品干預(yù)Trpm4-/-組與Trpm4+/+組，經(jīng)過6 h的體表心電圖記錄發(fā)現(xiàn)阿托品確實能減少Trpm4-/-組的6 h內(nèi)二度房室傳導(dǎo)阻滯的發(fā)生頻率[Trpm4-/-+阿托品組(0.6±0.3)次 vs Trpm4-/-組(5.0±0.4) 次,P<0.01]，對Trpm4+/+組無明顯影響[Trpm4+/++阿托品組(1.4±0.3)次 vs Trpm4+/+組(1.5±0.2)次]。相對的是，在阿托品作用下，Trpm4-/-組與Trpm4+/+組的平均PR間期未見明顯改變[(42.3±0.3 )ms vs (42.3±0.3 ) ms，P<0.001]，說明一度房室傳導(dǎo)阻滯不是由于副交感神經(jīng)過度激活所引起，可能將歸因于離子通道的突變或者結(jié)構(gòu)的改變。

Liu等[6]發(fā)現(xiàn)了R164W、A432T與G844D這三種TRPM4突變后，對這幾種突變進行了深入的研究：該團隊采用II型快速定點誘變試劑盒作用于TRPM4的cDNA，從而產(chǎn)生了TRPM4Arg164Trp、TRPM4Ala432Thr、TRPM4Gly844Asp、正常組(WT組)四種類型的質(zhì)粒，再利用這四種質(zhì)粒分別去轉(zhuǎn)染中國倉鼠的卵巢細胞(Chinese hamster ovary，CHO)、人胚胎腎細胞和非洲綠猴細胞(COS-7)這三種細胞，最后應(yīng)用膜片鉗技術(shù)記錄各組的電流與導(dǎo)電率，其實驗主要集中于人胚胎腎細胞。實驗結(jié)果顯示在人胚胎腎細胞中三種突變類型的電流幅度[TRPM4Arg164Trp( 91.1±20.9)pA/pF，n=5 vs TRPM4Ala432Thr(86.3±21.0)pA/pF，n=5 vs TRPM4Gly844Asp(152.6±15.7)pA/pF，n=5]均比WT組高[(18.8±3.7 )pA/pF，n=10]，但均沒有引起單個通道的導(dǎo)電率和對鈣離子的親和力的改變(具體數(shù)值文獻未給出)。過表達動力蛋白(dynamitin)是破壞動力蛋白運動系統(tǒng)和干擾離子通道內(nèi)吞作用的既定方法[26]。緊接著，該團隊采用dynamitin分別和上述四種類型的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染人胚胎腎細胞，發(fā)現(xiàn)突變的TRPM4通道電流對dynamitin不敏感[TRPM4Arg164Trp(120.0±24.9 )pA/pF，n=5、 TRPM4Ala432Thr(83.6±23.0)pA/pF，n=5 、 TRPM4Gly844Asp(153.9±11.2)pA/pF，n=6]，而WT組的電流密度增加[(42.7±8.7 )PA / PF，n=7]。由此得出結(jié)論：TRPM4突變損害了基于動力蛋白的內(nèi)吞作用。SUMO蛋白修飾分為三步，而Ubc9是第二步的關(guān)鍵調(diào)節(jié)酶，影響著真核細胞中SUMO與其靶蛋白的結(jié)合，SENP1是去SUMO化蛋白修飾的調(diào)節(jié)劑。為了進一步明確該胞吞作用可能涉及到的轉(zhuǎn)錄后修飾，他們研究了Ubc9和SENP1對TRPM4電流密度的影響。和上述方法一樣，他們應(yīng)用Ubc9、SENP1分別與四組質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HRK-293細胞。WT組與Ubc9的共表達使得TRPM4電流密度顯著增加[(43.3±12.7)pA / pF，n=9，P=0.04]，WT 組與SENP1的共表達使TRPM4電流密度[(4.5±1.0) pA / pF，n=8]降低至背景電流水平[(3.5±0.4) pA / pF，n=7，P=0.39]，而三組突變型的細胞與Ubc9 共表達[(63.3±7.1) pA / pF，n=17，P=0.46]或SENP1[(64.5±17.2) pA / pF，n= 6，P=0.65]對電流密度均無明顯影響。這些結(jié)果意味著去SUMO化充當(dāng)TRPM4內(nèi)化的信號，因此，SUMO的蛋白修飾保護突變的TRPM4通道蛋白免于內(nèi)吞作用和蛋白酶體降解，從而引起細胞膜TRPM4通道蛋白的表達密度增加。

4.2Brugada綜合征(BrS) 部分BrS病人是由于TRPM4通道突變引起的[16, 21, 27]。Liu等[21]對248名BrS患者(排除了SCN5A突變)的TRPM4基因序列進行了分析，在20個相互獨立的個體中發(fā)現(xiàn)了11種TRPM4的突變位點，這些發(fā)現(xiàn)表明TRPM4突變占BrS的約6%。他們選擇了其中的4種(P779R、T873I、L1075P和K914X)突變用來進一步的電生理學(xué)研究，為了得到突變體，先將野生型的TRPM4的cDNA克隆至pcDNA4 / TO載體，再用定點誘導(dǎo)試劑盒進行體外誘變。深入的研究表明：K914X位點突變導(dǎo)致TRPM4蛋白的截短從而形成無功能的離子通道；另一個突變，P779R,相對于野生型TRPM4來說，其降低了全身的TRPM4電流，但沒有引起單價陽離子通透性的變化；T873I和L1075P位點突變相對正常組而言，在TRPM4電流記錄上沒有顯著的統(tǒng)計學(xué)差異。這種差異性說明了TRPM4功能表達異常雖然能引起B(yǎng)rS，但各個突變位點產(chǎn)生的效果卻各不相同。Durhoit等[27]和Stallmeyer等[16]均只是對臨床BrS患者進行遺傳學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)TRPM4突變是BrS的一種候選基因之一，但未進行進一步的電生理探究。

上述的突變分析表明TRPM4電流密度的增加或減少均能引起傳導(dǎo)阻滯，有學(xué)者認(rèn)為這可能是通過降低Nav1.5鈉通道的活性而形成的[28]：功能的增加可以使膜的靜息電位去極化并因此使鈉通道失活，而功能的喪失可以導(dǎo)致膜電位的超極化進而降低細胞的興奮性和傳導(dǎo)。這些假定的作用機制可以部分解釋SCN5A功能喪失和TRPM4突變兩種不同病變有某些相似表型(例如均表現(xiàn)為BrS)這一現(xiàn)象。

5 TRPM4與心臟肥大引起的心律失常

盡管對于心臟肥大引起心律失常的機制還未完全明確，但Ca2+似乎是這一現(xiàn)象出現(xiàn)的主要組成部分[29]。細胞內(nèi)Ca2+濃度升高時內(nèi)向電流的激活可誘發(fā)心律失常，至今發(fā)現(xiàn)的三種胞內(nèi)Ca2+濃度敏感的內(nèi)向電流包括：鈉鈣交換體、Ca2+激活的氯化物電流和Ca2+激活的非選擇性陽離子電流[30]。延遲后除極(delayed after depolarization, DADs)發(fā)生在AP的4期，是在復(fù)極完成后發(fā)生的短暫震蕩性除極活動，為瞬時內(nèi)向電流(Iti)所引起，主要為Na+。但DADs發(fā)生的主要機制是細胞內(nèi)Ca2+濃度增加，肌漿網(wǎng)的鈣負(fù)荷過重，即形成鈣超載，使細胞膜對Na+通透性增加，因此只要能引起細胞內(nèi)Ca2+超負(fù)荷的因素均可以促發(fā)這一離子流。有Guinamard等[8]利用自發(fā)性高血壓(SHR)所致的心肌肥厚大鼠模型和膜片鉗技術(shù)發(fā)現(xiàn)TRPM4的離子特性與Iti相符，均受胞內(nèi)鈣離子濃度的調(diào)控，該研究也發(fā)現(xiàn)TRPM4在高血壓大鼠心室肌中的表達高于正常的Wistar大鼠。因此認(rèn)為TRPM4可能參與鈣超載的形成，進而促進DADs。

在心肌AP的形成過程中TRPM4參與致心律失常的EADs形成，延長APD。有數(shù)項證據(jù)支持這一結(jié)論:①EADs和TRPM4的激活均與肌漿網(wǎng)的鈣釋放相關(guān),TRPM4的激活電壓在心肌細胞AP去極化發(fā)生過程的范圍內(nèi)，因此TRPM4的激活可使得EADs持續(xù)性產(chǎn)生[31]；②研究表明心肌肥厚能引起EADs[32]；③在SHR動物模型中鈣瞬變的發(fā)生率增加，其能促進鈣敏感性的離子通道電流的增加從而調(diào)整APD[33]，而TRPM4在SHR中也能延長APD[34]。

6 結(jié)語

總的來說，上述數(shù)據(jù)已經(jīng)表明TRPM4與心臟電生理有聯(lián)系，我們目前還未完全明確。盡管關(guān)于TRPM4突變和遺傳性心臟疾病的關(guān)聯(lián)已得到初步的認(rèn)識，但仍有很多問題待解決：首先，研究者已在HEK-293細胞中初步證實了某些突變能修飾TRPM4蛋白和電流，但其有待在心臟細胞中進一步得到驗證；其次，過表達或者敲除TRPM4動物模型的建立可以為其對心臟電活動的影響提供部分機制學(xué)說，但關(guān)于TRPM4在心臟中扮演的角色還未完全得到認(rèn)識，尤其是在心臟傳導(dǎo)阻滯中；最后，隨著TRPM4敲除小鼠模型的建立，TRPM4在心臟發(fā)育和心血管系統(tǒng)中的作用仍需深入研究。

最近對于TRPM4結(jié)構(gòu)的進一步解析對理解其功能有很大的幫助。另外，細胞水平的電生理學(xué)實驗?zāi)苌钊胩骄縏RPM4與膜電位的關(guān)系。因此，筆者認(rèn)為TRPM4有可能成為抗心律失常藥物的新靶點或者副作用的來源。