白斑綜合癥病毒極早期蛋白WSV403相互作用蛋白的篩選

馬艷麗，李 鈁，楊 豐

（自然資源部第三海洋研究所、海洋生物遺傳資源重點實驗室，福建 廈門361005）

白斑綜合癥病毒（WSSV）是DNA病毒，呈雙鏈環(huán)狀，在分類上屬于線性病毒科，白斑病毒屬（Whispovirus）［1］，是導(dǎo)致對蝦白斑綜合癥的元兇。該病毒具有發(fā)病快、傳播范圍廣、致死率高的特征，長期困擾著全球的對蝦養(yǎng)殖業(yè)［2-6］。目前，雖然可以通過健康的養(yǎng)殖模式與密切的病原監(jiān)測來預(yù)防WSSV的感染，但是該病毒一旦在養(yǎng)殖池暴發(fā)我們?nèi)匀皇菬o計可施。

了解病毒的感染機制是建立有效防治方法的基礎(chǔ)。DNA病毒的極早期（Immediate Early）基因是控制感染的起始以及從潛伏期轉(zhuǎn)換到增殖期的一類重要基因，這類基因可以借助宿主轉(zhuǎn)錄因子和RNA聚合酶II進行轉(zhuǎn)錄，無需利用新合成的病毒蛋白［7］。其編碼的極早期蛋白能夠通過錯綜復(fù)雜的策略調(diào)控宿主的生理與免疫狀態(tài)，營造有利于病毒復(fù)制的環(huán)境［8-9］。因此，針對病毒極早期蛋白功能的研究對認識病毒感染的核心機制是十分重要的。根據(jù)病毒的轉(zhuǎn)錄時相特征，WSSV基因可以分為極早期、早期和晚期基因3種基因類型［10］。到目前為止，研究人員利用基因芯片以及RT-PCR等實驗方法，已從WSSV中鑒定出21個極早期基因［11-13］。

其中極早期基因WSV403編碼的蛋白是一個包含Ring-H2結(jié)構(gòu)域的E3泛素連接酶［14］。該蛋白在E1泛素激活酶和E2泛素結(jié)合酶存在的情況下，能被聚泛素化［15］。此外，研究者發(fā)現(xiàn)WSV403基因能夠在無特異致病原的蝦中轉(zhuǎn)錄［16］，它還能與另一個潛伏相關(guān)蛋白WSV427的互作因子蛋白磷酸酶結(jié)合［16-17］，提示了WSV403與WSSV的潛伏之間存在聯(lián)系［13］。但是，WSV403如何在WSSV的感染過程中發(fā)揮作用仍然屬未知。

為進一步了解WSV403的作用機制，本研究中我們以293T細胞為表達系統(tǒng)，利用串聯(lián)親和純化技術(shù)和蛋白質(zhì)譜技術(shù)篩選WSV403的相互作用蛋白，進一步對部分基因進行了克隆表達，并通過免疫共沉淀和免疫熒光分析驗證它們之間的相互作用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 抗體 一抗：鼠抗FLAG單克隆抗體、兔抗HA單克隆抗體，購自Sigma公司；Western-blot二抗：山羊抗小鼠偶聯(lián)AP抗體、驢抗兔偶聯(lián)AP抗體，購自Sigma公司；免疫熒光二抗：驢抗鼠偶聯(lián)Alexa Fluor 488抗體、山羊抗兔偶聯(lián)Alexa Fluor 546抗體，購自Thermo Fisher公司。

1.1.2 質(zhì)粒 慢病毒包裝質(zhì)粒pMDLg/pRRE、pVSV-G、pRSV-REV由廈門大學(xué)韓家淮教授贈予。載體pLL-Strep-FLAG和pCMV-HA由自然資源部第三海洋研究所李增鵬博士提供。載體pcDNA3.1-WSV403-FLAG和pcDNA3.1-WSV403H348T-FLAG由本實驗室保存。

1.2 細胞的培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染

人胚腎細胞293T（HEK 293T，美國種質(zhì)保藏中心）培養(yǎng)在體積分數(shù)為10%的胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件為37°C，5%CO2。轉(zhuǎn)染前12 h，將細胞（約4×106cells）接種在10 cm培養(yǎng)皿中，用聚乙烯亞胺（PEI）進行轉(zhuǎn)染。將10μg質(zhì)粒DNA和30 mm3濃度為50μmol/dm3PEI溶液分別用0.5 cm3Opti-MEM（Gibco公司）稀釋，室溫放置10 min。將PEI溶液加入DNA溶液中，渦旋混合，將混合物在室溫下孵育20 min，隨后滴加到細胞培養(yǎng)液中，6 h后換新的培養(yǎng)基培養(yǎng)。

1.3 慢病毒的包裝和穩(wěn)定細胞系的產(chǎn)生

1.3.1 WSV403慢病毒表達質(zhì)粒的構(gòu)建 本研究利用不依賴于連接酶的克隆方法（Ligation Independent Cloning，LIC）進行基因克?。?8］。以實驗室保存的含有WSV403基因的質(zhì)粒為模板，用WSV403-LIC-F以及WSV403-LIC-R引物（表1）進行PCR擴增，在其兩端引入與載體插入位點兩端同源的序列；將pLL-Strep-FLAG用Bam HI和Xho I酶切。用瓊脂糖凝膠電泳檢測并純化回收目的條帶與酶切載體之后，利用核酸外切酶III將WSV403基因連接到pLLStrep-FLAG載 體 上［19］，獲 得pLL-Strep-FLAGWSV403。其中WSV403與Strep以及FLAG標簽融合表達。

表1 所用引物序列Tab.1 Primers used in this study

1.3.2 慢病毒的包裝 本研究將慢病毒包裝質(zhì)粒（pMDLg/pRRE、pVSV-G、pRSV-REV）與pLL-Strep-FLAG-WSV403或pLL-Strep-FLAG質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染到293T細胞中。轉(zhuǎn)染72 h后收集含有病毒的培養(yǎng)上清液，用0.45μm過濾器過濾。

1.3.3 慢病毒感染目的細胞及其與穩(wěn)定細胞系的制備 將293T細胞接種在6孔板（2×105cells/孔）中并培養(yǎng)過夜。棄原培養(yǎng)基，加入1.5 cm3完全培養(yǎng)基、0.5 cm3病毒上清液與16μg Polybrene，孵育36 h。用8μg/cm3濃度的嘌呤霉素對陽性細胞進行篩選。在篩選壓力下培養(yǎng)7 d，獲得穩(wěn)定表達WSV403的293T細胞。

1.4 串聯(lián)親和純化分離多蛋白復(fù)合體以及蛋白的質(zhì)譜鑒定

用胰蛋白酶消化細胞（2×108cells），于2 300 r/min離心5 min收集細胞，用pH為7.4的裂解液（30 mmol/dm3Tris-HCl、150 mmol/dm3NaCl，體積分數(shù)為0.5%的Nonidet-P40，1 mmol/dm3蛋白酶抑制劑）重懸，并置于冰上裂解1 h。離心去除細胞碎片，用0.45μm針頭過濾器過濾上清液。將裂解液與0.2 cm3Strep Tactin凝膠（GE Healthcare公司）在4℃下孵育4 h。然后，用pH為7.4的洗滌液（30 mmol/dm3Tris-HCl、150 mmol/dm3NaCl，體積分數(shù)為0.1%的Nonidet-P40，1 mmol/dm3蛋白酶抑制劑）洗3次，用體積為0.5 cm3脫硫生物素洗脫液（2 mmol/dm3脫硫生物素、30 mmol/dm3Tris-HCl、150 mmol/dm3NaCl，pH為7.4）洗脫結(jié)合的蛋白復(fù)合物。隨后向洗脫液中加入50 mm3anti-FLAG M2親和凝膠珠（Sigma公司），并在4℃孵育1 h。介質(zhì)依次用0.5 cm3洗滌液洗滌1次，用0.5 cm3TBS緩沖液（30 mmol/dm3Tris-HCl，pH為7.4，150 mmol/dm3NaCl）洗滌2次，隨后用0.1 mol/dm3，pH為3.0的甘氨酸-鹽酸緩沖液洗脫蛋白復(fù)合物。所得的產(chǎn)物由上海鹿明生物科技有限公司進行LC-MSMS質(zhì)譜分析。

1.5 候選蛋白的克隆

從廈門大學(xué)韓家淮教授實驗室獲得包含目標基因的質(zhì)粒。根據(jù)基因序列設(shè)計引物（表1），以菌液為模板PCR擴增目的基因，在其兩端插入與載體插入位點兩側(cè)同源的15 bp序列。將pCMV-HA載體用Eco RI和Xho I雙酶切。用瓊脂糖凝膠電泳檢測并純化回收目的條帶與酶切載體之后，利用核酸外切酶III將目的基因連接到pCMV-HA載體中，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌。利用載體引物pCMV-R（表1）與目的基因引物進行菌落PCR篩選陽性克隆，送廈門鉑瑞生物公司測序。將驗證無誤的克隆進行擴大培養(yǎng)，利用Endo-Free Plasmid Maxi Kit（OMEGA公司）純化重組質(zhì)粒。

1.6 免疫共沉淀和Western blot分析

細胞轉(zhuǎn)染48 h后，用PBS洗滌1次，用裂解液（體積分數(shù)為1%的Nonidet-P40，500 mmol/dm3NaCl，50 mmol/dm3Hepes-KOH，5 mmol/dm3EDTA，pH為7.8，使用前加入2 mmol/dm3PMSF、2.5 mmol/dm3DTT和1 mmol/dm3蛋白酶抑制劑）冰上裂解1 h，于10 200 r/min下離心10 min去除沉淀。保留50 mm3上層清液用于后續(xù)分析。剩余上清液與50 mm3的anti-FLAGM2親和凝膠珠在4℃孵育4 h。收集介質(zhì)，用預(yù)冷的洗滌液（體積分數(shù)為0.2%的Nonidet-P40，TBS緩沖液，2 mmol/dm3PMSF，2.5 mmol/dm3DTT，1 mmol/dm3蛋白酶抑制劑）洗滌4次。用1×SDS loading buffer重懸介質(zhì)，煮沸，并于10 200 r/min離心去除沉淀，獲得蛋白樣品。用SDS-PAGE電泳分離蛋白樣品，并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。轉(zhuǎn)移了蛋白的PVDF膜用質(zhì)量分數(shù)為5%的脫脂牛奶（BD公司）封閉30 min后，用相應(yīng)的一抗孵育。用TBST緩沖液（TBS緩沖液，含體積分數(shù)為0.1%的Tween 20）洗滌3次之后，孵育AP偶聯(lián)的二抗。最后，用硝基藍四唑啉/5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸（NBT/BCIP，Roche公司）試劑顯色。

1.7 免疫熒光分析

細胞培養(yǎng)在玻璃蓋玻片上，轉(zhuǎn)染24 h后，取出蓋玻片，細胞依次用質(zhì)量分數(shù)為4%的多聚甲醛固定10 min，用體積分數(shù)為0.5%的Triton X-100通透1 min，隨后用PBS洗滌1次；細胞樣品用質(zhì)量分數(shù)為2%的BSA封閉30 min之后，依次用相應(yīng)的一抗和二抗雜交；隨后用1μg/cm3DAPI（4，6-聯(lián)脒-2-苯基吲哚）染細胞核2 min；在洗滌封片之后，通過共聚焦顯微鏡（Leica Tcs SP5，德國徠卡公司）分析蛋白的亞細胞定位。

2 結(jié)果與討論

2.1 串聯(lián)親和純化與質(zhì)譜篩選WSV403的相互作用蛋白

研究一個蛋白的相互作用因子是了解該蛋白功能的一個重要途徑。在本研究中，我們利用串聯(lián)親和純化以及質(zhì)譜鑒定的技術(shù)對WSSV極早期蛋白WSV403相互作用因子進行了篩選。由于缺乏WSSV宿主動物（包括對蝦和螯蝦）的基因組以及蛋白信息，也沒有能夠高效重組表達外源基因的細胞系，本研究利用哺乳動物表達系統(tǒng)來進行蛋白表達和親和純化實驗。首先將WSV403基因克隆到慢病毒表達載體中，與2個Strep以及1個FLAG標簽融合表達；利用重組慢病毒對293T細胞進行感染，進一步利用嘌呤霉素對陽性細胞進行篩選，獲得了穩(wěn)定表達WSV403的293T細胞。我們分別將穩(wěn)定表達WSV403的293T細胞和表達空載體的細胞（陰性對照）裂解，用親和Strep以及FLAG標簽的介質(zhì)純化裂解液中的帶有兩種標簽的蛋白及其復(fù)合體，并進行蛋白質(zhì)譜分析，鑒定復(fù)合物中的蛋白。將來源于WSV403穩(wěn)定表達株的產(chǎn)物與陰性對照組比對，剔除在陰性細胞中也存在的非特異性粘附蛋白。獲得15個可能與WSV403結(jié)合的候選蛋白，其中核轉(zhuǎn)運蛋白（KPNA6）、絲/蘇氨酸蛋白磷酸酶2A 65 kDa（PPP2RIA）、striatin（STRN）、纖維原細胞生長因子受體致癌基因伴侶（FGFRIOP）和核孔蛋白50（NUP50）等蛋白分值較高，說明它們與WSV403結(jié)合的可能性較大，因此我們將進一步克隆這些蛋白的基因并分析它們與WSV403的相互作用。

2.2 候選相互作用蛋白的克隆

從廈門大學(xué)韓家淮教授實驗室獲得包含KPNA6、PPP2RIA、STRN、FGFRIOP和NUP50基因cDNA的重組大腸桿菌，以菌液為模板，利用相應(yīng)的引物（表1）進行PCR擴增，獲得了上述基因的cDNA。然后利用LIC克隆法，將目的基因插入pCMV-HA載體，得到重組質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌。利用菌落PCR鑒定含有插入片段的克?。▓D1），并進一步測序分析。結(jié)果表明我們成功地獲得了FGFRIOP、STRN、PPP2RIA、NUP50和KPNA6基因的重組表達質(zhì)粒pCMV-FGFRIOP-HA、pCMV-STRN-HA、pCMVPPP2RIA-HA、pCMV-NUP50-HA和pCMV-KPNA6-HA。在這些質(zhì)粒中，候選相互作用蛋白與HA標簽融合表達。

圖1 目的基因重組表達質(zhì)粒的菌落PCR鑒定Fig.1 Identification of recombinant gene expression plasmid by colony PCR

2.3 候選蛋白與WSV403相互作用分析

為了鑒定WSV403與這些候選蛋白的相互作用，我們將候選蛋白的重組表達載體分別和pcDNA3.1-WSV403-FLAG共轉(zhuǎn)染。同時，我們也構(gòu)建了突變了Ring-H2結(jié)構(gòu)域突變體WSV403H348T，以分析這些互作與Ring-H2結(jié)構(gòu)域的關(guān)系。此外，本實驗中我們使用單獨過表達候選蛋白的細胞作為陰性對照。轉(zhuǎn)染48 h后，用anti-FLAGM2親和凝膠珠免疫沉淀FLAG-WSV403蛋白復(fù)合體，利用anti-HA及anti-FLAG抗體檢測免疫沉淀復(fù)合物中的蛋白。

結(jié)果顯示外源蛋白均可以在293T細胞中正常表達（圖2）。候選蛋白中，KPNA6（圖2a）、PPP2RIA（圖2b）和STRN（圖2c）可以與WSV403或者WSV403H348T相互作用，而NUP50（圖2d）與FGFRIOP（圖2e）均不能與WSV403或WSV403H348T相互作用。

2.4 WSV403與候選蛋白的亞細胞定位

為了進一步證實WSV403與上述蛋白之間的相互作用，我們在293T細胞中共表達目標蛋白和WSV403/WSV403H348T（圖3），通過免疫熒光實驗，分析兩者的亞細胞定位。

單獨過表達WSV403時，該蛋白在細胞質(zhì)中呈點狀分布（圖3a）；突變Ring-H2結(jié)構(gòu)域的突變體WSV403H348T，則均勻分布于細胞質(zhì)（圖3b）。

當候選蛋白與WSV403或者WSV403H348T共表達時，蛋白在細胞中定位情況如圖4、5所示。當FGFRIOP與WSV403（圖4a）共表達，兩者共定位于細胞膜和細胞核附近；當FGFRIOP與WSV403H348T共表達時（圖5a），則兩者均勻分布于細胞質(zhì)。當WSV403或者WSV403H348T分別與KPNA6（圖4b、5b）和NUP50（圖4c、5c）共表達時，KPNA6和NUP50均分布于細胞核，與WSV403和WSV403H348T均不存在共定位。當WSV403分別與PPP2RIA（圖4d）以及STRN（圖4e）共表達時，它們呈點狀共定位于細胞質(zhì)。而當WSV403H348T分別與PPP2RIA（圖5d）及STRN（圖5e）共表達時，它們都均勻分布于細胞質(zhì)中。

2.5 討論

泛素化是一種重要的蛋白翻譯后修飾，主要表現(xiàn)在降解細胞內(nèi)蛋白和調(diào)節(jié)蛋白功能［20-23］。病毒可借助泛素化過程調(diào)控宿主細胞的生理活動，使得細胞內(nèi)環(huán)境利于病毒感染復(fù)制。WSSV的E3連接酶WSSV222參與泛素化過程和腫瘤抑制蛋白的降解，從而抑制細胞的凋亡，保障病毒復(fù)制的進程［24］。同樣，蛋白WSV403也屬于E3連接酶。前期的工作已經(jīng)證明了它具有自泛素化的活性［16］，但是對于該蛋白作用的底物以及它在病毒感染中所扮演的角色我們?nèi)匀徊磺宄?/p>

了解一個蛋白的相互作用因子是認識其功能的一個重要手段。本研究利用串聯(lián)親和純化以及質(zhì)譜鑒定的技術(shù)對WSSV極早期蛋白WSV403相互作用因子進行篩選。由于缺乏WSSV宿主動物的基因組以及蛋白信息，也沒有能夠高效重組表達外源基因的細胞系，本研究利用哺乳動物表達系統(tǒng)來進行蛋白表達和親和純化實驗，獲得了15個候選蛋白。我們進一步通過免疫共沉淀及免疫熒光對其中的5個蛋白KPNA6、PPP2RIA、STRN、FGFRIOP和NUP50與WSV403的相互作用進行了驗證。證實KPNA6、STRN和PPP2RIA與WSV403存在相互作用（圖2）。當WSV403的Ring-H2結(jié)構(gòu)域被突變之后，雖然蛋白的亞細胞定位發(fā)生了改變，但是它們與這3個蛋白的相互作用并沒有被破壞，這說明KPNA6、STRN和PPP2RIA與WSV403的結(jié)合與該結(jié)構(gòu)域是無關(guān)的。

圖2 WSV403與重組蛋白關(guān)系的Western-blot檢測結(jié)果Fig.2 Relationship between WSV403 and recombinant protein detected by Western-blot

圖3 WSV403蛋白及其突變體的亞細胞定位免疫熒光分析結(jié)果Fig.3 Immunofluorescence analysis of WSV403 protein and its mutant subcellular localization

圖4 WSV403蛋白和重組蛋白共表達時的亞細胞定位Fig.4 Subcellular localization in the co-expression of WSV403 protein and recombinant protein

對其他動物的研究表明，KPNA6能夠結(jié)合細胞質(zhì)中含有核定位信號的蛋白參與蛋白的入核運輸［25］；此外，該蛋白還可參與埃博拉病毒EBOV包涵體的形成和復(fù)制［26］。我們推測WSV403結(jié)合KPNA6以后也可能被運輸入核內(nèi)，促進WSSV基因組的入核，或者對宿主基因表達進行調(diào)控，幫助WSSV完成基因組復(fù)制。研究證實STRN是牛瘟病毒RNA聚合酶L蛋白的互作因子［27］，可能參與了該病毒的基因組復(fù)制。而且striatin家族蛋白在細胞中參與很多生理活動如細胞運輸、內(nèi)吞、細胞分裂。細胞表達定位分析表明STRN與WSV403在細胞質(zhì)存在點狀共定位（圖3e），因此我們推測WSV403結(jié)合STRN蛋白參與細胞運輸，幫助WSSV進入宿主細胞從而促進病毒感染。另外，絲/蘇氨酸磷酸酶PPP2RIA，可以與striatin家族形成STRIPAK多蛋白多功能復(fù)合體［28］，在囊泡運輸、細胞分裂、抑制凋亡等過程中發(fā)揮重要作用。這些研究表明WSV403與PPP2RIA相互作用很可能是將其泛素化，通過改變細胞磷酸化水平，調(diào)控WSSV的復(fù)制周期，以及抑制宿主細胞的凋亡為病毒復(fù)制創(chuàng)造條件。

3 結(jié)論

本研究利用串聯(lián)親和純化與質(zhì)譜技術(shù)篩選WSSV極早期蛋白WSV403的相互作用因子，通過免疫共沉淀和免疫熒光分析證明了WSV403與KPNA6、STRN和PPP2RIA存在相互作用，為深入研究WSV403的功能及其在病毒感染過程中的作用奠定了基礎(chǔ)。在接下來的工作中，我們將克隆蝦的同源基因并進一步分析WSV403與它們的相互作用，以及這種相互作用對病毒感染的重要性。