海南地區(qū)疑似肺結(jié)核患者非結(jié)核分枝桿菌感染特征

鐘業(yè)騰, 林明冠, 林 翀, 陳灼霖, 鄭文鑫, 裴 華

(海南醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院 1. 檢驗科； 2. 放射科，海南 ?？?570311)

非結(jié)核分枝桿菌(non-tuberculous Mycobacteria， NTM)是除了結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群(包括結(jié)核分枝桿菌、牛分枝桿菌、田鼠分枝桿菌、非洲分枝桿菌)與麻風(fēng)分枝桿菌外的一類抗酸染色陽性分枝桿菌的統(tǒng)稱，大部分為非致病菌[1-2]，至今已發(fā)現(xiàn)170余種，同時不斷發(fā)現(xiàn)新的菌種，廣泛存在于自然環(huán)境中。根據(jù)NTM的生長速度，可劃分為快生長分枝桿菌(rapidly growing mycobacteria， RGM)和慢生長分枝桿菌(slowly growing mycobacteria， SGM)兩種類型。NTM可以侵襲肺部、皮膚及骨髓等部位，其中最常見的是侵襲肺部引起肺部感染[3]，NTM肺部感染好發(fā)于有基礎(chǔ)肺部疾病的患者[4]，其與肺結(jié)核在臨床上難以單純地依靠臨床癥狀及影像學(xué)表現(xiàn)等特征加以鑒別，當患者痰抗酸桿菌涂片為陽性，而未進行分枝桿菌培養(yǎng)及鑒定，且又具有肺結(jié)核臨床相關(guān)癥狀及影像學(xué)表現(xiàn)時，臨床上極易誤診為結(jié)核病[5-7]，但NTM感染與結(jié)核病的治療方案明顯不同，這給臨床診療及防控帶來極大的挑戰(zhàn)。因此，NTM已成為威脅人類健康的重要公共衛(wèi)生問題，引起了社會廣泛關(guān)注[8-9]。近年來，國內(nèi)外部分地區(qū)相繼報道了當?shù)氐腘TM分離率、菌種構(gòu)成分布及耐藥性等情況，不同國家和地區(qū)存在差異[10-11]。海南地區(qū)地處亞熱帶沿海區(qū)，有獨特地理環(huán)境，但是海南地區(qū)有關(guān)NTM菌種分布、耐藥性及臨床特點等研究鮮見。為了解海南地區(qū)疑似肺結(jié)核患者的NTM菌種分布、耐藥性及臨床特點等情況，本研究通過收集海南醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院(即海南省結(jié)核病醫(yī)院，是海南省耐多藥結(jié)核病唯一診療醫(yī)院)疑似肺結(jié)核患者的痰、肺泡灌洗液等呼吸道標本進行分離培養(yǎng)鑒定及藥敏分析，以此了解NTM菌株的構(gòu)成分布及耐藥等情況，同時對NTM肺部感染患者的臨床資料進行分析，為本地區(qū)NTM肺部感染的預(yù)防及診治提供科學(xué)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 資料收集 收集2015年1月—2018年8月于海南醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院就診的疑似肺結(jié)核患者痰、肺泡灌洗液等呼吸道標本NTM分離情況及臨床資料。同一患者多次培養(yǎng)的NTM，只記錄研究期間第一次培養(yǎng)檢出的菌株。因臨床資料不全，無法鑒定菌種或無藥敏結(jié)果的疑似肺結(jié)核患者不納入研究。依據(jù)國家衛(wèi)生和計劃生育委員會頒發(fā)的《肺結(jié)核診斷》(WS 288—2017)判斷疑似肺結(jié)核病例[12]。

1.2 儀器與試劑 儀器：洗干儀、雜交儀、核酸快速提取儀和微陣列芯片掃描儀為北京博奧公司生產(chǎn)，基因擴增儀為杭州博日科技有限公司生產(chǎn)，BSC-1600ⅡB2型生物安全柜為蘇州安泰公司生產(chǎn)，恒溫培養(yǎng)箱為上海博迅公司生產(chǎn)。試劑：酸性、藥敏及鑒定羅氏培養(yǎng)基和抗酸桿菌染色液為珠海貝索公司生產(chǎn)，分枝桿菌菌種鑒定試劑盒及耐藥基因檢測試劑盒為北京博奧公司生產(chǎn)。

1.3 試驗方法

1.3.1 抗酸桿菌涂片、分枝桿菌培養(yǎng)及菌型鑒定 嚴格按照《結(jié)核病實驗室檢驗規(guī)程》[13]操作要求，分別采用萋尼染色法(冷染)進行涂片并鏡檢，改良羅氏培養(yǎng)法對疑似肺結(jié)核患者痰、肺泡灌洗液等呼吸道標本進行分離培養(yǎng)，利用PNB及TCH鑒定培養(yǎng)基進行初步區(qū)分結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis，MTB)和NTM。

1.3.2 NTM菌種鑒定 采用基因芯片法對結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群、胞內(nèi)分枝桿菌、堪薩斯分枝桿菌、鳥分枝桿菌、戈登分枝桿菌、瘰疬分枝桿菌、偶然分枝桿菌、土分枝桿菌、淺黃分枝桿菌、龜/膿腫分枝桿菌、草分枝桿菌、不產(chǎn)色分枝桿菌、金色分枝桿菌、海/潰瘍分枝桿菌、蘇爾加/瑪爾摩分枝桿菌、恥垢分枝桿菌和蟾蜍分枝桿菌等臨床上常見17種分枝桿菌菌種進行鑒定。其檢測原理是采用固化于支持物表面的DNA探針與標記的標本進行雜交，通過檢測雜交信號可快速、高通量地檢測標本中的核酸，從而鑒定出NTM菌種類型。標準菌株為由國家疾病控制與預(yù)防中心(CDC)結(jié)核病參比實驗室提供的H37Rv標準敏感株。

1.3.3 藥敏試驗 采用比例法藥敏試驗對分離菌株進行8種常用抗結(jié)核藥物的敏感試驗，藥敏培養(yǎng)基藥物濃度分別為異煙肼(INH)0.2 μg/mL、利福平(RFP)40 μg/mL、鏈霉素(SM)4 μg/mL、乙胺丁醇(EMB)2 μg/mL、卡那霉素(KM)30 μg/mL、氧氟沙星(OFX)2 μg/mL、丙硫異煙胺(PTH)40 μg/mL 和卷曲霉素(CPM)40 μg/mL。

1.3.4 質(zhì)量控制 根據(jù)質(zhì)量控制要求[13]，痰標本分枝桿菌分離培養(yǎng)的涂陽培陰率(涂陽培陰率=培養(yǎng)陰性的標本數(shù)/涂片陽性的標本數(shù)×100%)應(yīng)<10%，污染率(污染率=污染的培養(yǎng)管數(shù)量/培養(yǎng)管總數(shù)×100%)應(yīng)<5%。比例法藥敏試驗的高稀釋度菌液在對照培養(yǎng)基上生長的菌落數(shù)少于20個菌落，應(yīng)重復(fù)試驗。每年參加國家抗結(jié)核藥敏試驗熟練度考核及結(jié)核病分子診斷技術(shù)能力驗證。

2 結(jié)果

2.1 分離培養(yǎng)及菌種分類情況 2015年1月—2018年8月臨床共收集2 965份痰或肺泡灌洗液等呼吸道標本進行分枝桿菌分離培養(yǎng)，培養(yǎng)陽性率為35.0%(1 038/2 965)，其中涂陽培陰率為9.6%(66/689)，污染率為4.3%(255/5 930)，符合痰培養(yǎng)質(zhì)量控制要求。經(jīng)PNB及TCH鑒定，862份標本檢出MTB，占83.0%；182份標本檢出NTM，占17.5%；其中有6份標本同時檢出MTB和NTM。剔除重復(fù)病例和菌株，在篩選出的833份培養(yǎng)陽性標本中，712份標本檢出MTB，占85.5%；126份標本檢出NTM，占15.1%；其中有5份標本同時培養(yǎng)出MTB和NTM。126份初步鑒定為NTM的標本，最終經(jīng)菌種鑒定發(fā)現(xiàn)MTB占2.4%(3株)，非分枝桿菌屬細菌(1株仁川冢村氏菌，2株支氣管戈登氏菌)占2.4%。最終鑒定共有120份標本檢出NTM。

2.2 NTM感染類型分布 120份經(jīng)菌種鑒定為NTM的標本中，無法鑒定至種NTM占3.3%(4株)，最終116份標本中檢出118株NTM。單一NTM感染109例，占94.0%。其中快生長型分枝桿菌感染占45.9%(50例)，主要是以龜/膿分枝桿菌感染為主，占43.1%(47例)；慢生長型分枝桿菌感染占54.1%(59例)，主要是以胞內(nèi)分枝桿菌感染為主，占37.6%(41例)。7例患者(6.0%)標本中檢出兩種分枝桿菌，分為鳥分枝桿菌+胞內(nèi)分枝桿菌、MTB+龜/膿分枝桿菌、MTB+胞內(nèi)分枝桿菌、MTB+戈登分枝桿菌、MTB+偶然分枝桿菌5種混合感染。見表1。

2.3 NTM對抗結(jié)核藥物的耐藥情況 118株NTM藥敏試驗結(jié)果顯示，8種NTM對8種一、二線抗結(jié)核藥物呈不同程度的耐藥，對8種藥物的總耐藥率由高至低依次為：INH 96.6%、SM 92.4%、RFP 90.7%、OFX 90.7%、CPM 89.8%、KM 86.4%、EMB 62.7%、PTH 33.9%。見表2。耐6種及以上抗結(jié)核藥物的比率高達86.4%，其中對8種藥物全部耐藥比率達32.2%，耐5種以下僅占11.0%，快生長型NTM中對8種藥物全部耐藥的比率達69.8%。見表3。

表1 NTM感染類型分布情況

注：龜/膿腫分枝桿菌與偶然分枝桿菌為快生長型分枝桿菌；檢出的其他6種NTM菌株為慢生長型分枝桿菌

表2 118株NTM對8種抗結(jié)核藥物的耐藥率[%(株)]

表3 118株NTM對抗結(jié)核藥物的耐藥類型分布[%(株)]

2.4 NTM感染病例臨床資料 120例NTM肺部感染患者，參照納入和排除標準，剔除4例無法鑒定NTM菌種和8例臨床資料不全的病例，共有108例NTM肺部感染患者納入完整臨床資料分析(包括臨床表現(xiàn)及影像學(xué)資料等)。

2.4.1 一般資料 108例NTM肺部感染患者平均年齡為(60.6±14.2)歲，其中男性43例(39.8%)，年齡為(62.7±17.0)歲，女性65例(60.2%)，年齡為(59.3±11.9)歲，男女比例為0.66∶1。主要好發(fā)于中老年人，其中>50歲的患者有85例(78.7%)，見圖1。有88例(81.5%)來自農(nóng)村或農(nóng)場主要從事體力勞動的農(nóng)民或工人?；颊咧饕院Ｄ鲜⊙睾５貐^(qū)為主，中部地區(qū)相對少見，沿海的海口多達22例，東方14例，文昌12例，萬寧11例，澄邁10例，臨高9例，見圖2。

圖1 108例NTM感染患者的年齡分布

圖2 108例NTM感染患者來源地區(qū)分布

Figure2Area distribution of 108 patients with NTM infection

2.4.2 臨床特征 108例NTM肺部感染患者均有明顯的呼吸系統(tǒng)臨床癥狀，具體表現(xiàn)為咳嗽咳痰100例(92.6%)、盜汗7例(6.5%)、胸悶氣促35例(32.4%)、血痰或咯血31例(28.7%)、乏力7例(6.5%)、發(fā)熱18例(16.7%)、食欲減退47例(43.5%)、體重下降50例(46.3%)。

108例NTM肺部感染患者中患基礎(chǔ)疾病的情況：有結(jié)核病史84例(77.8%)、支氣管擴張22例(20.4%)、肺部感染45例(41.7%)、咯血21例(19.4%)、社區(qū)獲得性肺炎7例(6.5%)、慢性阻塞性肺疾病10例(9.3%)、呼吸衰竭7例(6.5%)。

2.4.3 影像學(xué)特征 108例NTM肺部感染患者肺部CT檢查結(jié)果：75例(69.4%)有繼發(fā)型肺結(jié)核，53例(49.1%)有肺部空洞，98例(90.7%)雙側(cè)肺部均累及，70例(64.8%)雙側(cè)胸膜肥厚，57例(52.8%)有支氣管擴張，19例(17.6%)伴有肺氣腫，37例(34.3%)顯示肺部感染影像。

3 討論

NTM是一群能引起從輕微的自限性皮膚感染到危及生命的全身感染的分枝桿菌。由于人們對其致病性的認知尚有不足，曾被認為對人類無致病性或弱致病性，但目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)多種與結(jié)核病臨床癥狀類似的病程長、治療困難的NTM感染。近年來，隨著NTM臨床實驗室診斷水平不斷提高，NTM感染引起的人類疾病呈上升趨勢，已引起社會高度關(guān)注。我國五次結(jié)核病流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示，NTM檢出率從4.2%增加到22.9%，NTM的分離率呈逐年上升趨勢[14]。雖然當前我國尚缺乏關(guān)于NTM全國性的大樣本研究數(shù)據(jù)，但根據(jù)現(xiàn)有關(guān)于NTM流行研究數(shù)據(jù)顯示，我國NTM感染分布具有氣候溫和地區(qū)高于寒冷地區(qū)，南方地區(qū)高于北方地區(qū)，沿海地區(qū)高于內(nèi)地地區(qū)等特點[15]。本研究中，在海南地區(qū)833例疑似肺結(jié)核患者分枝桿菌培養(yǎng)陽性呼吸道標本中，最終120例患者標本分離出NTM，NTM檢出率為14.4%，高于氣候寒冷的甘肅(4.83%)[16]和福建(10.2%)[17]地區(qū)，符合我國NTN流行氣候分布特征。

由于不同的NTM菌種引起疾病的治療方案有所不同，而未知病原體極易造成疾病病情的遷延不愈和出現(xiàn)耐藥，因此，準確快速的鑒定分枝桿菌菌種對臨床診療及流行病防控有重要意義。本研究主要采用基因芯片法對PNB/TCH鑒定為NTM的126株菌株進行檢測發(fā)現(xiàn)，其中3株為MTB，3株為非分枝桿菌屬細菌，提示在PNB/TCH鑒定時應(yīng)結(jié)合分子診斷學(xué)技術(shù)進行NTM菌種鑒定，防止耐PNB的MTB及非分枝桿菌屬細菌對PNB/TCH鑒定結(jié)果造成誤差。3株非分枝桿菌屬細菌外送檢驗進行16S rRNA鑒定，1株為仁川冢村氏菌，另2株為支氣管戈登氏菌，均屬于放線菌，抗酸染色弱陽性，在羅氏培養(yǎng)基上生長及形態(tài)特點與分枝桿菌屬極為相似，基因芯片法鑒定無法檢測到相關(guān)檢測信號，而其感染引發(fā)的肺部感染與NTM肺部感染臨床癥狀極為相似，容易誤診誤治。

在不同的國家和地區(qū)，NTM感染菌種構(gòu)成也存在差異。美國主要為鳥胞分枝桿菌復(fù)合群，英國的威爾士及英格蘭以堪薩斯分枝桿菌為主，而蘇格蘭則主要為瑪爾摩分枝桿菌[15]。韓國以鳥胞分枝桿菌復(fù)合群和龜/膿腫分枝桿菌復(fù)合群多見，我國福建和山東地區(qū)以鳥胞分枝桿菌復(fù)合群為主，北京地區(qū)以鳥胞分枝桿菌復(fù)合群和堪薩斯分枝桿菌為主，而上海、廣州地區(qū)則是以龜/膿腫分枝桿菌復(fù)合群為主[18]。本研究發(fā)現(xiàn)海南地區(qū)NTM感染患者中有109例患者為單一NTM感染，7例患者為兩種分枝桿菌混合感染，共鑒定出8種NTM菌種和5種混合感染模式，7例混合感染患者的NTM均在單一感染NTM菌種范圍內(nèi)，但也發(fā)現(xiàn)有5例患者是MTB+NTM混合感染模式，提示臨床應(yīng)注意這類患者，應(yīng)盡可能進行菌株分純再進行藥敏試驗，減少誤診漏診，尤其把敏感MTB誤診為MDR-TB。海南地區(qū)疑似肺結(jié)核患者中NTM感染最常見菌種為快生長型的龜/膿分枝桿菌，占43.1%，高于臺灣[19]和杭州[18]地區(qū)，可能是由于膿腫分枝桿菌復(fù)合群常與潮濕和高溫環(huán)境有關(guān)[20]，NTM菌種分布具有明顯的地域差異與氣候多樣性特征，因此，導(dǎo)致膿腫分枝桿菌復(fù)合群在我國南方的流行率較高。其次NTM菌種是胞內(nèi)分枝桿菌，占37.6%%，低于北京[21]和杭州[18]地區(qū)，可能與胞內(nèi)分枝桿菌在自然環(huán)境中的廣泛分布有關(guān)，尤其是在飲用水中。

NTM通常對常用抗結(jié)核藥物有很高耐藥率，本研究中118株NTM對一線抗結(jié)核藥的INH、RFP、SM和二線抗結(jié)核藥的OFX、KM、CPM的耐藥率均高達85%以上，僅對PTH的耐藥率低于35%，對8種抗結(jié)核藥物全部耐藥的比率高達32.2%，快生長分枝桿菌對8種藥物全部耐藥的比率高達69.8%，與文獻[18]報道一致。海南地區(qū)是肺結(jié)核及耐藥結(jié)核病高發(fā)區(qū)，臨床醫(yī)務(wù)人員在診療肺結(jié)核及耐多藥肺結(jié)核病的過程中，應(yīng)注意鑒別診斷肺結(jié)核和NTM肺部感染，并根據(jù)藥敏結(jié)果選擇多種抗結(jié)核藥物聯(lián)合用藥以提高治療效果。

NTM通常屬于機會性致病菌，NTM的毒力和致病性均比MTB低，其易感因素主要是免疫力下降。本研究通過對108例NTM肺部感染患者一般資料分析顯示：(1)NTM 感染好發(fā)于中老年患者，可能與隨著年齡增大，人體免疫功能逐漸減退有關(guān)。(2)在海南地區(qū)，NTM感染者中女性多于男性，與臺灣[11]、北京[21]及華東[3]等地區(qū)有所不同，但與美國女性患者感染率較高的情況相同[22-23]，可能與海南地區(qū)NTM肺部感染在不同的人群中有不同的機制和影響因素有關(guān)。(3)108例患者中有81.5%來自農(nóng)村或農(nóng)場從事體力勞動的農(nóng)民或工人，而本研究中圖2顯示，海南地區(qū)NTM分布呈沿海平原地區(qū)高于中部多山地區(qū)，說明海南地區(qū)NTM肺部感染可能與患者的工作環(huán)境及生活條件有密切的聯(lián)系，這也符合我國NTM流行的地理分布特征。

本研究發(fā)現(xiàn)，108例NTM肺部感染患者均以明顯呼吸系統(tǒng)臨床癥狀而就診。其臨床癥狀呈多樣性，主要有咳嗽咳痰、胸悶氣促、血痰或咯血、發(fā)熱、食欲減退及體重下降等肺結(jié)核典型臨床癥狀。臨床基礎(chǔ)疾病主要為支氣管擴張、肺部感染、咯血等肺結(jié)核常見并發(fā)癥。肺部CT主要顯示肺部空洞、支氣管擴張或伴有肺氣腫和肺部感染等繼發(fā)型肺結(jié)核的常見影像學(xué)表現(xiàn)。因此，根據(jù)這些研究結(jié)果，證實了單純地依靠臨床癥狀及肺部影像學(xué)表現(xiàn)難以將NTM肺部感染與肺結(jié)核進行鑒別，必須依靠病原學(xué)檢查才能獲得正確的診斷。而當前海南地區(qū)由于歷史經(jīng)濟文化原因，該地區(qū)基層醫(yī)院主要是依靠痰抗酸染色涂片、臨床癥狀及肺部影像學(xué)表現(xiàn)診斷肺結(jié)核，可能會將NTM肺部感染患者誤診為肺結(jié)核，而本研究中108例NTM肺部感染患者主要也是因懷疑患有肺結(jié)核而就醫(yī)，倘若此類患者未能及時培養(yǎng)鑒定出NTM，臨床上一線抗結(jié)核藥治療未見好轉(zhuǎn)，有可能會誤診為MDR-TB感染，因此，病原學(xué)檢查是診斷NTM肺部感染的關(guān)鍵。

本研究不足之處：(1)選用基因芯片法進行菌種鑒定，因方法學(xué)限定無法深入分析少見NTM菌種；(2)由于部分門診患者無法跟蹤采集完整病例資料，導(dǎo)致本研究中部分患者未能納入進行分析。這兩點不足之處雖會影響本研究結(jié)果，但是本研究結(jié)果對海南地區(qū)NTM感染的防控、診療及今后進一步研究NTM感染提供了數(shù)據(jù)支持。