草銨膦對轉(zhuǎn)基因抗草銨膦馬鈴薯田間雜草的防效及安全性評價(jià)

賈小霞 劉 石 齊恩芳 呂和平 文國宏李 掌 馬 勝 曲亞英

(1 甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院馬鈴薯研究所/甘肅省馬鈴薯種質(zhì)資源創(chuàng)新工程實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730070； 2 農(nóng)業(yè)部西北旱作馬鈴薯科學(xué)觀測實(shí)驗(yàn)站，甘肅 渭源 748201)

隨著馬鈴薯主糧化戰(zhàn)略的推進(jìn)，馬鈴薯種植面積日益擴(kuò)大。然而，隨著中國產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)的調(diào)整，大量農(nóng)村青壯年勞動力向非農(nóng)產(chǎn)業(yè)轉(zhuǎn)移，傳統(tǒng)的人工鋤草越來越不現(xiàn)實(shí)，草害問題越來越突出，嚴(yán)重影響了馬鈴薯的產(chǎn)量和品質(zhì)[1-2]，化學(xué)除草已成為現(xiàn)代農(nóng)業(yè)中不可缺少的管理手段和我國廣大農(nóng)業(yè)生產(chǎn)者所依賴的除草方式[3-4]。研究發(fā)現(xiàn)實(shí)踐中化學(xué)除草存在一定的不足，一方面，殺草譜廣、活性高的除草劑大多缺乏選擇性，在殺滅雜草的同時(shí)可能對本田作物產(chǎn)生藥害，影響作物品質(zhì)及產(chǎn)量[5-7]；另一方面，選擇性強(qiáng)的除草劑只能防治少數(shù)雜草，不能兼治田間多種雜草，達(dá)不到理想的防治效果[8]。通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)使農(nóng)作物獲得對廣譜滅生性除草劑的抗性，不僅可以克服除草劑的選擇性，提高除草效果，降低除草成本，而且可以增加作物的安全性[9]。因此，為了更有效地發(fā)揮除草劑對雜草的防除作用及解決除草劑使用過程中出現(xiàn)的負(fù)面問題，耐廣譜滅生性除草劑轉(zhuǎn)基因作物的推廣種植可能成為我國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的必然選擇和確保我國糧食安全的戰(zhàn)略需求[10]。

草銨膦是繼草甘膦之后又一性能優(yōu)良的滅生性除草劑，其在土壤中的半衰期為3～7 d[11]，具有活性高、毒性低、易分解、殘留低和環(huán)境兼容性好等特點(diǎn)，可防治對草甘膦和百草枯有抗性的頑固雜草[12]，且長期使用的環(huán)境安全也得到了肯定[13-14]，具有良好的應(yīng)用前景。草銨膦的抗性基因Bar來自土壤吸水鏈霉菌，它編碼膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶(phosphinothricin acetyltransferase，PAT)，PAT使膦絲菌素(phosphinothricin，PPT)的自由氨基乙酰化從而對PPT解毒，使之不能抑制谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase, GS)的活性[15]。目前，馬鈴薯轉(zhuǎn)化Bar基因獲得草銨膦抗性的研究已有相關(guān)報(bào)道[16-18]，但多是將Bar基因作為篩選標(biāo)記基因用于篩選陽性植株，或作為目的基因進(jìn)行轉(zhuǎn)化，且僅限于試管苗抗性分析，尚缺乏陽性植株對草銨膦耐受性分析的報(bào)道?？钩輨┺D(zhuǎn)基因作物對目標(biāo)除草劑耐受性有一定限度，施藥劑量、施藥時(shí)期或施藥方式不當(dāng)均會對作物產(chǎn)生不同程度的藥害，甚至?xí)绊懽魑锏钠焚|(zhì)和最終產(chǎn)量[19-21]。為此，本試驗(yàn)選用隴薯3號轉(zhuǎn)Bar基因抗草銨膦馬鈴薯為研究對象，探究苗期噴施不同劑量的草銨膦對藥后不同時(shí)期雜草的數(shù)量，馬鈴薯生長、生理指標(biāo)，成熟期馬鈴薯塊莖營養(yǎng)品質(zhì)和單株產(chǎn)量的影響，考察成熟期土壤和塊莖中草銨膦的殘留情況，以明確草銨膦對轉(zhuǎn)基因抗草銨膦馬鈴薯田間雜草的防效及對馬鈴薯和環(huán)境的安全性，為草銨膦的科學(xué)使用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

抗草銨膦轉(zhuǎn)基因馬鈴薯由甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院馬鈴薯研究所種質(zhì)資源與生物技術(shù)研究室提供。供試草銨膦為10%水劑，由河北威遠(yuǎn)生化農(nóng)藥有限公司生產(chǎn)；草銨膦噴施器具為HD400背負(fù)式電動噴霧器(河北威遠(yuǎn)生化農(nóng)藥有限公司)。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)于2018年在甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州試驗(yàn)地隔離區(qū)進(jìn)行。試驗(yàn)共設(shè)4個(gè)處理，即于馬鈴薯出苗后20 d(2018年6月22日)分別噴施有效成分為0(清水對照，G0)、847.5(G1)、1 271.25(G2)和1 695(G3)g·hm-2的草銨膦，用水量均為 450 kg·hm-2。每個(gè)處理 3 次重復(fù)，小區(qū)面積15.44 m2(行長4.6 m，6行區(qū)，小區(qū)寬3.36m)，采用隨機(jī)區(qū)組排列，小區(qū)之間設(shè)隔離帶，寬度為1 m。小區(qū)間實(shí)行定向莖葉噴霧處理，噴霧周到均勻。

1.3 測定指標(biāo)及方法

1.3.1 馬鈴薯農(nóng)藝性狀和產(chǎn)量調(diào)查 分別于施藥后30和45 d，每小區(qū)隨機(jī)選擇6株馬鈴薯，采用尺子測量植株株高[22](植株地上部分莖基部到生長點(diǎn)的高度，cm)；采用數(shù)顯游標(biāo)卡尺緊貼土壤層測量莖粗，每株植株從正面和側(cè)面兩個(gè)方向測量，用平均值表示植株的莖粗(mm)[22]；根莖葉干重(g)采用烘干法測定，即測完鮮重(g)后，于105℃殺青30 min，80℃烘干至恒重。成熟期(10月2號)收獲的馬鈴薯塊莖按小區(qū)進(jìn)行產(chǎn)量測定。

1.3.2 馬鈴薯生理指標(biāo)和塊莖品質(zhì)的測定 分別于施藥后1、4、11和20 d統(tǒng)一采集倒數(shù)第4片完全展開的葉片帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行生理指標(biāo)的測定；收獲時(shí)每小區(qū)篩選長勢一致的馬鈴薯3株，每處理共計(jì)9株，分別裝袋帶回實(shí)驗(yàn)室，用水沖洗表面泥土等雜質(zhì)，晾干后用于干物質(zhì)、淀粉、還原糖、維生素C和粗蛋白含量等品質(zhì)性狀的測定。

參照鐘鵬等[23]的方法測定丙二醛(malondialdehyde, MDA)和游離脯氨酸(proline，Pro)含量；參照唐鑫華等[24]的方法測定超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性；參考李雪等[25]的方法測定過氧化氫酶(catalase，CAT)活性。

參照GB 5009.3-2016[26]采用直接干燥法測定干物質(zhì)含量；參照NY/T 11-1985[27]采用旋光法測定淀粉含量；參照GB/T 5009.7-2016[28]采用直接滴定法測定還原糖含量；參照GB/T 5009.86-2016[29]采用熒光法測定維生素C含量；參照GB 5009.5-2016[30]采用凱氏定氮法測定粗蛋白含量。

1.3.3 草銨膦的除草效果和對馬鈴薯藥害的調(diào)查 施藥后15 d，肉眼觀察不同濃度草銨膦對雜草防治效果；分別在施藥后30和45 d，每小區(qū)按對角線取面積為1 m2的3個(gè)點(diǎn)，統(tǒng)計(jì)每個(gè)點(diǎn)的雜草數(shù)目，施藥后45 d統(tǒng)計(jì)完雜草數(shù)目后，整株拔出雜草并稱量地上部分的鮮重，按照公式分別計(jì)算雜草株防效(%)和鮮重防效(%)：

株防效=(對照區(qū)雜草株數(shù)-處理區(qū)雜草株數(shù))/對照區(qū)雜草株數(shù)×100%

(1)

鮮重防效=(對照區(qū)雜草鮮重-處理區(qū)雜草鮮重)/對照區(qū)雜草鮮重×100%

(2)。

分別于藥后1、4、11和20 d, 對馬鈴薯表型進(jìn)行仔細(xì)觀察，調(diào)查草銨膦是否對馬鈴薯造成藥害以及藥害癥狀。藥害癥狀參照馬國蘭等[31]的方法進(jìn)行描述。

1.3.4 土壤和馬鈴薯塊莖中草銨膦殘留測定 收獲時(shí)，采集各小區(qū)的土壤和馬鈴薯塊莖，送至江蘇安舜技術(shù)服務(wù)有限公司，參照GB 23200.108-2018[32]采用LC-MS法進(jìn)行草銨膦殘留檢測。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用 Microsoft Office Excel 2010整理數(shù)據(jù)；DPS V3.01軟件進(jìn)行單因素方差(One-way analysis，ANOVA)統(tǒng)計(jì)分析；Duncan’s 法分析試驗(yàn)結(jié)果的差異顯著性。所有數(shù)據(jù)均為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度草銨膦對轉(zhuǎn)基因抗草銨膦馬鈴薯生長的影響

由表1可知，與噴施清水對照(G0)相比，施藥后30 d各施藥處理的馬鈴薯苗均生長正常，未出現(xiàn)任何不良表現(xiàn)，說明試驗(yàn)劑量的草銨膦對馬鈴薯沒有產(chǎn)生明顯藥害。藥后30 d，各處理組馬鈴薯平均株高為58.28～64.44 cm，平均莖直徑為9.54～10.49 mm，根莖葉的平均株鮮重為192.81～239.08 g，根莖葉的平均株干重為21.95～27.76 g。各處理間平均株高和莖直徑存在差異，但均未達(dá)到顯著水平。各劑量草銨膦處理的根莖葉鮮重、干重差異不大，但均顯著高于清水對照(G0)。

表1 施藥后30 d不同濃度草銨膦對轉(zhuǎn)基因抗草銨膦馬鈴薯生長的影響Table 1 Effects of different concent glufosinate on growth of transgenic glufosinate-resistant potato on 30 days after spraying glufosinate

注: 同列不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下同。

Note: Different lowercase letters in the same column indicate significant difference at 0.05 level. The same as following.

由表2可知，施藥后45 d，各處理馬鈴薯平均株高為63.17～67.39 cm，平均莖直徑為9.90～10.71 mm，根莖葉的平均株鮮重為205.50～239.87 g，根莖葉的平均株干重為22.97～31.47 g，收獲時(shí)各處理區(qū)馬鈴薯平均單株產(chǎn)量為415.13～649.77 g。各處理間株高和莖直徑的差異均未達(dá)到顯著水平；各施藥處理間的根莖葉鮮重、干重?zé)o顯著差異，但均顯著高于清水對照(G0)。收獲時(shí)單株產(chǎn)量依次表現(xiàn)為G3(649.77 g)>G2(610.08 g)>G1(558.82 g)>G0(415.13 g)，各施藥處理的單株產(chǎn)量隨著草銨膦濃度的增大而顯著增加，且均顯著高于清水對照(G0)。

因此，施藥后30 和45 d，試驗(yàn)劑量的草銨膦對抗草銨膦馬鈴薯的生長發(fā)育并無負(fù)面影響，與清水對照(G0)相比，試驗(yàn)劑量草銨膦均可以顯著提高單株產(chǎn)量。

表2 施藥后45 d時(shí)不同濃度草銨膦對轉(zhuǎn)基因抗草銨膦馬鈴薯生長和收獲時(shí)單株產(chǎn)量的影響Table 2 Effects of different concent glufosinate on growth of transgenic glufosinate-resistant potato on 45 days after spraying glufosinate and per plant yield at harvest time

2.2 不同濃度草銨膦對轉(zhuǎn)基因抗草銨膦馬鈴薯塊莖營養(yǎng)品質(zhì)的影響

由表3可知，收獲后各處理馬鈴薯塊莖平均淀粉含量為16.24%～16.93%，平均干物質(zhì)含量為17.83%～18.85%，平均粗蛋白含量為2.52%～2.68%，平均還原糖含量為0.42%～0.48%，平均維生素C含量為15.41～15.86 mg·100g-1。各處理間各指標(biāo)的差異均未達(dá)到顯著水平，說明試驗(yàn)劑量的草銨膦對抗草銨膦馬鈴薯的塊莖營養(yǎng)品質(zhì)未造成明顯的負(fù)面影響。

表3 不同濃度草銨膦對轉(zhuǎn)基因抗草銨膦馬鈴薯塊莖營養(yǎng)品質(zhì)的影響Table 3 Effects of different concent glufosinate on nutritional quality in tuber of transgenic glufosinate-resistant potato

2.3 不同濃度草銨膦對轉(zhuǎn)基因抗草銨膦馬鈴薯葉片生理指標(biāo)的影響

由圖1可知，施藥后1～20 d，Pro含量隨著施藥時(shí)間的延長呈先降低后升高的趨勢，而MDA含量呈先升高后降低的趨勢，相同時(shí)期下，各處理的馬鈴薯葉片Pro和MDA含量均不存在顯著性差異。

注：不同小寫字母表示施藥后同一時(shí)間下各處理間差顯著(P<0.05)。下同。Note: Different lowercase letters indicate significant difference among treaments at the same time after spraying glufasinate(P<0.05). The same as following.圖1 不同濃度草銨膦對轉(zhuǎn)基因抗草銨膦馬鈴薯葉片Pro含量和MDA含量的影響Fig.1 Effects of different concent glufosinate on concent of Pro and MDA in leaves of transgenic glufosinate-resistant potato

圖2 不同濃度草銨膦對轉(zhuǎn)基因抗草銨膦馬鈴薯葉片CAT活性和SOD活性的影響Fig.2 Effects of different concent glufosinate on activity of CAT and SOD in leaves of transgenic glufosinate-resistant potato

由圖2可知，施藥后1～20 d，CAT活性隨著施藥后時(shí)間的延長呈先升高后降低再升高的趨勢，SOD活性呈降低的趨勢(除G3外)。施藥后1和11 d，與清水對照(G0)相比，施藥處理的馬鈴薯葉片CAT活性均無明顯差異；施藥后4和20 d時(shí)，各處理的CAT活性有差異，但未達(dá)到顯著水平。施藥后1 d，與G0相比，施藥處理馬鈴薯葉片SOD活性均無明顯差異；施藥后4和11 d，G3處理葉片SOD活性顯著高于其他處理，但G1、G2與G0間均無顯著差異；施藥后20 d時(shí)，G3處理葉片SOD活性基本恢復(fù)到正常水平，與其他處理間無顯著差異。表明噴施試驗(yàn)劑量的草銨膦對抗草銨膦馬鈴薯葉片的Pro和MDA含量、CAT和SOD活性均無顯著影響。

2.4 不同濃度草銨膦對抗草銨膦轉(zhuǎn)基因馬鈴薯田行間雜草的防治效果

在試驗(yàn)地塊中雜草種類較多，主要包括闊葉雜草馬齒莧(PortulacaoleraceaL.)、灰藜(ChenopodiumglaucumL.)、田旋花(ConvolvulusarvensisL.)、薺菜(Capsellabursa-pastorisL. Medic.)、反枝莧(AmaranthusretroflexusL.)、刺兒菜(CirsiumsegetumBungeeL.)和苣荬菜(SonchusbrachyotusDC)；禾本科雜草狗尾草(SetairaviridisL. Beauv.)、牛筋草(EleusineindicaL. Gaertn.)、旱稗(Echinochloahispidula(Retz.) Nees.)和野燕麥(AvenafatuaL.)。本研究沒有按雜草名稱逐一列舉，而是按照闊葉雜草和禾本科雜草兩大類進(jìn)行統(tǒng)計(jì)調(diào)查。

由表4可知，施藥后30 d，各處理對闊葉雜草的平均株防效為39.75%～72.42%，株防效依次表現(xiàn)為G3(72.42%)>G2(58.26%)>G1(39.75%)；對禾本科雜草的平均株防效為54.30%～82.89%，株防效依次表現(xiàn)為G3(82.89%)>G2(64.44%)>G1(54.30%)。無論是闊葉雜草還是禾本科雜草，3個(gè)不同施藥劑量對雜草的株防效差異性均達(dá)到極顯著水平(P<0.01)，且隨著施藥劑量的增加株防效極顯著增加。施藥后45 d，各處理對闊葉雜草的平均株防效為31.90%～70.26%，株防效依次表現(xiàn)為G3(70.26%)>G2(56.00%)>G1(31.90%)；對禾本科雜草的平均株防效為52.51%～80.00%，株防效依次表現(xiàn)為G3(80.00%)>G2(62.43%)>G1(52.51%)。施藥后45 d各處理對闊葉雜草的平均鮮重防效為39.51%～86.64%，鮮重防效依次表現(xiàn)為G3(86.64%)>G2(54.78%)>G1(39.51%)；對禾本科雜草的平均鮮重防效為61.24%～85.23%，鮮重防效依次表現(xiàn)為G3(85.23%)>G2(70.34%)>G1(61.24%)，即G3對各類雜草的株防效和鮮重防效極顯著高于其他2個(gè)處理(P<0.01)。

表4 不同濃度草銨膦對轉(zhuǎn)基因抗草銨膦馬鈴薯田間雜草的防治效果Table 4 Control effect of different concent glufosinate to weeds in field of transgenic glufosinate-resistant potato

注: 不同小寫字母表示不同施藥劑量間差異顯著(P<0.05)；不同大寫字母表示不同施藥劑量間差異極顯著(P<0.01)。

Note: Different lowercasec letters mean significant difference among different dasages of glufosinate at 0.05 level. Different capital letters mean extremely significant difference among different dasages of glufosinate at 0.01 level.

2.5 土壤和馬鈴薯塊莖中的草銨膦殘留分析

由表5可知，各處理的土壤和塊莖中草銨膦的檢出量均小于規(guī)定量，未檢出草銨膦，表明試驗(yàn)劑量的草銨膦均可以用于抗草銨膦轉(zhuǎn)基因馬鈴薯田間雜草的防治，不會產(chǎn)生農(nóng)藥殘留危害。

3 討論

20世紀(jì)90年代轉(zhuǎn)基因作物開始商業(yè)化種植以來，關(guān)于抗除草劑轉(zhuǎn)基因作物田目標(biāo)除草劑施用的研究也隨即展開，除草劑施用時(shí)間和施用劑量已成為研究熱點(diǎn)[33-36]。本研究中，在出苗20 d時(shí)，分別用含有效成分0、847.50、1 271.25、1 695.00 g·hm-2草銨膦藥劑定向噴施雜草和轉(zhuǎn)基因抗草銨膦馬鈴薯莖葉，從安全性來看，各藥劑定向噴霧施用于轉(zhuǎn)基因抗草銨膦馬鈴薯未產(chǎn)生明顯的藥害癥狀，與清水對照相比，收獲時(shí)各供試濃度均表現(xiàn)出明顯的增產(chǎn)作用，這與楊益善等[33]關(guān)于幼苗期噴施150～750 g·hm-2草銨膦對耐除草劑水稻產(chǎn)生藥害并產(chǎn)量呈下降趨勢的研究結(jié)果不同，這種差異可能與供試作物不同有關(guān)。即使在常規(guī)劑量下，除草劑對作物也是一種脅迫，有些作物表觀上無明顯的藥害癥狀，但是這種脅迫可能會引起作物體內(nèi)生理特性的復(fù)雜變化[37]。本研究中，除根莖葉鮮干重顯著高于清水對照外，各處理馬鈴薯葉片的MDA和Pro含量、CAT活性，在藥后各時(shí)期與清水對照無顯著差異；藥后4和11 d，G3處理葉片SOD活性雖顯著高于其他處理，但藥后20 d時(shí)，G3葉片基本恢復(fù)到正常水平，與其他處理間無顯著差異。各施藥處理的馬鈴薯株高、莖直徑和薯塊營養(yǎng)品質(zhì)與清水對照也無顯著差異，說明試驗(yàn)劑量的草銨膦對馬鈴薯生理生化特性影響不大，這與姜偉麗等[34]的研究結(jié)果一致。

表5 草銨膦殘留檢測結(jié)果Table 5 Test results of glufosinate residues

從防治效果來看，綜合施藥后30和45 d結(jié)果，與清水對照相比，3種劑量的草銨膦對雜草均達(dá)到顯著防除效果，其中僅G3處理(有效成分1 695.00 g·hm-2)對闊葉雜草的平均株防效達(dá)到70%以上，對禾本科雜草的平均株防效達(dá)80%以上，其他處理對兩類雜草的株防效均在70%以下；G3處理(有效成分1 695.00 g·hm-2)對兩類雜草的平均鮮重防效均達(dá)85%以上，說明有效成分1 695.00 g·hm-2草銨膦藥劑對轉(zhuǎn)基因抗草銨膦馬鈴薯田行間雜草的防治效果最佳。因此，采用1 695.00 g·hm-2草銨膦藥劑可以有效防除轉(zhuǎn)基因抗草銨膦馬鈴薯田行間雜草，既不會對馬鈴薯造成藥害，也不會產(chǎn)生農(nóng)藥殘留危害。草銨膦對抗草銨膦作物安全劑量可高達(dá)2 000 g·hm-2以上，使用高劑量草銨膦對轉(zhuǎn)基因作物有一定的傷害，但對產(chǎn)量影響不大[19，35]。本研究僅在轉(zhuǎn)基因抗草銨膦馬鈴薯的苗期，選擇推薦使用量的高、中、低劑量對馬鈴薯和田間雜草進(jìn)行莖葉噴霧，調(diào)查草銨膦對田間雜草防治效果，同時(shí)分析了草銨膦對馬鈴薯及環(huán)境的安全性。而關(guān)于草銨膦對其他生育時(shí)期田間雜草的防除效果及馬鈴薯對更高劑量草銨膦的耐受性還有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，在轉(zhuǎn)基因抗草銨膦馬鈴薯的苗期，噴施不同劑量(1 695、1 271.25和847.5 g·hm-2)的草銨膦對雜草都有一定的防除效果，其中含有效成分1 695 g·hm-2的草銨膦對雜草的防治效果最好，株防效和鮮重防效均達(dá)70%以上。各劑量草銨磷不僅沒有對馬鈴薯造成藥害，在土壤和馬鈴薯塊莖中也沒有殘留，而且可以明顯提高馬鈴薯的單株產(chǎn)量。綜上，在轉(zhuǎn)基因抗草銨膦馬鈴薯的苗期，為了安全高效地防除雜草，可以用含有效成分1 695 g·hm-2的草銨膦進(jìn)行莖葉噴霧。