中國(guó)荷斯坦牛TLR1基因SNPs快速篩查及蛋白功能預(yù)測(cè)

吳恩蕓 任穩(wěn)穩(wěn) 李耀東 劉麗霞 曹 忻 張 麗

(西北民族大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730124)

Toll樣受體(Toll like recepter,TLRs)是一類(lèi)在生物進(jìn)化中比較保守的模式識(shí)別受體，能在微生物病原體感染機(jī)體早期做出免疫應(yīng)答，是機(jī)體天然免疫防御中的重要因子[1]，可直接識(shí)別病原體的病原相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecular patterns,PAMPs)進(jìn)而啟動(dòng)免疫應(yīng)答并建立獲得性免疫[2]。研究表明，不同組織中，TLRs的表達(dá)水平直接影響其對(duì)入侵該組織的病原體的識(shí)別作用[1]。近年來(lái)，關(guān)于Toll樣受體的研究主要集中在TLR2基因和TLR4基因上，而對(duì)TLR1基因的研究相對(duì)較少。TLR1基因?yàn)門(mén)LRs基因家族中的一員，是中國(guó)荷斯坦牛的重要免疫基因之一，同時(shí)還被認(rèn)為與中國(guó)荷斯坦牛乳房炎的易感性有密切的聯(lián)系[3]。陳亞冰等[1]研究發(fā)現(xiàn)TLR1基因能與TLR2基因形成異源二聚體，共同參與識(shí)別革蘭氏陽(yáng)性菌和陰性菌的細(xì)胞壁，并可以增強(qiáng)對(duì)PAMPs的特異性識(shí)別。全基因組掃描發(fā)現(xiàn)位于6號(hào)染色體上的TLR6-TLR1-TLR10基因族有顯著影響泌乳性狀和臨床乳房炎的數(shù)量性狀位點(diǎn)[2]。李春苗等[4]研究表明，荷斯坦牛的TLR1基因具有豐富的多態(tài)性，且TLR1基因中的H等位基因具有作為荷斯坦牛乳房炎抗性遺傳標(biāo)記的潛在有效性。Russell等[3]研究發(fā)現(xiàn)TLR1基因?qū)伤固古５娜榉垦椎陌l(fā)生具有顯著影響。

DNA池是將具有相同特征群體的個(gè)體DNA提取后按比例混合，再經(jīng)PCR擴(kuò)增測(cè)序后可直接檢測(cè)出SNPs的一種方法[5]，具有成本低、效率高的優(yōu)點(diǎn)。單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms, SNP)是指染色體基因組中單個(gè)核苷酸的突變而引起的DNA序列的多態(tài)性，以單個(gè)堿基的顛換、轉(zhuǎn)換、插入和缺失等形式存在[6]，是基因組水平上最常見(jiàn)的一種遺傳變異類(lèi)型[7-8]。研究發(fā)現(xiàn)，哺乳動(dòng)物中平均每300 ～1 000 bp就有1個(gè)SNP位點(diǎn)[9]。作為第三代分子標(biāo)記，SNP 標(biāo)記具有較大的發(fā)展?jié)摿?，目前已?jīng)建立多種SNP檢測(cè)分型技術(shù)[10]，如DNA芯片技術(shù)、陣列雜交分析、同源雜交法、直接測(cè)序法等[8]，而理想的SNP分型方法應(yīng)同時(shí)具備以下優(yōu)點(diǎn)：1)操作簡(jiǎn)單，可實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化；2)通量靈活，可根據(jù)需要加以選擇；3)分析速度快，數(shù)據(jù)處理容易；4)適應(yīng)性強(qiáng)，對(duì)樣本要求不高；5)結(jié)果可靠，費(fèi)用可接受。然而，目前的檢測(cè)方法尚無(wú)法完全滿(mǎn)足上述要求[11]。初芹等[12]認(rèn)為采用DNA池測(cè)序法篩選奶牛高信息量SNP標(biāo)記是可行和可信的。利用DNA混合池和直接測(cè)序技術(shù)對(duì)未知SNPs或已知SNPs等位基因頻率進(jìn)行快速篩查，可極大縮短試驗(yàn)周期，達(dá)到顯著減少基因組DNA消耗的目的。DNA池進(jìn)行直接測(cè)序時(shí)所要求的等位基因頻率最低為10%[13]。采用DNA池技術(shù)，方法簡(jiǎn)便，效率較高，且有效結(jié)合了PCR的特點(diǎn)，使試驗(yàn)?zāi)軌蚋佑行П憷剡M(jìn)行。

本試驗(yàn)以寧夏回族自治區(qū)的中國(guó)荷斯坦牛為研究對(duì)象，采用DNA池和直接測(cè)序法對(duì)中國(guó)荷斯坦牛TLR1基因SNPs進(jìn)行篩選，并對(duì)其進(jìn)行蛋白質(zhì)功能預(yù)測(cè)，以期明確TLR1基因?qū)χ袊?guó)荷斯坦牛免疫及育種方面的影響，為中國(guó)荷斯坦牛在分子遺傳相關(guān)方面的優(yōu)良育種提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集與基因組DNA提取

試驗(yàn)動(dòng)物：303頭中國(guó)荷斯坦牛，均來(lái)自寧夏賀蘭山奶業(yè)有限公司同一奶牛場(chǎng)，用醫(yī)用采血管從中國(guó)荷斯坦牛尾靜脈采血10 mL，20℃保存。采用DNA提取試劑盒(北京天根生化科技有限公司)從凍存中國(guó)荷斯坦牛血樣中提取基因組DNA，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA提取效果，采用UV2100紫外分光光度計(jì)(廈門(mén)群創(chuàng)科技有限公司)檢測(cè)每個(gè)DNA 樣品濃度，加雙蒸水調(diào)整DNA樣品濃度至100 ng·μL-1，每45個(gè)樣品構(gòu)建1個(gè)DNA池。

1.2 引物設(shè)計(jì)與PCR引物擴(kuò)增

根據(jù)NCBI收錄的中國(guó)荷斯坦牛TLR1基因的DNA序列(NM_001046504)，使用Primer 6.0軟件設(shè)計(jì)9對(duì)特異性引物(表1)，由蘇州金唯智生物有限公司合成。PCR擴(kuò)增的總體系為20 μL，包括上、下游引物各0.4 μL，蒸餾水7.4 μL，Taq PCR MasterMix 11.0 μL，DNA池模板0.8 μL。PCR擴(kuò)增程序：95℃預(yù)變性3 min；35個(gè)循環(huán)×(95℃變性30 s、60℃退火30 s、72℃延伸30 s)；72℃終延伸10 min，4℃保存。用1%瓊脂糖凝膠對(duì)擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行檢測(cè)。

表1 引物信息Table 1 The information of primers

1.3 SNPs的篩選和等位基因頻率估算

將經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后特異性良好的PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠回收試劑盒 (北京天根生化科技有限公司)純化后送至蘇州金唯智生物有限公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果使用BioEdit和MWSnap序列圖譜分析軟件標(biāo)尺測(cè)量中國(guó)荷斯坦牛各突變位點(diǎn)的等位基因峰圖高度，按照公式估算各等位基因頻率：

(1)

式中，F(xiàn)i：某突變位點(diǎn)等位基因頻率(i=1,2)；h1、h2：測(cè)序峰圖中該突變位點(diǎn)等位基因1和2的峰高度。

1.4 生物信息學(xué)分析

參照文獻(xiàn)[14]對(duì)中國(guó)荷斯坦牛TLR1基因編碼區(qū)進(jìn)行生物信息學(xué)分析，運(yùn)用在線軟件AAcompldent(http://web.expasy.org/protparam/)對(duì)中國(guó)荷斯坦牛TLR1基因編碼的蛋白質(zhì)進(jìn)行理化性質(zhì)分析，并對(duì)該基因編碼的蛋白質(zhì)進(jìn)行疏水性和親水性的分析(http://web.expasy.org/protscale/)；運(yùn)用在線分析軟件NetNGlyc 1.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/)對(duì)該基因編碼的蛋白質(zhì)進(jìn)行N-糖基化位點(diǎn)分析；利用PredictProtein在線服務(wù)器預(yù)測(cè)TLR1蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)；利用SWISS-MODEL同源建模方法構(gòu)建TLR1蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)模型，運(yùn)用PyMOL 1.8.6軟件對(duì)突變前后蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行對(duì)比并繪制結(jié)果視圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 中國(guó)荷斯坦牛TLR1基因DNA池PCR擴(kuò)增結(jié)果

中國(guó)荷斯坦牛DNA樣品擴(kuò)增結(jié)果經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)特異性好，與預(yù)期目的片段大小一致。擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果與NCBI中普通牛TLR1基因編碼區(qū)進(jìn)行BLAST比對(duì)共發(fā)現(xiàn)8個(gè)SNPs，分別將其命名為A61T-TLR1、C632A-TLR1、C1408T-TLR1、C1451T-TLR1、A1461G-TLR1、A1475C-TLR1、G1550A-TLR1、G1596A-TLR1(圖1)，導(dǎo)致5個(gè)氨基酸發(fā)生改變(表2)。其中A61T-TLR1錯(cuò)義突變使氨基酸由原來(lái)的賴(lài)氨酸(Lys)替換為甲硫氨酸(Met)；C632A-TLR1突變使苯丙氨酸(Phe)變?yōu)榱涟彼?Leu)；C1408T-TLR1突變使丙氨酸(Ala)替換為纈氨酸(Val)；A1461G-TLR1突變使異亮氨酸(Ile)轉(zhuǎn)變?yōu)槔i氨酸(Val)；G1596A-TLR1突變使纈氨酸(Val)轉(zhuǎn)變?yōu)楫惲涟彼?Ile)。

圖1 中國(guó)荷斯坦牛TLR1基因編碼區(qū)測(cè)序結(jié)果Fig.1 Sequencing of TLR1 coding region of Chinese Holstein cattle

2.2 SNPs篩查及等位基因頻率估算

由表2可知，C632A-TLR1、C1451T-TLR1、A1461G-TLR1、A1475C-TLR1和G1596A-TLRTLR15個(gè)SNPs位點(diǎn)的等位基因頻率在突變前后差值分別為0.190 4、0.130 4、0.117 6、0.136 4、0.181 8，而其他SNPs突變前后等位基因頻率的差值分別為0.555 6、0.416 6、0.481 4。前后兩組數(shù)據(jù)進(jìn)行對(duì)比發(fā)現(xiàn)C632A-TLR1、C1451T-TLR1、A1461G-TLR1、A1475C-TLR1和G1596A-TLR15個(gè)SNPs位點(diǎn)的等位基因頻率在突變前后差異較小，其余SNPs位點(diǎn)的等位基因頻率在突變前后均有明顯差異。

表2 中國(guó)荷斯坦牛TLR1基因的SNPs位點(diǎn)突變類(lèi)型及等位基因頻率估算Table 2 SNPs locus mutation types and estimation of allele frequency of TLR1 gene in Chinese Holstein cattle

2.3 SNPs中國(guó)荷斯坦牛TLR1基因影響mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)

由圖2可知，中國(guó)荷斯坦牛TLR1基因SNPs突變前后，mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，導(dǎo)致其最小自由能從突變前-628.48 kcal·mol-1增加到-482.80 kcal·mol-1，使mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性發(fā)生了改變，對(duì)蛋白質(zhì)的翻譯可能會(huì)造成一定的影響。

圖2 中國(guó)荷斯坦牛TLR1基因mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)Fig.2 mRNA secondary structure of TLR1 gene in Chinese Holstein cattle

2.4 中國(guó)荷斯坦牛TLR1蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分析

由表3、表4可知，中國(guó)荷斯坦牛TLR1基因編碼的蛋白質(zhì)由727個(gè)氨基酸組成，氨基酸組成數(shù)量和頻率如表4所示，其中亮氨酸(Leu)頻率最高，為14.3%，色氨酸(Trp)頻率最低，為1.4%，這2種氨基酸的頻率之差為12.9%。由表3可知，TLR1基因編碼的蛋白質(zhì)分子式為C3742H5871N979O1090S32，分子質(zhì)量為83.041 kDa，負(fù)電荷殘基總數(shù)(Asp + Glu)為72，正電荷殘基總數(shù)(Arg + Lys)為59。編碼產(chǎn)物不穩(wěn)定指數(shù)為45.64，大于40，說(shuō)明該蛋白質(zhì)屬于不穩(wěn)定蛋白。

2.5 中國(guó)荷斯坦牛TLR1蛋白質(zhì)疏水性/親水性預(yù)測(cè)和分析

由圖3可知，第523位異亮氨酸(Ile)疏水性最強(qiáng)(+3.400)；第700位谷氨酸(Glu)疏水性最弱(-2.800)。親水性氨基酸占整條氨基酸肽鏈的47.43%，疏水性氨基酸占整條氨基酸肽鏈的52.57%，總體表現(xiàn)為疏水性。由此推斷，TLR1蛋白質(zhì)是一種非可溶性蛋白。

表3 中國(guó)荷斯坦牛TLR1基因編碼蛋白質(zhì)理化特性Table 3 The encoding a protein physicochemical properties of TLR1 gene in Chinese Holstein cattle

2.6 中國(guó)荷斯坦牛TLR1蛋白質(zhì)信號(hào)肽分析

利用Signal P信號(hào)肽預(yù)測(cè)工具，采用神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)法對(duì)中國(guó)荷斯坦牛TLR1蛋白質(zhì)信號(hào)肽進(jìn)行分析，結(jié)果中包括C值、Y值、S值3個(gè)重要參數(shù)。其中，C值是指剪切位點(diǎn)值，每個(gè)氨基酸會(huì)有1個(gè)C值，在剪切位點(diǎn)處C值是最高的；S值是指每個(gè)氨基酸對(duì)應(yīng)的1個(gè)S值，在結(jié)果中有一條曲線顯示S值的變化趨勢(shì)，信號(hào)肽區(qū)域的S值較高；Y值是用來(lái)綜合考慮S值和C值的參數(shù)，較單獨(dú)考慮C值更為精確。因此，在一條系列中C值可能有不只一個(gè)較高的位點(diǎn)，但是剪切位點(diǎn)只有一個(gè)；此剪切位點(diǎn)可由Y-max值來(lái)推測(cè)，且該剪切位點(diǎn)處的S值陡峭，C值最大。中國(guó)荷斯坦牛TLR1蛋白質(zhì)信號(hào)肽分析結(jié)果如圖4所示，中國(guó)荷斯坦牛TLR1基因編碼產(chǎn)物C值為0.427，Y 值為0.586，S值為0.950，其切割點(diǎn)位于30位的氨基酸左右，分值曲線與TLR家族其他成員相似，由此預(yù)測(cè)荷斯坦牛TLR1蛋白質(zhì)存在信號(hào)肽。

表4 中國(guó)荷斯坦牛TLR1蛋白質(zhì)的氨基酸組成Table 4 The amino acid composition of TLR1 protein in Chinese Holstein cattle

2.7 中國(guó)荷斯坦牛TLR1蛋白質(zhì)的N-糖基化位點(diǎn)分析

由圖5可知，中國(guó)荷斯坦牛TLR1編碼蛋白質(zhì)中有 6個(gè)潛在N-糖基化位點(diǎn)，分別為Asn31、Asn96、Asn176、Asn260、Asn330、Asn369。蛋白質(zhì)糖基化是指糖蛋白的蛋白結(jié)構(gòu)共價(jià)結(jié)合糖鏈結(jié)構(gòu)形成的位點(diǎn)，與蛋白質(zhì)的高級(jí)結(jié)構(gòu)存在密切聯(lián)系，具有定向調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的功能，并參與包括細(xì)胞識(shí)別、細(xì)胞分化、發(fā)育、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、免疫應(yīng)答等各種重要的生命活動(dòng)[15]。研究發(fā)現(xiàn)在腫瘤、神經(jīng)退行性疾病、心血管病、代謝性疾病、免疫性疾病及感染性疾病中，均伴隨著蛋白質(zhì)糖基化異常的發(fā)生[16]。N-糖基化位點(diǎn)存在的越多，發(fā)生異常的可能性越大，對(duì)機(jī)體的免疫應(yīng)答亦會(huì)有影響。由此預(yù)測(cè)，中國(guó)荷斯坦牛TLR1基因可能與乳房炎的發(fā)生密切相關(guān)。

2.8 突變前后中國(guó)荷斯坦牛TLR1蛋白質(zhì)功能預(yù)測(cè)分析

由表5可知，多種與免疫相關(guān)因子的幾率相對(duì)較高，其中生長(zhǎng)因子的幾率為2.857，脅迫應(yīng)答和免疫應(yīng)答的幾率分別為2.534和1.447，幾率最高的是荷爾蒙，達(dá)到17.538。由此預(yù)測(cè)，中國(guó)荷斯坦牛TLR1基因在免疫調(diào)節(jié)和機(jī)體生理調(diào)節(jié)發(fā)揮著重要作用，與牛的抗病能力提高密切相關(guān)。

注：正值：親水；負(fù)值：疏水。Note:Positive value：Hydrophobicity. Negative value: Hydrophilicity.圖3 中國(guó)荷斯坦牛TLR1蛋白質(zhì)疏水性/親水性預(yù)測(cè)分析結(jié)果Fig.3 Hydrophobicity/hydrophilicity prediction results in Chinese Holstein cattle TLR1 protein

圖4 中國(guó)荷斯坦牛TLR1蛋白的信號(hào)肽分析結(jié)果Fig.4 Signal peptide analysis results in Chinese Holstein cattle TLR1 protein

圖5 中國(guó)荷斯坦牛TLR1蛋白質(zhì)的N-糖基化位點(diǎn)預(yù)測(cè)結(jié)果Fig.5 N-glycosylation site prediction results in Chinese Holstein cattle TLR1 protein

GO功能 GO function幾率 Probability信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo) Signal transduction1.271受體 Receptor0.047荷爾蒙 Hormone17.538結(jié)構(gòu)蛋白 Structural protein0.107運(yùn)載體 Transporter0.394離子通道 Ion channel1.386電壓門(mén)控離子通道 Voltage-gated ion channel0.136陽(yáng)離子通道 Cationic channel0.217轉(zhuǎn)錄 Transcription0.242轉(zhuǎn)錄調(diào)控 Transcriptional control0.248脅迫應(yīng)答 Stress response2.534免疫應(yīng)答 Immune response1.447生長(zhǎng)因子 Growth factor2.857金屬離子轉(zhuǎn)移 Metal ion transfer0.056

2.9 突變前后中國(guó)荷斯坦牛TLR1蛋白質(zhì)二、三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析

由表6、圖6可知，突變后，α-螺旋(alfar helix, Hh)變化量最大，含量增加了1.24%；β-折疊(beta sheet, Ee)、無(wú)規(guī)則卷曲(random coil, Cc)含量均有所減少，其中無(wú)規(guī)則卷曲降幅較大，為1.10%，β-折疊減少了0.14%；β-轉(zhuǎn)角(beta-turn, Tt)含量未發(fā)生改變。α-螺旋在中國(guó)荷斯坦牛TLR1基因編碼的蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)中含量最高，起主導(dǎo)作用，如果α-螺旋含量發(fā)生改變，該蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性也會(huì)發(fā)生一定的改變。

對(duì)TLR1蛋白進(jìn)行三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，可使用ESypred3D Web Server 1.0同源建模。由圖7可知，TLR1蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)是由多個(gè)α-螺旋和β-折疊構(gòu)成，且2種結(jié)構(gòu)平行交替排列，構(gòu)成一個(gè)彎曲狀螺旋結(jié)構(gòu)；突變前后TLR1蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)無(wú)明顯變化。

表6 中國(guó)荷斯坦牛TLR1基因突變前后二級(jí)結(jié)構(gòu)變化Table 6 Secondary structure changes before and after TLR1gene mutation in Chinese Holstein cattle /%

注：h:α-螺旋; e: β-折疊; t: β-轉(zhuǎn)角; c: 無(wú)規(guī)則卷曲。Note:h: α-helix. e: β-strand. t: β-turn. c: Random coil.圖6 中國(guó)荷斯坦牛TLR1蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.6 Prediction result of secondary structure in Chinese Holstein cattle TLR1 protein

注：紅色：α-螺旋；黃色：β-折疊；綠色：β-轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)則卷曲。Note: Red: α-helix. Yellow: β-strand. Green: β-turn and random coil.圖7 中國(guó)荷斯坦牛TLR1蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)模型預(yù)測(cè)Fig.7 Prediction result of tertiary structure in Chinese Holstein cattle TLR1 protein

3 討論

TLR1基因在動(dòng)物中的研究已有大量報(bào)道。Vahana等[17]研究發(fā)現(xiàn)在水牛肝臟、肺臟、脾臟、心臟中TLR1基因表達(dá)量較高，而在腎臟、卵巢中的表達(dá)量較低或不表達(dá)，而陳亞冰等[1]研究表明，TLR1基因在牦牛腎臟和卵巢中的表達(dá)量較高，并提出這可能與牦牛的局部組織免疫有關(guān)。Wang等[18]研究發(fā)現(xiàn)與水牛TLR1基因類(lèi)似，鯉魚(yú)的TLR1基因同樣在脾臟中表達(dá)量較高，但不同的是，其在鯉魚(yú)的后腸和口腔上皮細(xì)胞中表達(dá)較低，表明物種不同，TLR1基因表達(dá)的差異較大。Yang等[19]研究表明，非功能性TLR1602S/S 基因型可能通過(guò)減少Th1細(xì)胞反應(yīng)，降低幽門(mén)螺桿菌感染相關(guān)胃病的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。Hawn等[20]和Omueti等[21]研究發(fā)現(xiàn)TLR1多態(tài)性可調(diào)節(jié)對(duì)脂肽的先天性免疫應(yīng)答反應(yīng)和對(duì)廣譜致病菌的臨床易感性。Schumann等[22]研究表明，在廣東漢族人群樣本中，未發(fā)現(xiàn)在歐洲和非洲人群中高頻且與疾病易感的非同義 SNPs 位點(diǎn)+1805G/T (Ile602Ser，rs5743618)，且有證據(jù)表明，Ile602Ser位于TLR1跨膜區(qū)的SNP位點(diǎn)能調(diào)節(jié)細(xì)菌脂肽的識(shí)別，從而影響天然免疫應(yīng)答和對(duì)一些病原體的臨床易感性。在免疫研究方面，Moisan等[23]認(rèn)為T(mén)LR1作為T(mén)LRs的亞家族，表達(dá)于多種免疫細(xì)胞受體，在免疫應(yīng)答和感染中起重要作用，且與哮喘炎癥及氣道重塑有密切聯(lián)系，這與本研究結(jié)果類(lèi)似。本研究中，中國(guó)荷斯坦牛的TLR1基因與荷斯坦牛的免疫調(diào)節(jié)、生理調(diào)節(jié)均有密切聯(lián)系。

截至目前，已發(fā)現(xiàn)15種TLRs，其中包含人體內(nèi)TLR1-TLR10及TLR14；小鼠體內(nèi)TLR11-TLR13；雞體內(nèi)存在TLR15[24]，且與其抗病力顯著相關(guān)[5]；對(duì)荷斯坦牛TLRs基因多態(tài)性的研究主要集中在TLR2和TLR4基因，而國(guó)內(nèi)關(guān)于對(duì)荷斯坦牛TLR6基因的研究[25-26]尚鮮見(jiàn)報(bào)道，而對(duì)中國(guó)荷斯坦牛TLR1基因的研究更為稀少，李春苗等[4]發(fā)現(xiàn)荷斯坦牛TLR1編碼區(qū)(coding sequence, CDS)有4個(gè)SNP突變，但僅一個(gè)是非同義突變。Russell 等[3]對(duì)TLR1基因5′端和CDS區(qū)SNP突變進(jìn)行了檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)-79.T>G和3′端UTR區(qū)+2 463C>T顯著影響臨床乳房炎(clinicalmastitis, CM)發(fā)生。陳亞冰等[1]研究發(fā)現(xiàn)麥洼牦牛TLR1基因的主要功能是協(xié)助TLR2增強(qiáng)對(duì)病原體相關(guān)分子模式的識(shí)別能力，TLR2與TLR1形成的異源二聚體可識(shí)別分枝桿菌三酰脂蛋白，并能夠增強(qiáng)對(duì)PAMPs的特異性識(shí)別，因此TLR1也被認(rèn)為是乳房炎易感性候選基因。

蛋白質(zhì)是生命活動(dòng)的承擔(dān)者，在基因調(diào)控中起著重要的作用，同時(shí)其結(jié)構(gòu)又會(huì)影響物種的生命活動(dòng)代謝，蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)、二級(jí)結(jié)構(gòu)以及高級(jí)結(jié)構(gòu)互相影響，發(fā)揮著一定的生理學(xué)功能[27]。本研究發(fā)現(xiàn)中國(guó)荷斯坦牛TLR1基因中存在A61T-TLR1、C632A-TLR1、C1408T-TLR1、C1451T-TLR1、A1461G-TLR1、A1475C-TLR1、G1550A-TLR1、G1596A-TLR1共8個(gè)SNPs位點(diǎn)，導(dǎo)致5個(gè)氨基酸發(fā)生突變，這與Russell等[3]和李春苗等[4]研究結(jié)果部分相同。Russell等[3]和李春苗等[4]研究發(fā)現(xiàn)SNPs位點(diǎn)僅有一個(gè)相同，即A1475C-TLR1，且為同義突變，而本研究中8個(gè)SNP位點(diǎn)中有3個(gè)同義突變，其余皆為錯(cuò)義突變，這可能與奶牛群體不同有關(guān)。寧夏回族自治區(qū)和河北地區(qū)的環(huán)境、管理和選育模式的差異在一定程度上也會(huì)影響荷斯坦牛的遺傳背景，從而導(dǎo)致結(jié)果產(chǎn)生差異。本研究結(jié)果表明，A61T-TLR1、C1408T-TLR1、G1550A-TLR13個(gè)SNPs在突變前后基因頻率差異較大，可能對(duì)中國(guó)荷斯坦牛乳房炎有顯著影響。本研究結(jié)果表明，中國(guó)荷斯坦牛TLR1蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)主要由α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)卷曲組成，其中以α-螺旋為主，其含量遠(yuǎn)大于其他二級(jí)結(jié)構(gòu)，對(duì)該蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性具有顯著影響，且該蛋白質(zhì)的不穩(wěn)定指數(shù)大于40，屬于不穩(wěn)定蛋白[28]；中國(guó)荷斯坦牛TLR1蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)在突變前后未有較大改變，預(yù)測(cè)結(jié)果與二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果一致，結(jié)構(gòu)的改變，導(dǎo)致與其相關(guān)的功能及其抗病能力也會(huì)發(fā)生一定程度的改變。蛋白質(zhì)N端含信號(hào)肽，蛋白質(zhì)肽鏈經(jīng)過(guò)引導(dǎo)可進(jìn)入腔內(nèi)，從而定位蛋白質(zhì)[29]。蛋白質(zhì)的氨基酸序列中既含有決定蛋白質(zhì)定位和靶向修飾的信號(hào)，還有決定蛋白質(zhì)壽命信號(hào)[28]。本研究發(fā)現(xiàn)TLR1基因信號(hào)肽的切割點(diǎn)位于30位的氨基酸左右，它對(duì)于外分泌蛋白的分泌起主導(dǎo)作用，表明中國(guó)荷斯坦牛TLR1基因?qū)C(jī)體的免疫應(yīng)達(dá)具有重要影響。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，在中國(guó)荷斯坦牛TLR1基因編碼的蛋白質(zhì)中有6個(gè)潛在的N-糖基化位點(diǎn)，蛋白質(zhì)糖基化主要修飾天冬酰胺上的N端，通過(guò)影響免疫分子的結(jié)構(gòu)和功能，進(jìn)一步影響機(jī)體對(duì)抗原的應(yīng)答反應(yīng)[30]。經(jīng)過(guò)對(duì)中國(guó)荷斯坦牛TLR1蛋白質(zhì)功能的預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，多種與免疫相關(guān)因子的幾率相對(duì)較高，與中國(guó)荷斯坦牛的免疫能力有較大的相關(guān)性；與荷爾蒙相關(guān)的幾率最高，表明TLR1基因?qū)χ袊?guó)荷斯坦牛的生理調(diào)節(jié)具有重要影響，與該品種牛乳房的正常生理功能有密切的聯(lián)系。

4 結(jié)論

本研究通過(guò)對(duì)中國(guó)荷斯坦牛TLR1基因進(jìn)行多態(tài)性分析和蛋白質(zhì)功能預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)該基因與中國(guó)荷斯坦牛的免疫能力與生理機(jī)能有密切相關(guān)，且對(duì)中國(guó)荷斯坦牛的乳房炎具有顯著影響。今后工作應(yīng)進(jìn)一步對(duì)中國(guó)荷斯坦牛乳房炎的相關(guān)因子進(jìn)行研究，為中國(guó)荷斯坦牛的抗病育種供理論基礎(chǔ)。