選擇性肝孤兒受體激動劑5α,6α-環(huán)氧膽甾醇前藥的合成

徐孝浪, 郭曉強(qiáng), 張夢晗, 李小紅,王虹宇, 周 闖, 何源超

(1. 成都大學(xué) 藥學(xué)與生物工程學(xué)院, 四川 成都 610106; 2. 成都大學(xué) 藥食同源植物資源開發(fā)四川省高校重點實驗室, 四川 成都 610106;3. 成都大學(xué) 四川抗菌素工業(yè)研究所, 四川 成都 610051)

肝孤兒受體(LXRs)信號傳導(dǎo)是一個調(diào)控膽固醇代謝、運輸?shù)耐緩絒1～2],LXRs是一種配體依賴型核受體,有LXRα和LXRβ兩種亞型,研究發(fā)現(xiàn)它可能成為治療高膽固醇血癥、動脈粥樣硬化以及預(yù)防心腦血管疾病的新作用靶點[3～7].在LXRs配體的研究中,氧化型固醇24S、25環(huán)氧膽固醇是較早發(fā)現(xiàn)的LXRs非選擇性激動劑,LXRα和LXRβ兩種亞型都會與之結(jié)合.此外腦甾醇、22R-羥基膽固醇等氧固醇都具有LXRs激動作用[8],然而動物實驗表明,LXRs激動劑會導(dǎo)致肝臟脂肪堆積以及使血液中甘油三酯的水平異常上升,這些副作用與LXRs誘導(dǎo)SREBP1c表達(dá)有關(guān)[9],因此,開發(fā)高效的LXRs選擇性激動劑是一個亟待解決的問題[10].近年來研究[11]發(fā)現(xiàn)5α,6α-環(huán)氧膽甾醇(2a)在一些LXRs應(yīng)答基因中表現(xiàn)出激動作用,并且在與LXRs的親和力測試中發(fā)現(xiàn)2a具有比24S、25環(huán)氧膽固醇更好的親和力；除此之外,2a與LXRβ型受體不會結(jié)合,與LXRα型受體結(jié)合度較高(IC50=0.08 μmol/L;EC50=1.7 μmol/L),因此2a有可能成為一種選擇性的LXRs激動劑.但是2a本身是一個甾體類化合物,脂溶性很大,而水溶性較差,在一定程度上降低了2a在機(jī)體內(nèi)的生物利用度.本文以2a為先導(dǎo)化合物,對C-3位羥基進(jìn)行化學(xué)結(jié)構(gòu)修飾,首先膽甾醇經(jīng)m-CPBA(a)處理得到關(guān)鍵中間體2a,2a分別與戊二酸酐、順丁烯二酸酐和煙酸在DCC/DMAP(b)條件下進(jìn)行酯化反應(yīng)制得酯化衍生物2a-1、2a-2、2a-3；另外2a分別與2,3,4,6-O-苯甲酰基-D-溴代葡萄糖、2,3,4,6-O-苯甲?；?D-溴代半乳糖和2,3,4-O-苯甲?；?L-溴代阿拉伯糖在Ag2CO3催化下進(jìn)行糖苷化反應(yīng),最后經(jīng)CH3ONa脫保護(hù)(c)制備糖苷化衍生物2s-1、2s-2、2s-3(如圖1所示),目標(biāo)化合物均通過1H NMR、13C NMR和MS確證其結(jié)構(gòu),以期能得到2a具有合適脂水分配系數(shù)的前藥,為2a的結(jié)構(gòu)修飾提供一個可行的路徑.

1 實驗部分

1.1 試劑膽固醇,生物純；二環(huán)己基碳二亞胺(DCC),分析純；4A分子篩、強(qiáng)酸型陽離子交換樹脂,成都市科隆化學(xué)品有限公司；間氯過氧苯甲酸(m-CPBA)、4-二甲氨基吡啶(DMAP)、戊二酸酐、順丁烯二酸酐、煙酸、D-葡萄糖、D-半乳糖、L-阿拉伯糖、碳酸銀、甲醇鈉、二氯甲烷、石油醚、乙酸乙酯、四氫呋喃,均為分析純,上海泰坦科技股份有限公司.

圖 1 5α,6α-環(huán)氧膽甾醇衍生物合成路線

Fig.1Syntheitcrouteof5α,6α-epoxycholesterolderivatives

1.2 儀器Avance III 400 MHz核磁共振波譜儀(Bruker),6210 LC/MS TOF型質(zhì)譜儀(Agilent Technologies),DTC-22型隔膜真空泵(東京理化器械株式會社),N-1100V-WD型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(東京理化器械株式會社),PSL-2000型恒溫磁力攪拌水槽(東京理化器械株式會社),DHG-9246A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海精宏試驗設(shè)備有限公司),SHB-Ⅲ型循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長城科工貿(mào)有限公司),ZF-20D型暗箱式紫外分析儀(上海寶山顧村電光儀器廠),MP300型全自動熔點儀(濟(jì)南海能儀器股份有限公司).

1.3 合成

1.3.12a的合成 50 mL單口瓶中加入膽固醇(0.5 g,1.29 mmol)和10 mL二氯甲烷,攪拌使膽固醇溶解,分批加入m-CPBA(0.25 g,1.55 mmol),室溫攪拌反應(yīng)18 h(TLC檢測,磷鉬酸顯色；V(石油醚)∶V(乙酸乙酯)=2∶1).所得有機(jī)相在分液漏斗中依次用20 mL飽和亞硫酸鈉溶液、20 mL飽和硫代硫酸鈉溶液和50 mL飽和氯化鈉溶液洗滌,分出有機(jī)相,無水硫酸鎂干燥,減壓蒸去二氯甲烷得到白色固體,經(jīng)柱層析[洗脫劑:V(石油醚)∶V(乙酸乙酯)=10∶1]純化得白色粉末0.45 g,收率85%.m.p∶141～142 ℃.1H NMR(400 MHz,CDCl3)δ:3.90(ddd,J=16.1,11.2,4.8 Hz,1H),2.92(d,J=4.4 Hz,1H),1.06(s,3H),0.90(s,3H),0.87(d,J=1.9 Hz,3H),0.86(d,J=1.8 Hz,3H),0.61(s,3H).13C NMR(101 MHz,CDCl3)δ:68.6、65.9、59.4、56.8、55.8、42.5、42.3、39.7、39.4、36.1、35.7、34.8、32.4、30.9、29.8、28.8、28.0、24.0、23.8、22.8、22.5、20.6、18.6、15.9、11.8.ESI-MSm/z:425.34[M+Na]+.

1.3.22a-1的合成 50 mL單口瓶中加入2a(0.05 g,0.12 mmol)和戊二酸酐(0.014 g,0.12 mmol)、四氫呋喃5 mL,劇烈攪拌下,依次加入DCC(0.05 g,0.24 mmol)和DMAP(0.03 g,0.24 mmol).升溫至40 ℃反應(yīng)48 h(TLC檢測,磷鉬酸顯色；V(石油醚)∶V(乙酸乙酯)=2∶1).所得反應(yīng)液減壓蒸干用20 mL乙酸乙酯溶解,水洗分出有機(jī)相,1 mol/L鹽酸洗滌,無水硫酸鎂干燥,減壓蒸餾得到的無色透明油狀液體經(jīng)柱層析[洗脫劑:V(二氯甲烷)∶V(甲醇)=10∶1]純化得白色固體0.058 g,收率90%.m.p∶131～133 ℃.1H NMR(400 MHz,CDCl3)δ:4.98～4.92(m,1H),2.89(d,J=4.4 Hz,1H),2.41(t,J=7.3 Hz,2H),2.34(t,J=7.3 Hz,2H),1.06(s,3H),0.87(d,J=6.5 Hz,3H),0.85(d,J=3.0 Hz,3H),0.84(d,J=3.2 Hz,3H),0.59(s,3H).13C NMR(101 MHz,CDCl3)δ:178.7、172.0、71.5、65.4、59.2、56.7、55.8、42.3、39.4、36.1、35.7、35.0、33.4、32.9、32.1、29.8、28.7、28.0、27.2、23.9、22.8、22.5、20.5、19.8、19.5、18.6、15.8、11.8.ESI-MSm/z:517.39[M+H]+.

1.3.32a-2的合成 參照2a-1的合成方法進(jìn)行制備,順丁烯二酸酐(0.014 g,0.14 mmol)、[洗脫劑:V(二氯甲烷)∶V(甲醇)=20∶1]純化得白色固體0.055 g,收率88%.m.p∶129～131 ℃.1H NMR(400 MHz,CDCl3)δ:6.47(d,J=12.9 Hz,1H),6.32(d,J=12.9 Hz,1H),5.14(ddd,J=16.3,11.3,4.9 Hz,1H),2.94(d,J=4.4 Hz,1H),1.10(s,3H),0.89(d,J=6.5 Hz,3H),0.87(d,J=1.9 Hz,3H),0.85(d,J=1.9 Hz,3H),0.61(s,3H).13C NMR(101 MHz,CDCl3)δ:168.2、164.2、137.2、129.4、75.1、65.1、59.5、56.8、55.9、42.5、42.4、39.6、36.2、35.8、35.1、32.1、29.9、28.8、28.1、27.0、24.1、23.9、22.9、22.6、20.7、18.7、15.9、12.0.ESI-MSm/z:539.31[M+K]+.

1.3.42a-3的合成 參照2a-1的合成方法進(jìn)行制備,煙酸(0.02 g,0.18 mmol)、[洗脫劑:V(石油醚)∶V(乙酸乙酯)=4∶1]純化得白色粉末0.054 g,收率86%.m.p:146～148 ℃.1H NMR(400 MHz,CDCl3)δ:9.16(s,1H),8.72(s,1H),8.29(d,J=7.9 Hz,1H),7.39(s,1H),5.23-5.14(m,1H),2.88(d,J=4.3 Hz,1H),1.27(s,3H),1.07(s,3H),0.80(s,3H),0.79(s,3H),0.55(s,3H).13C NMR(101 MHz,CDCl3)δ:164.4、153.2、150.8、137.0、126.5、123.2、72.7、65.2、59.2、56.7、55.8、42.4、42.3、39.5、39.3、36.2、36.1、35.7、35.0、32.1、29.8、28.7、28.0、28.0、27.3、24.0、23.8、22.8、22.5、20.6、18.6、15.9、11.8.ESI-MSm/z:530.36[M+Na]+.

1.3.52s-1的合成 50 mL單口瓶中加入2a(0.20 g,0.49 mmol)和2,3,4,6-O-苯甲?；?D-溴代葡萄糖(0.64 g,0.98 mmol)、Ag2CO3(0.13 g,0.49 mmol)、粉狀分子篩200 mg、無水乙醚20 mL攪拌溶解,室溫反應(yīng)2.5 h,(TLC檢測,磷鉬酸顯色；V(石油醚)∶V(乙酸乙酯)=2∶1).反應(yīng)完全后,抽濾,所得濾液減壓蒸餾后經(jīng)快速柱層析[洗脫劑:V(石油醚)∶V(乙酸乙酯)=4∶1]純化得白色固體0.46 g.所得白色固體用10 mL甲醇溶解,室溫下加入5 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)30%甲醇鈉甲醇溶液反應(yīng)2 h,(TLC檢測,磷鉬酸顯色；氯仿∶甲醇=5∶1)反應(yīng)完畢后,加入15 mg強(qiáng)酸型陽離子交換樹脂調(diào)pH=6～7,抽濾,減壓蒸干,所得棕色固體經(jīng)快速柱層析[洗脫劑:A=V(二氯甲烷)∶V(甲醇)=20∶1]純化得白色固體粉末0.23 g,總收率82%.m.p∶224～225 ℃.1H NMR(400 MHz,CDCl3)δ:8.08(d,J=7.5 Hz,2H),7.98(d,J=7.5 Hz,2H),7.91(d,J=7.4 Hz,2H),7.79～7.74(m,2H),7.61(dd,J=14.5,7.2 Hz,2H),7.43(dt,J=17.4,5.4 Hz,8H),7.24(d,J=7.8 Hz,2H),6.03(d,J=5.2 Hz,1H),5.73(d,J=2.5 Hz,1H),5.47(d,J=8.8 Hz,1H),4.75～4.71(m,1H),4.47(dd,J=12.1,2.7 Hz,1H),4.33(dd,J=12.1,4.8 Hz,1H),4.05(d,J=4.1 Hz,1H),3.70～3.60(m,1H),2.85(d,J=4.3 Hz,1H),0.99(s,3H),0.86(d,J=2.7 Hz,3H),0.85(s,3H),0.84(d,J=1.8 Hz,3H),0.57(s,3H).13C NMR(101 MHz,CD3OD∶CDCl3=6∶1)δ:101.0、76.5、75.9、73.5、70.1、66.1、61.7、59.9、56.8、55.8、42.6、42.3、39.4、36.4、36.1、35.7、35.0、32.4、29.8、29.0、28.7、27.9、23.9、23.7、22.6、22.3、20.5、18.5、15.7、11.7.ESI-MSm/z:565.41[M+Na]+.

1.3.62s-2的合成 參照2s-1的合成方法進(jìn)行制備,2,3,4,6-O-苯甲?；?D-溴代半乳糖(0.64 g,0.98 mmol)、得白色固體粉末0.21 g,總收率74%.m.p∶222～224 ℃.1H NMR(400 MHz,CDCl3)δ:7.96～7.90(m,6H),7.65～7.61(m,2H),7.54(dd,J=10.0,4.2 Hz,3H),7.41～7.34(m,9H),6.18(d,J=5.0 Hz,1H),5.75(dd,J=3.9,2.3 Hz,1H),5.42(dd,J=6.2,4.1 Hz,1H),4.79～4.73(m,1H),4.59～4.54(m,1H),4.46～4.40(m,1H),4.37～4.31(m,1H),3.91～3.82(m,1H),2.85(d,J=4.3 Hz,1H),1.01(s,3H),0.88(s,3H),0.86(d,J=1.6 Hz,3H),0.85(d,J=1.9 Hz,3H),0.59(s,3H).13C NMR(101 MHz,V(MeOD)∶V(CDCl3)=6∶1)δ:93.5、67.3、66.7、65.3、62.8、60.4、57.7、52.7、51.3、48.7、47.6、34.4、33.9、31.1、31.0、27.8、27.5、27.3、26.5、24.0、21.4、20.5、20.3、19.4、15.4、15.2、13.6、13.4、12.1、9.6、6.7、2.8.ESI-MSm/z:565.41[M+Na]+.

1.3.72s-3的合成 參照2s-1的合成方法進(jìn)行制備,2,3,4-O-苯甲?；?L-溴代阿拉伯糖(0.51 g,0.98 mmol)、得白色固體粉末0.18 g,總收率78%.m.p∶209～211 ℃.1H NMR(400 MHz,CDCl3)δ:8.06(d,J=7.2 Hz,2H),7.99(d,J=7.2 Hz,2H),7.93(d,J=7.3 Hz,2H),7.57～7.53(m,2H),7.46～7.40(m,5H),7.31(d,J=7.7 Hz,2H),5.69～5.65(m,2H),5.55(dd,J=8.9,3.4 Hz,1H),4.81(d,J=6.4 Hz,1H),4.32(dd,J=12.9,3.9 Hz,1H),3.95～3.89(m,2H),3.87(s,1H),2.78(d,J=4.3 Hz,1H),0.98(s,3H),0.89(s,3H),0.86(d,J=1.8 Hz,3H),0.85(d,J=1.8 Hz,3H),0.59(s,3H).13C NMR(101 MHz,V(MeOD)∶V(CDCl3)=6∶1)δ:103.0、76.7、74.1、72.2、69.4、67.1、66.7、60.7、58.2、57.0、43.9、43.3、40.6、40.5、37.4、37.1、36.8、36.0、33.5、30.9、30.0、29.8、28.9、24.9、24.7、23.1、22.9、21.5、19.1、16.2、12.3.ESI-MSm/z:535.40[M+Na].

2 結(jié)果與討論

2.1 酯化反應(yīng)條件的探討酯化反應(yīng)實驗中首先使用Py/DMAP體系制備2a-1～2a-3,反應(yīng)結(jié)果均分離到2個主要產(chǎn)物,1H NMR鑒定其中一個為目標(biāo)產(chǎn)物(收率約10%),而另外一個為2a骨架中環(huán)氧基開環(huán)后的酯化產(chǎn)物(收率約80%),分析原因可能是吡啶作為堿的條件下環(huán)氧基更易受酸酐/羧酸的進(jìn)攻而開環(huán),反應(yīng)條件過于劇烈.隨后采用溫和的DDC縮合法,成功減少了環(huán)氧基開環(huán)副產(chǎn)物的生成,但是收率很低(30%～40%).為了提高產(chǎn)品收率,本文重點探究了DCC以及DMAP的投料摩爾比對2a酯化反應(yīng)收率的影響,固定2a投料量為50 mg,改變DCC、DMAP投料摩爾比,優(yōu)化反應(yīng)收率.實驗結(jié)果如圖2所示,可以發(fā)現(xiàn),當(dāng)2a投料量固定時,反應(yīng)溫度為40 ℃,溶劑為四氫呋喃,反應(yīng)時間為48 h,DDC和DMAP的投料摩爾比為1∶1時,反應(yīng)收率得到大幅提升(80%～90%),后期繼續(xù)增大DCC與DMAP的投料摩爾比,其反應(yīng)收率不再增加.

2.2 糖苷化反應(yīng)條件的探討Koenigs-Knorrs反應(yīng)是糖化學(xué)中經(jīng)典的成苷方法,首先采用Ag2CO3作為催化劑進(jìn)行糖苷化反應(yīng),但是在反應(yīng)過程中發(fā)現(xiàn)其收率較低(30%左右),TLC觀察到大量未反應(yīng)完的原料以及分解的鹵代糖.通過干燥溶劑、補(bǔ)加大量鹵代糖、升高反應(yīng)溫度也無明顯改善.經(jīng)分析知：反應(yīng)過程中生成了鹵化氫和水,這2種因素很可能會阻礙糖苷鍵的形成.因此,在原反應(yīng)條件下加入粉狀4A分子篩,以除去生成的水并吸收鹵化氫,同時將溶劑無水化處理,結(jié)果反應(yīng)收率大為改善,由原來的30%左右提高到80%～95%.圖3為不同的分子篩用量對反應(yīng)收率的影響,結(jié)果表明,隨分子篩用量增加,收率明顯增加,但當(dāng)分子篩用量達(dá)到200 mg后,反應(yīng)收率變化不明顯.

2.3 目標(biāo)化合物結(jié)構(gòu)確證本文所合成的目標(biāo)化合物2a-1～2a-3、2s-1～2s-3均未見文獻(xiàn)報道,1H NMR圖譜中δ(H)=0.62,0.85,0.87,0.89,1.13左右為環(huán)氧膽甾醇骨架上的氫.2a-1圖譜中δ(H)=2.34,2.41為戊二酸結(jié)構(gòu)中2個亞甲基的質(zhì)子峰；2a-2圖譜中δ(H)=6.32,6.47為順丁烯二酸結(jié)構(gòu)中雙鍵上的質(zhì)子峰；2a-3譜圖中δ(H)=7.38,8.29,8.76,9.20為煙酸結(jié)構(gòu)中吡啶環(huán)上的質(zhì)子峰；2s-1中δ(H)=3.15,3.26,3.35,3.68,3.85,4.32為葡萄糖上的氫質(zhì)子信號,2s-2中δ(H)=3.46,3.50,3.74,3.84,4.28為D-半乳糖上的氫質(zhì)子信號,2s-3中δ(H)=3.50,3.53,3.80,3.85,4.24為L-阿拉伯糖上氫質(zhì)子信號.另外各目標(biāo)化合物的13C NMR譜、質(zhì)譜圖也與各自的結(jié)構(gòu)相符.

圖 2 DCC和DMAP投料比(mole)對2a酯化反應(yīng)收率的影響

圖 3 分子篩用量對2a糖苷化反應(yīng)收率的影響

3 結(jié)束語

以調(diào)控膽固醇代謝、運輸途徑的LRXs為靶點,基于前藥修飾策略,采用便宜易得的膽固醇為原料,通過有機(jī)過氧酸一步氧化得到2a,再分別與戊二酸酐、順丁烯二酸酐和煙酸進(jìn)行酯化反應(yīng)制得2a酯化衍生物2a-1、2a-2、2a-3；另外2a分別與2,3,4,6-四-O-苯甲?；?D-溴代葡萄糖、2,3,4,6-四-O-苯甲酰基-D-溴代半乳糖和2,3,4-四-O-苯甲?；?L-溴代阿拉伯糖進(jìn)行糖苷化反應(yīng)制備糖苷化衍生物2s-1、2s-2、2s-3.成功探索出在環(huán)氧基不開環(huán)的前提下對其進(jìn)行酯化、糖苷化修飾的路線,初步探索了縮合劑DCC/DMAP的投料摩爾比對目標(biāo)化合物收率的影響,確定出2a酯化修飾線路中縮合劑的優(yōu)選配比,大幅度提高了酯化反應(yīng)收率.在糖苷化反應(yīng)中加入粉狀4A分子篩,及時移除阻礙糖苷形成的不利因素(H2O、HBr),糖苷化反應(yīng)收率由約30%提高到90%左右.研究結(jié)果為以后針對2a展開更深入的結(jié)構(gòu)修飾工作打下了一定的基礎(chǔ),也為2a的結(jié)構(gòu)改造提供了有益的路徑和策略參考.