區(qū)域地下水環(huán)境演化的分子生物學特征——以太行山前平原淺層水為例

何 澤,張 敏,寧 卓*,向小平,劉俊建,侯欽宣,趙 謙

區(qū)域地下水環(huán)境演化的分子生物學特征——以太行山前平原淺層水為例

何 澤1,2,張 敏1,寧 卓1,2*,向小平1,2,劉俊建1,2,侯欽宣1,2,趙 謙1,2

(1.中國地質科學院水文地質環(huán)境地質研究所,河北 石家莊 050061；2.中國地質調查局/河北省地下水污染機理與修復重點實驗室,河北 石家莊 050803)

以太行山前平原大沙河流域的典型區(qū)域淺層地下水為研究對象,沿岸布點采集樣本94組,采用基于16S rRNA基因的高通量測序技術,以硝酸鹽、溶解氧、化學需氧量為環(huán)境因子,分析指示環(huán)境因子演化的微生物群落結構特征及功能性指示菌屬.結果顯示:采用累積概率分布法將樣品分為背景(B)、硝酸鹽污染(N)、有機污染(O)、有機硝酸鹽復合污染(O_N)4組,該分類與地下水質量標準的I類、II類水分類相近;污染使種群結構趨于一致,且有機污染可使微生物群落豐富度降低;不同污染類型導致環(huán)境演化的功能性指示菌屬分別為:和 unclassified_f_Micromonosporaceae指示有機污染,和指示硝酸鹽污染,和指示硝酸鹽和有機復合污染.以上構建的分子生物學方法可為區(qū)域環(huán)境調查及微生物修復提供理論依據(jù).

大沙河；地下水；硝酸鹽污染；有機污染；微生物

我國京津冀[1]、長三角[2]、珠三角[3]、淮河流域[4]等地下水污染調查發(fā)現(xiàn),“三氮”及有機污染普遍存在,且污染源點多面廣,呈現(xiàn)由點到面,由淺入深,由城市向周邊擴散的趨勢,區(qū)域地下水環(huán)境質量總體惡化[5].

雖然我國部分重點區(qū)域已開展了較為系統(tǒng)的地下水污染調查,但當前國內(nèi)外污染調查均主要檢測地下水中無機?有機及毒理微生物(總大腸菌群和細菌總數(shù))等水質指標[6-7],并以此評價地下水的環(huán)境演化趨勢.采用該系列指標的污染調查,無論采用何種評價方法,表征的均是地下水受污染程度,監(jiān)測反映的也僅是部分污染物變化規(guī)律,污染導致區(qū)域尺度地下水環(huán)境演化機理揭示不足.

實際上,該演化可認為主要是地下水環(huán)境中微生物利用污染物的微生物水文地球化學過程,該過程在污染場地尺度研究已較為成熟[8-11].針對我國普遍發(fā)現(xiàn)的“三氮”和有機污染物,微生物類似于催化劑主要通過參與氧化還原反應的方式控制污染物的降解轉化,而同時微生物的群落結構“指紋”會隨之發(fā)生演變,因而,通過“指紋”的演變可追溯微生物水文地球化學過程,從機理上揭示地下水環(huán)境演化[12-13].由于當前微生物檢測主要采用高通量測序?宏基因測試等分子生物學技術,因此該技術方法被稱為“分子生物學技術”(MBTs)[14-15].

分子生物學技術近10a來在國外污染場地研究中被廣泛應用,美國環(huán)保署(USEPA)統(tǒng)計的2009~ 2012年百余個研究中均使用了該技術[16],但區(qū)域尺度研究罕見;我國在地下水污染領域對該技術的應用較少,僅限于利用高通量測序技術評估場地地下水污染空間演化趨勢[17],或應用PCR-DGGE技術研究地下水石油污染條件下,微生物群落結構?活性與水化學指標間的響應關系[18].而區(qū)域尺度研究僅限2km左右小流域微生物空間差異分析,且未與污染指標建立聯(lián)系[19],國內(nèi)大尺度區(qū)域與污染相關研究尚未見報道.

本研究以太行山前平原典型淺層地下水為例,在大沙河沖洪積扇中上部沿河布設淺層地下水采樣點,將微生物高通量測序與污染水質指標測試分析相結合,在累積概率分布法評價污染程度基礎上,分背景、硝酸鹽污染、有機污染及有機&硝酸鹽復合污染4組別,分析不同組別微生物的群落結構特征及其與環(huán)境因子的相關關系,通過尋找表征典型微生物地球化學過程的功能性指示微生物,建立揭示區(qū)域尺度淺層地下水環(huán)境演化的分子生物學技術.

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況

研究區(qū)位于太行山前的大沙河沖洪積扇孔隙地下水系統(tǒng)中上部,面積約6000km2.大沙河屬于海河流域大清河系,起源于山西,自西向東流經(jīng)河北省中南部的曲陽?行唐?新樂、定州、無極、深澤、安國等縣市,并入潴龍河后,匯入白洋淀,研究區(qū)內(nèi)河段長度約150km.大沙河流域自西向東,地下含水層厚度逐漸增大,巖性逐漸變細,水量逐漸變小,礦化度不斷增大.研究對象淺層地下水,多為全新統(tǒng)(Q4)和上更新統(tǒng)(Q3)地層,巖性以粗砂、中砂為主,下部有卵礫石.沖洪積扇間及邊緣地帶為中細砂,賦水性相對較差;軸部、古河道和現(xiàn)代河床兩側為粗砂,賦水性強.水化學類型以重碳酸鈣和重碳酸鈣鎂型為主,礦化度小于1g/L.地下水以自然降水的垂直入滲和地下水的側向徑流補給,并接受田間灌溉和河道入滲補給.區(qū)內(nèi)地下水的排泄以人工開采為主,已形成降落漏斗[20-21].大沙河沿岸農(nóng)畜業(yè)和小型工業(yè)較為發(fā)達,已造成大沙河及周邊地下水污染[22-23].

1.2 樣品采集與運輸保存

圖1 采樣布點

2017年10月,沿研究區(qū)地下水流向在大沙河兩岸布設采集地下水樣品94個.布點原則為:(1)覆蓋大沙河沖洪積扇中上部大部分面積,使數(shù)據(jù)反映該區(qū)整體微生物多樣性特征;(2)在易產(chǎn)生硝酸鹽污染的養(yǎng)殖場?連片農(nóng)田及易發(fā)生有機污染的工廠周邊加密布點,重點研究硝酸鹽污染?有機污染對地下水微生物群落結構的影響.具體布點見圖1.采樣前按照區(qū)域地下水污染調查評價規(guī)范[6]進行洗井、現(xiàn)場測試.測試數(shù)據(jù)穩(wěn)定后采集樣品.采樣選擇5L超純水塑料桶,采集時棄去超純水,并用待采地下水清洗3遍后將水桶灌滿,密封.采集的樣品置于4℃保溫箱中,在1~2d內(nèi)運輸?shù)綄嶒炇疫M行抽濾等預處理.抽濾采用高溫滅菌的孔徑0.22μm,直徑50mm的聚四氟乙烯(TPFE)微孔濾膜,每張濾膜過濾2L樣品,置于一次性無菌培養(yǎng)皿中保存,統(tǒng)一存放于-86℃冰箱中,以備提取DNA等后續(xù)工作.

1.3 樣品測試

水質指標測試:常規(guī)水質指標包括溶解氧(DO)?硝酸鹽(NO3-)、化學需氧量(COD);有機、無機濃度均根據(jù)中國生活飲用水衛(wèi)生標準檢驗方法GBT 5750.6.2.1-2006,委托自然資源部地下水礦泉水及環(huán)境監(jiān)測中心測試.

高通量測序:利用MP的FastDNATMSpin Kit for Soil試劑盒進行樣品DNA提取,取一張濾膜在冰上融化,用無菌剪刀剪碎,置于試劑盒提供的珠磨離心管中,按照說明書進行DNA提取.利用1%瓊脂糖凝膠電泳對DNA質量進行檢測,使用Nano Drop 2000進行DNA濃度測定.PCR擴增及后續(xù)測序采用國際地球微生物計劃中推薦使用的16S rDNA擴增引物序列(http://www.earthmicrobiome.org/emp- standard-protocols/16s/),目標片段可兼顧細菌和古菌.上游引物為515FB(GTGYCAGCMGCCGCGG- TAA),下游引物為806RB(GGACTACNVGGGTW- TCTAAT).試劑為TransGen AP221-02:TransStart Fastpfu DNA Polymerase,擴增儀為ABI GeneAmp? 9700型,擴增體系為20μL.將擴增后的產(chǎn)物進行回收,利用上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司的Illumina Miseq測序平臺進行測序.

1.4 數(shù)據(jù)結果分析方法

樣品污染類型分組;根據(jù)水化學測定的DO、NO3-、COD濃度,將采集的樣品分為有機污染組(O)、硝酸鹽污染組(N)、有機硝酸鹽復合污染組(O_N)及未污染背景組(B).分組閾值的篩選主要基于各指標累積概率曲線的拐點,當有多個拐點時,結合地下水質量標準進行選擇.

環(huán)境因子篩選:使用SPSS12軟件,采用皮爾遜相關性分析篩選環(huán)境因子.

結果可靠性檢驗:將Miseq高通量測序得到的PE reads根據(jù)overlap關系進行拼接,同時對序列質量進行質控和過濾,并按照最小樣品序列數(shù)進行抽平處理.抽平后,采用稀釋曲線分析對測序結果可靠性進行檢驗;采用偏最小二乘法判別分析,對分組方案的可靠性進行檢驗.

微生物群落結構分析:在OTU水平上進行了Alpha多樣性分析.Alpha多樣性分析主要有反映測序覆蓋度的coverage指數(shù),反映群落豐富度的chao、ACE和sobs指數(shù),以及反映群落多樣性的shannon和simpson指數(shù).采用RDP classifier貝葉斯算法對97%相似水平的OTU代表序列進行分類學比對,物種分類數(shù)據(jù)庫為silva128/16S,分類置信度設為0.7.基于該分類,在屬(genus)水平,對各組樣品進行了韋恩圖分析.

地下水環(huán)境演化的功能性指示微生物分析:首先進行了代表性菌種分析,該分析包括群落組成分析及組間差異顯著性檢驗.群落組成分析以各組樣品物種豐度的中位數(shù)進行計算;組間差異顯著性檢驗是在屬水平上利用Kruskal-Wallis秩和檢驗進行分析,其中,顯著性值多重檢驗校正方法采用fdr,CI計算方法采用scheffe.其次,為分析代表性菌種與污染環(huán)境因子間的關聯(lián),確定功能性指示微生物,對分組樣品進行了相關性熱圖分析,相關系數(shù)類型為Spearman.最后,比對已有研究,對功能性指示微生物對環(huán)境演化的指示作用進行了分析印證.以上分析在I-sanger云平臺(http://www.i-sanger.com/)完成.

2 結果與討論

2.1 樣品污染類型分組

繪制94個樣品DO、NO3-和COD濃度的累積概率曲線如圖2所示.

從圖中看出,lg(COD)的拐點為0mg/L,即COD的拐點為1mg/L,此拐點恰為地下水質量標準的I類和II類分界值,可選為有機污染判定閾值;NO3-存在兩個拐點,分別為10和88.4mg/L,此拐點恰為地下水質量標準I類與II類?III類與IV類的分界值,考慮到III類以上水不再適合飲用,選取III類標準88.57mg/L為NO3-污染判定閾值;DO的兩個拐點為3.0mg/L及6.0mg/L左右,一般認為, DO小于3.0mg/L時可能存在有機污染.故有機污染用COD和DO雙指標進行判斷,當COD>1而DO<3時,表示存在有機污染,且正在降解;當COD>1而DO>3時,表示存在有機污染,且未降解;當COD<1而DO<3時,表示曾經(jīng)發(fā)生有機污染,但已降解;當COD<1而DO>3時,表示無有機污染.當硝酸鹽污染與有機污染判斷標準均符合時,定為有機硝酸鹽復合污染,具體分組規(guī)則見下表(表1):

圖2 累積概率曲線分析

表1 樣品污染類型分組規(guī)則(mg/L)

2.2 測序結果及分組方案可靠性檢驗

2.2.1 測序結果可靠性檢驗 通過對采集水樣中細菌、古菌進行測序,94個樣品共獲得有效序列3147296條,平均每個樣品序列33482條,每條序列長度平均為292bp.為了使數(shù)據(jù)標準化,按照各樣品中序列最低數(shù)量23926條,對樣品序列進行抽平處理.

對樣品進行稀釋曲線分析,評價測序量是否足以覆蓋所有類群.94個樣品的sobs及shannon稀釋曲線見圖3.由圖可見,各樣品的稀釋曲線已趨于平緩,即使再增大測序數(shù)據(jù)量對OTU的發(fā)現(xiàn)也無貢獻,說明樣品的OTU覆蓋度已基本飽和,測序數(shù)據(jù)量及抽平結果合理,可信度高.

圖3 相似度為97%條件下各樣本的稀釋曲線

2.2.2 分組方案可靠性檢驗 為了檢驗分組方案是否可靠,采用偏最小二乘法(PLS-DA)判別分析,在OTU水平上進行檢驗.

主要方法是利用數(shù)學模型將各組加以區(qū)分,分析組間是否存在系統(tǒng)差異,從而判斷分組是否有意義.經(jīng)過PLS-DA分析,得到的結果如圖4.O組、N組及B組分別位于不同象限,O_N組則大部分位于上部象限,分布基本位于N組、O組復合范圍,證明此分組方案很好的區(qū)分了有機污染、硝酸鹽污染、有機硝酸鹽復合污染及背景,具有很高的可靠性.

圖4 分組方案PLS-DA分析

2.3 樣品微生物群落結構分析

為了明確該區(qū)域有機污染、硝酸鹽污染是否會使其中的地下水微生物多樣性較背景產(chǎn)生較大差異,本研究進行了Alpha多樣性分析、Beta多樣性分析及物種韋恩圖分析.

如表2所示,Coverage指數(shù)反應測序結果對群落的覆蓋度,4個分組的Coverage指數(shù)均值均為0.97,展示本次測序對群落的覆蓋度好,數(shù)據(jù)可靠性高.

Chao、ACE和sobs指數(shù)用于分析群落物種豐富度,它的數(shù)值越大,表示樣品所包含的物種種類越豐富.總體上,4個分組的Chao?ACE和sobs指數(shù)均為N組最大,O組最小,說明硝酸鹽可提高微生物豐富度,而有機污染減少物種豐富度.

Shannon和Simpson指數(shù)是反映樣品物種多樣性的2個指數(shù),它們不僅反映物種豐富度,還指示了物種的均勻度.它們的數(shù)值越大,表示該樣品中的物種種類越多且分布越均勻,Shannon指數(shù)對物種豐富度更敏感,而Simpson指數(shù)對物種均勻度更為敏感[24].一般認為, Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)變化規(guī)律相反.將4組樣品相比較,Shannon指數(shù)N組和B組最大,而O組最小;Simpson指數(shù)O組最大,而其他組相當.

綜合Alpha多樣性各指標發(fā)現(xiàn),有機污染可降低微生物群落物種的豐富度.該結論與作者于2018年在附近區(qū)域采集的污染地下水樣品的多樣性結果一致,即在有機污染下,微生物種群豐富度降低.且本研究各分組的Alpha多樣性均高于2018年樣品[25].

表2 樣品Alpha多樣性指數(shù)(均值±標準偏差)

Beta多樣性(Beta diversity)分析結果較Alpha多樣性分析更為直觀,本研究使用Bray-curtis距離算法進行Beta多樣性主坐標分析(PCoA).分析結果見圖5.

圖5 Beta 多樣性的主坐標分析(PCoA)

由圖5可見,第一軸?第二軸的解釋度分別為10.09%及5.71%.有機污染組(O)樣品主要聚集在第一象限,與未污染背景組(B)、硝酸鹽污染組(N)、復合污染組(O_N)的樣品聚集位置有較大差異,說明有機污染會導致微生物種群結構產(chǎn)生較大改變; O_N組和N組與B組位置有較大重疊,表明硝酸鹽污染導致微生物種群結構的變異較小;O組與N組位置差異明顯,O_N組介于兩者之間,表明污染物不同會導致微生物種群結構的差異;B組樣品在圖中較為分散,污染組樣品位置則相對集中,且B組與其它組均有不同程度的重合,說明在污染物作用下,地下水微生物的種群結構會趨于一致.以上結論基本與2018年區(qū)域微生物調查結果一致,區(qū)別在于2018年的硝酸鹽污染導致的種群差異大于有機污染[25].

將樣品所含13013個OTU進行分類學比對得知,所有樣品的物種共屬于67個門、185個綱、367個目、689個科、1487個屬及3301個種,物種組成較為豐富.在OTU水平上,使用韋恩圖分析對B、O、N、O_N 4組所含共有和獨有的OTU數(shù)目進行統(tǒng)計,初步比較各組物種組成的差異,具體的分析結果見圖6.

圖6 不同樣品之間比較的韋恩圖

由圖6可知, B、O、N、O_N組分別包含8958、7563、6928、5217種OTU,各自獨有852、519、253、119種OTU,4組共有的OTU為3618種. O_N組與O組、N組共享的OTU數(shù)量很接近,且獨有的OTU最少.由以上結果可知,背景組共享及獨有的微生物組成最為豐富,有機污染則產(chǎn)生了更多與背景組不同的獨有物種,而硝酸鹽污染及有機硝酸鹽復合污染產(chǎn)生的獨有物種則較少.

2.4 地下水環(huán)境演化的功能性指示微生物

樣品的微生物群落結構較為豐富,要利用該信息進行地下水環(huán)境演化的功能性指示,則需進一步分析篩選.首先明確各組中具有代表性的菌種類型,其次根據(jù)代表性菌種與污染環(huán)境因子間的關系,判斷其對地下水環(huán)境演化是否有指示作用,最后比對已有研究,印證其指示作用,最終確定地下水環(huán)境演化的功能性指示微生物.

代表性菌種分析包括群落組成分析及組間差異顯著性檢驗.群落組成分析結果見圖7.

圖7 細菌組成屬分類水平的比較

豐度>0.02%

由圖7可見,所有樣品最高豐度物種均為unclassified_f_Comamonadaceae(未分類叢毛單胞菌科),各組豐度從大到小依次為O組、B組、O_N組和N組;、、和在O_N組和N組具有較高的豐度;、在B組和N組具有較高豐度;而在O組豐度較高.據(jù)此判斷,有機污染能夠促進unclassified_f_Comamonadaceae_的生長,能夠抑制?;而硝酸鹽污染能促進、、和的生長.同樣,在2018年區(qū)域調查的微生物樣品中也發(fā)現(xiàn)unclassified_ f_Comamonadaceae為分布最廣的微生物,、、在2018年樣品中也為優(yōu)勢菌種[25].這些菌種雖然豐度較高,但是否在組間具有代表性,可將各組間很好的區(qū)分,還需進行組間差異顯著性檢驗.組間差異顯著性檢驗可評估物種豐度差異的顯著性水平,獲得組間代表性菌種.入選的菌種首先具有顯著性差異,其次豐度在各組較高.本研究采用Kruskal-Wallis秩和檢驗(Kruskal-Wallis H test),進行組間差異顯著性檢驗,確定代表性菌種,具體結果見圖8.

圖8左側為屬水平下的物種名,物種對應的柱狀圖長度表示該物種在各分組中的平均相對豐度,右側為顯著性值(* 0.01<￡0.05,** 0.001<￡0.01, ***￡0.001),圖中展示了具有顯著性差異的豐度位列前15的物種.可見,N組和菌屬, O組unclassified_ f_Micromonosporaceae和, O_N組和均具有顯著性差異.這些菌種在各組中雖然豐度不是最高,但可以更好區(qū)分各組,故將這些菌種確定為各組的代表性菌種.

圖8 組間差異顯著性檢驗(具有顯著性差異的豐度前15物種)

代表性菌種與地下水污染環(huán)境因子的關系利用相關性熱圖(Heatmap)進行揭示,結果如圖9.

由圖可見:N組的代表性菌種和與環(huán)境因子NO3-具有很好的相關性,同時,菌種與環(huán)境因子DO正相關,說明其應為一類好氧菌,與DO負相關,其應為一類厭氧菌O組代表性菌種unclassified_ f_Micromonosporaceae和與環(huán)境因子COD顯著正相關,說明該代表性菌種可存在于COD環(huán)境中,且2菌種與環(huán)境因子DO、NO3-顯著負相關,說明這兩種菌可能為厭氧菌種,且與硝酸鹽污染無關O_N組代表性菌種和與COD、NO3-、DO正相關,證明其存在于有機硝酸鹽復合污染區(qū)域,且可能為好氧菌種.

O組unclassified_f_Micromonosporaceae和在本組中具有顯著性差異且豐度較高,其典型特點為利用有機物進行厭氧降解作用,且降解能力較強[26-27],由此判斷,此兩菌屬可作為本區(qū)域地下水有機污染指示菌屬.

圖9 相關性熱圖分析(圖中數(shù)字為相關性R值)

N組和菌屬同樣在該組具有顯著性差異且豐度相對較高,其中屬有菌種為專性好氧菌,有反硝化功能[28],菌屬一般為兼性厭氧菌,其可同化硝酸鹽,也可進行硝酸鹽呼吸(反硝化)作用[29],因此,這2種菌屬可作為本區(qū)域地下水硝酸鹽污染指示菌屬.

O_N組和具有顯著性差異且豐度占據(jù)優(yōu)勢,這2種菌屬均為典型的好氧反硝化菌屬[30],此類菌屬是在好氧或兼性好氧條件下以有機碳作為能源的異養(yǎng)硝化菌,多發(fā)現(xiàn)于污水處理及養(yǎng)殖糞便處理系統(tǒng)中,可作為高氮高有機質復合污染的指示微生物.但菌屬下屬菌種多、分布廣、功能多,當其作為指示菌種時應結合其屬下具體菌種進行判斷指示環(huán)境.

3 結論

3.1 根據(jù)電子受體濃度,采用累積概率分布法可將樣品進行較好分類,該分類結果閾值與地下水質量標準的I類、II類水分類閾值基本一致;

3.2 對于研究區(qū)地下水環(huán)境,有機污染造成了微生物群落豐富度降低;

3.3 該區(qū)域具有顯著差異的、且在某污染組具有顯著性差異的菌屬可作為不同污染類型環(huán)境演化的功能性指示菌屬,分別為:和 unclassified_f_Micromonosporaceae指示有機污染,和指示硝酸鹽污染,和指示硝酸鹽和有機復合污染.

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致謝：本研究的現(xiàn)場采樣工作由中國地質科學院水文地質環(huán)境地質研究所孫繼朝研究員指導,劉丹丹副研究員,張千千副研究員等協(xié)助完成,在此表示感謝.

The environmental evolution research of regional groundwater using molecular biotechnologies: a case from the shallow groundwater in front of the Taihang Mountains.

HE Ze1,2, ZHANG Min1, NING Zhuo1,2*, XIANG Xiao-ping1,2, LIU Jun-Jian1,2, HOU Qin-xuan1,2, ZHAO Qian1,2

(1.Institute of Hydrogeology and Environmental Geology, Chinese Academy of Geological Sciences, Shijiazhuang 050061, China；2.Key Labratory of Groundwater Remediation, China Geological Survey/Hebei, Shijiazhuang 050803, China)., 2019,39(8)：3484~3492

The shallow groundwater in Dasha Rivers Basin was selected as the study subject, because of it is recognized as one of the typical regions in front of the Taihang Mountains. 94samples were collected along the river. The 16s rDNA gene sequences were tested by high-throughput sequencing technologies. According to the environmental factors of NO3-, COD and DO, the microbial communities and the functional indicator microorganisms related to environmental evolution were studied. The results showed that, using the cumulative probability distribution method, the samples were divided into four groups: background, nitrate pollution, organic pollution and organic-nitrate pollution (B group, N group, O group, O_N group). This grouping rules were close to the I and II water grade in the quality standard of groundwater. The pollution driven the microbial communities to converge, and the organic pollution could decrease the richness diversity of microbial communities. The functional indicator microorganisms related to environmental evolution in the different pollution region were summarized as followed: organic pollutioncould be indicated byand unclassified_f_Micromonosporaceae, nitrate pollution could be indicated byand, organic-nitrate pollution could be indicated byand. The molecular biotechnologies and analysis methods used in this research could provide the theoretical evidence for region environmental investigations and bioremediation.

Dasha River；groundwater；nitrate pollution；organic pollution；microorganisms

X172

A

1000-6923(2019)08-3484-09

何 澤(1981-),男,天津人,高級工程師,博士,主要從事地質微生物研究.發(fā)表論文30余篇.

2019-01-29

國家重點研發(fā)計劃(2018YFC1803002);中國地質調查局地質調查項目(DD20160309、DD20190331);國家自然科學基金資助項目(41602261);中國地質科學院基本科研業(yè)務費專項經(jīng)費資助項目(SK201702)

* 責任作者, 副研究員, ningzhuozhuo@163.com