灞河流域DOM熒光光譜特征及其對(duì)細(xì)菌組成的影響

袁 博,吳 巍,郭夢(mèng)京,鄭 興,周孝德

灞河流域DOM熒光光譜特征及其對(duì)細(xì)菌組成的影響

袁 博,吳 巍,郭夢(mèng)京,鄭 興,周孝德*

(西安理工大學(xué),西北旱區(qū)生態(tài)水利國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,陜西 西安 710048)

為了探討溶解性有機(jī)質(zhì)(DOM)來(lái)源組成對(duì)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性的影響,以及細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)在控制DOM組成及降解中的作用,本研究基于三維熒光光譜-平行因子分析(EEM-PARAFAC)技術(shù)研究了灞河水體枯水期(12月)DOM的熒光組分特征及空間分布變化;采用高通量測(cè)序技術(shù)分析了水體中細(xì)菌群落特征.結(jié)果表明:灞河水體DOM熒光組分中含有3個(gè)腐殖質(zhì)類組分(C1:240,320/400nm;C2:260-295/478-504nm;C5:240/480nm)和2個(gè)蛋白類組分(C3:240,272~284/350~360nm;C4:255~275/326~336nm),5組分之間相關(guān)性較好,表明這2類熒光組分具有相似的來(lái)源屬性;灞河水體門水平中相對(duì)豐度最高的為變形菌門(Proteobacteria,54.22%),其次為擬桿菌門(Bacteroidetes,19.40%)、厚壁菌門(Firmicutes,12.28% )、藍(lán)藻菌門(Cyanobacteria,6.46%)和放線菌門(Actinobacteria,3.13%);河流水體中的營(yíng)養(yǎng)鹽含量、水溫、電導(dǎo)率及pH值均對(duì)細(xì)菌群落組成有一定影響.DOM各組分與浮游菌群表現(xiàn)出一定相關(guān)關(guān)系,且腐殖類和蛋白類組分沿河流縱向梯度對(duì)比明顯,不同細(xì)菌群落對(duì)DOM的質(zhì)量和不穩(wěn)定性可能有不同的反應(yīng).本研究可為河流生物地球化學(xué)過(guò)程對(duì)微生物種群組成和功能影響的研究提供一定的基礎(chǔ)數(shù)據(jù).

溶解性有機(jī)質(zhì)；細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)；高通量測(cè)序；環(huán)境影響因子

浮游細(xì)菌是水體生源物質(zhì)地球化學(xué)循環(huán)的重要參與者,其多樣性是評(píng)價(jià)水體受污染程度的重要指標(biāo)[1].天然水體中浮游細(xì)菌的群落特征具多樣性,其組成特征在水生態(tài)系統(tǒng)中具有時(shí)空異質(zhì)性,可能驅(qū)動(dòng)細(xì)菌群落在生物地球化學(xué)循環(huán)中的功能作用發(fā)生變化[2-3].溶解性有機(jī)質(zhì)(DOM)作為參與水生態(tài)系統(tǒng)中生物地球化學(xué)循環(huán)的關(guān)鍵成分,是水生植物及微生物礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)和有機(jī)營(yíng)養(yǎng)的源泉,也是驅(qū)動(dòng)水體中微生物群落結(jié)構(gòu)與生產(chǎn)方式變化的重要因子之一[2,4].水生態(tài)系統(tǒng)中DOM的生物化學(xué)循環(huán)過(guò)程是在一個(gè)包含超過(guò)50個(gè)細(xì)菌門的多元化異養(yǎng)微生物環(huán)境中進(jìn)行的,這些菌群的豐度受到包括DOM的含量、來(lái)源、分子組成等多種因素的影響,這些參數(shù)通常控制細(xì)菌生長(zhǎng)的群落增長(zhǎng)速率和生物量生產(chǎn),進(jìn)而影響自然細(xì)菌群落的結(jié)構(gòu)和系統(tǒng)發(fā)育組的豐度[4-5].

河流作為探索微生物群落結(jié)構(gòu)與DOM特性之間作用關(guān)系的理想系統(tǒng),DOM的空間變化和微生物群落組成在河流縱向呈現(xiàn)很大的梯度特征[6].近年來(lái),隨著新一代高通量DNA測(cè)序技術(shù)和基因組學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展,對(duì)河流生態(tài)系統(tǒng)中微生物群落動(dòng)態(tài)也取得了豐碩研究成果[7].水體微生物的時(shí)空分布呈現(xiàn)出明顯的異質(zhì)性特征,驅(qū)動(dòng)因子包括環(huán)境條件(水文、光照、溫度、降水、營(yíng)養(yǎng)狀況等)和人類活動(dòng)(土地利用方式、水利工程、污水排放等)[8-9].此外,河流微生物的生境地理異質(zhì)性也是一個(gè)重要的驅(qū)動(dòng)因素[10].然而,當(dāng)前對(duì)淡水中DOM,浮游細(xì)菌多樣性和動(dòng)態(tài)的研究大多局限于其各自的組成特征,來(lái)源解析和影響因素方面[3],且都是環(huán)境地理學(xué)差異較小的平原河流或者河流的某些區(qū)段,鮮有對(duì)整條河流上從DOM來(lái)源組成對(duì)細(xì)菌群落和多樣性的影響以及細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)在控制DOM組成及降解中的作用方面開(kāi)展研究.

灞河流域地處陜西省西安市東南部,西安市第二大河流,受鄉(xiāng)村、城鎮(zhèn)和城市等典型人類擾動(dòng)作用的影響,其下游地區(qū)已成為典型的城市化河流.隨著城市擴(kuò)張和經(jīng)濟(jì)發(fā)展和國(guó)內(nèi)對(duì)城市河流生態(tài)安全的關(guān)注,目前灞河流域水環(huán)境研究主要集中于生態(tài)系統(tǒng)風(fēng)險(xiǎn)及健康評(píng)價(jià)[11]、非點(diǎn)源污染控制[12]、抗生素及抗性基因[13]和污染源解析[14]等方面.鮮有從生物地球化學(xué)循環(huán)和分子生物學(xué)角度對(duì)灞河水體細(xì)菌群落變化特征和DOM的關(guān)系進(jìn)行研究.基于此,本研究采用三維熒光和平行因子分析聯(lián)用檢測(cè)技術(shù),探究人類活動(dòng)影響下灞河流域DOM熒光變化特征;采用微生物高通量測(cè)序技術(shù)識(shí)別灞河水體中細(xì)菌群落組成和結(jié)構(gòu)特征,分析DOM的空間變化和細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成特征及其對(duì)水環(huán)境的影響,以期為灞河流域的飲用水源地生態(tài)治理和水環(huán)境保護(hù)提供科學(xué)依據(jù).

1 研究區(qū)域、材料與方法

1.1 樣品采集與理化指標(biāo)分析

灞河流域(109°00′~109°47′E,33°50′~34°27′N,圖1),發(fā)源于秦嶺北麓藍(lán)田縣灞源鄉(xiāng)九道溝,河流全長(zhǎng)104.1km,主要支流有浐河、蘭橋河、輞川河等[15],流域面積2581km2,河床平均比降6.0‰;浐河是灞河下游最大支流,全長(zhǎng)66.4km,流域面積752.8km3,河床平均比降19.8‰.流域?qū)倥瘻貛О霛駶?rùn)大陸性季風(fēng)氣候,多年平均氣溫13.3℃,年平均蒸發(fā)量776mm,降水分布由北部秦嶺山區(qū)向南部川道平原逐漸增加,其中河流源區(qū)年平均降水量830mm,河口區(qū)域年平均降水量720mm.

圖1 灞河流域采樣點(diǎn)位示意

本研究于2017年12月分別采集灞河流域主要干,支流共17個(gè)點(diǎn)位的表層水樣.其中S1~S10, S12~S13位于灞河干流及上游支流口,由于下游支流浐河流量較小,僅在浐河咸寧橋以下到?jīng)汉尤脲焙涌诘某鞘泻佣尾杉疭14,S16,S17共3個(gè)點(diǎn),在西安市第三、第五污水處理廠出水口(S15,S11)分別采集樣品,所有采樣點(diǎn)均以GPS定位.在每個(gè)采樣點(diǎn)位的河流斷面,依據(jù)水流向的左、中、右采集水樣.使用有機(jī)玻璃采水器采集水樣,每個(gè)采樣點(diǎn)采集3次,將3次樣品混合作為該采樣點(diǎn)樣品,混合水樣裝入4L聚乙烯水樣瓶.

現(xiàn)場(chǎng)采用多參數(shù)水質(zhì)測(cè)定儀(YSI EXO)測(cè)定水溫()、pH值、溶解氧(DO)、電導(dǎo)率(EC)、氧化還原電位(ORP)等基礎(chǔ)指標(biāo),于4℃的保溫箱內(nèi)保存送回實(shí)驗(yàn)室24h內(nèi)進(jìn)行分析.實(shí)驗(yàn)室分析中,未過(guò)濾水樣用于測(cè)量總氮(TN)、總磷 (TP),其中總磷采用總磷分析儀(IL 500,Hach)測(cè)定,總氮參照《地表水環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》(GB3838-2002)測(cè)定[16].經(jīng)過(guò)0.45μm醋酸纖維濾膜過(guò)濾后的水樣保存于4℃冰箱備用,采用流動(dòng)分析儀(SKALAR San++,荷蘭)測(cè)定氨氮(NH4+-N)、硝酸鹽(NO3?-N)、亞硝酸鹽(NO2?-N), DOC含量采用TOC分析儀(Elementar Vario TOC,德國(guó))測(cè)定.用于高通量測(cè)序的水樣通過(guò)0.22μm孔徑濾膜過(guò)濾,將過(guò)濾后的濾膜放入-80℃冰箱保存,用于后續(xù)DNA提取.

1.2 樣品采集與理化指標(biāo)分析

利用三維熒光光譜儀(Horiba Fluoromax- 4spectrofluorometer,HORIBA,法國(guó))進(jìn)行熒光光譜分析[17],配以1cm石英比色皿.激發(fā)波長(zhǎng)(λ):200~ 500nm,發(fā)射波長(zhǎng)(λ):230~550nm.儀器激發(fā)光源為150W氙燈,光電倍增電壓:400V,激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度均為5nm,響應(yīng)時(shí)間:0.5s,掃描速度2400nm/min.以Millipore?超純水(18.2MΩ.cm)作為空白,對(duì)過(guò)濾后的水樣進(jìn)行熒光掃描,系統(tǒng)自動(dòng)扣除拉曼和瑞利散射.UV254的測(cè)定采用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(Agilent8453,美國(guó)),以1cm比色皿Millipore?超純水做空白,同時(shí)測(cè)定溶液在254和355nm處的吸光度,利用其差值消除懸浮物吸光度值測(cè)定的影響.

1.3 DNA的提取和高通量測(cè)序

利用E.Z.N.A.Water DNA Kit (Omega Bio-tek, Norcross,GA,USA)說(shuō)明書(shū)步驟提取水樣中微生物的DNA,采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)抽提的DNA[18].對(duì)16S rRNA基因的V4~V5高變區(qū)片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增,引物序列[19]為515F (5′-GTGCCAGCMGCC- GCGG-3′)和907R (5′-CCGTCAATTCMTTTRAG- TTT-3′).細(xì)菌擴(kuò)增反應(yīng)條件為:95℃預(yù)變性2min,接著進(jìn)行25個(gè)循環(huán),包括95℃變性30s,55℃退火30s, 72℃延伸30s;操作結(jié)束后在72℃延伸5min,于4℃保存樣本.每個(gè)樣本3個(gè)重復(fù),將同一樣本的PCR產(chǎn)物混合后用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),使用AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒(Axygen Biosciences, Union City,CA,USA)切膠回收PCR產(chǎn)物,Tris_HCl洗脫;2%瓊脂糖電泳檢測(cè).根據(jù)電泳初步定量結(jié)果,將PCR產(chǎn)物用Quanti FluorTM-ST藍(lán)色熒光定量系統(tǒng)(Promega,USA)進(jìn)行定量檢測(cè),按照每個(gè)樣本的測(cè)序量要求,進(jìn)行相應(yīng)比例的混合.測(cè)序在北京諾禾致源生物信息科技有限公司的HiSeq2500PE250平臺(tái)進(jìn)行.

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

DOM熒光組分分析:在Matlab 2014b中使用DOMFluor工具箱對(duì)采樣點(diǎn)的數(shù)據(jù)進(jìn)行平行因子分析(PARAFAC),利用折半分析法來(lái)驗(yàn)證分析結(jié)果的可靠性,各組分的豐度以最大熒光強(qiáng)度Fmax(RU, Raman單位)來(lái)表示[20].利用Uparse(v7.0.1001)對(duì)所有樣品的全部Effective Tags進(jìn)行聚類,默認(rèn)以97%的一致性將序列聚類成為OTUs.使用Qiime軟件(Version 1.9.1)計(jì)算Observed-species、Chao1、Shannon、Simpson、ACE、Goods-coverage、PD_ whole_tree指數(shù).用Qiime軟件(Version 1.9.1)計(jì)算Unifrac距離,構(gòu)建UPGMA樣品聚類樹(shù).使用R軟件(Version 2.15.3)繪制PCA、PCoA和NMDS圖.NMDS分析使用R軟件的vegan軟件包.使用R軟件進(jìn)行Beta多樣性指數(shù)組間差異分析,分別進(jìn)行有參數(shù)檢驗(yàn)和非參數(shù)檢驗(yàn).利用SPSS(22.0版本)進(jìn)行細(xì)菌群落多樣性與環(huán)境因子的Pearson相關(guān)性分析和主成分分析;采用CANOCO (4.5版本)對(duì)環(huán)境因子與細(xì)菌門分類群落進(jìn)行冗余分析(RDA)研究.

2 結(jié)果與討論

2.1 灞河DOM空間分布特征和熒光組分的識(shí)別表征

灞河水體中DOC含量與其他河流類似[21-23](圖2a),其均值為3.37mg/L,其中源區(qū)、上游、中游和下游分別為1.87,2.17,2.68,4.91mg/L.從源頭開(kāi)始,在灞河藍(lán)田縣城以下DOC逐漸增加,上、中游DOC濃度相對(duì)較低且穩(wěn)定,在灞河濕地公園以下DOC濃度快速升高,高出上游約126%.DOC中的SUVA254的均值為1.95L/(mg·m),河流縱向梯度上在中、下游河段增加較快,但其變化趨勢(shì)沒(méi)有DOC明顯.灞河水體從源頭到河口均不同程度的出現(xiàn)了代表類腐殖質(zhì)和類蛋白質(zhì)的熒光物質(zhì),與源區(qū)和上游相比,中游和下游沿岸接納了藍(lán)田縣和西安市大量工業(yè)廢水和生活污水,人為影響較大,大量DOM進(jìn)入河流內(nèi)造成中下游水體營(yíng)養(yǎng)鹽升高,微生物活動(dòng)活躍,浮游動(dòng)植物死亡分解后產(chǎn)生大量類蛋白物質(zhì),導(dǎo)致下游的類腐殖酸物質(zhì)和類蛋白物質(zhì)均較高,使其DOM兼具了陸源與生物來(lái)源的雙重特性.分別采用F(355)和F(280)來(lái)表征類腐殖質(zhì)組分和類蛋白組分的相對(duì)濃度[24](圖2b),其中F(355)表示陸生源對(duì)水體DOM 組成的貢獻(xiàn),F(280)表示自生源對(duì)水體DOM 組成的貢獻(xiàn).灞河F(355)相對(duì)濃度自源區(qū)向下依次為(209.95±82.18), (306.18±94.49), (278.59±67.9), (890.64±54.1)R.U.;而F(280)自源區(qū)向下依次為(115.91±22.37), (192.72±30.53), (282.76±22.41)和(724.29±383.41) R.U.,兩值在不同區(qū)段均差異極顯著(<0.01),灞河水體DOM中類蛋白類濃度自上而下呈現(xiàn)逐漸增高的趨勢(shì),DOM中腐殖類組分比重逐漸增加;而類腐殖質(zhì)組分濃度呈現(xiàn)先降低后逐漸升高的趨勢(shì),這主要是因?yàn)樵诤恿髟磪^(qū),冬季落葉腐爛分解產(chǎn)生腐殖酸隨融雪作用通過(guò)土壤淋溶和地下水等方式進(jìn)入河流使得源區(qū)DOM中類腐殖質(zhì)類物質(zhì)含量較多.隨著DOM隨水流的縱向輸移、稀釋和光降解作用,上游農(nóng)村河段較源頭水體中類腐殖質(zhì)物質(zhì)濃度有所降低,但總體相差不大.中游由于藍(lán)田縣城周邊的人類活動(dòng)和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的增加,生活污水和農(nóng)業(yè)灌溉等非點(diǎn)源排入,大量營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)入河流水體,使得河流初級(jí)生產(chǎn)力增加,腐殖質(zhì)濃度又呈升高趨勢(shì).下游污水廠出水口以下DOM中類蛋白類組分增強(qiáng)[25],這主要是因?yàn)楹恿鬟M(jìn)入城市后形成的景觀湖使得水流變緩,水深增加,以藻類為代表的內(nèi)源代謝過(guò)程增強(qiáng)所致.

圖2 各采樣點(diǎn)DOM樣本的Fn(355)和Fn(280)

根據(jù)PARAFAC模型區(qū)分DOM三維熒光光譜,灞河流域共有5個(gè)熒光組分(圖4和表1),包括3個(gè)腐殖質(zhì)類組分和2個(gè)蛋白質(zhì)類組分.組分C1(240, 320/ 400nm)的2個(gè)熒光峰對(duì)應(yīng)于傳統(tǒng)尋峰法對(duì)應(yīng)的A/C峰,是典型的陸源腐殖質(zhì)成份,與長(zhǎng)江溶解性有機(jī)質(zhì)組分中的H1非常接近[22].組分C2 (260~295/478~504nm)主要反映了長(zhǎng)波激發(fā)類腐殖質(zhì)的熒光性質(zhì),熒光峰對(duì)應(yīng)傳統(tǒng)的A/M峰,該組分在其他淡水河流及水庫(kù)中均有發(fā)現(xiàn),一般是分子量較高的芳香氨基酸,熒光特征與富里酸接近[25].組分C3 (240, 272~284/350~360nm)與色氨酸熒光峰(220~230, 270~280/350nm)接近,表明該組分為一個(gè)類色氨酸.組分C4 (255~275/326~336nm)與酪氨酸(270/320nm)接近,但發(fā)射峰的波長(zhǎng)有所紅移,表明C4主要為類酪氨酸組分,同時(shí)也含有一些類色氨酸的信號(hào).組分C5 (240/480nm)的單個(gè)熒光峰的發(fā)射峰比C1更長(zhǎng)一些,反映了該組分對(duì)應(yīng)于DOM中的高分子量和芳香類腐殖類物質(zhì),廣泛存在于河流中游濕地和上游森林環(huán)境中.

圖4 采用平行因子法識(shí)別的5個(gè)熒光組分

C1,C2和C5主要來(lái)自于陸源土壤徑流,枯葉腐爛釋放及地下水滲流等過(guò)程;C3與C4是由微生物和浮游植物作用所產(chǎn)生,主要受到外源生活廢水和農(nóng)業(yè)非點(diǎn)源影響.C3與C4熒光強(qiáng)度的順序?yàn)橄掠纬鞘卸?中游城鎮(zhèn)段>上游農(nóng)村段>源頭林區(qū)段,表明下游城市段中類蛋白物質(zhì)含量相對(duì)較高,這主要和城市河段中人類活動(dòng)導(dǎo)致的點(diǎn)源污染較多,污水處理廠主要分布在下游城市河段有關(guān);中游主要是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)區(qū)和城鎮(zhèn)生活區(qū),DOM主要通過(guò)地表徑流、生活污水直排和農(nóng)業(yè)非點(diǎn)源輸入河道,給微生物提供了充足的營(yíng)養(yǎng)來(lái)源,代謝活動(dòng)較為活躍,這有助于提高DOM中類蛋白質(zhì)的貢獻(xiàn)比例,源頭林區(qū)段DOM主要是樹(shù)葉等凋落腐爛分解所產(chǎn)生.

表1 5種熒光峰位置及指示意義

2.2 水體細(xì)菌OTU聚類、群落豐度與多樣性分析

各采樣點(diǎn)的OTU聚類結(jié)果(圖5a)測(cè)序文庫(kù)的覆蓋率均在98%以上,表明各個(gè)采樣點(diǎn)的測(cè)序結(jié)果足以代表樣本的真實(shí)情況.每個(gè)采樣點(diǎn)的有效序列數(shù)(用于OTU聚類等后續(xù)分析的有效數(shù)據(jù))均在20000以上,本次測(cè)序產(chǎn)生的OTUs是將所有樣品的有效序列進(jìn)行統(tǒng)計(jì),以97%的一致性將序列聚類而成[31-32],對(duì)OTUs的代表序列進(jìn)行物種注釋.稀釋曲線(圖5b)表明各采樣點(diǎn)在有效測(cè)序數(shù)達(dá)到45000時(shí),曲線已漸進(jìn)平緩,檢測(cè)出的細(xì)菌種類大都停留在2000個(gè)左右,表明用于OTU聚類的測(cè)序數(shù)滿足要求[33],且聚類產(chǎn)生的OTUs可以用于后續(xù)物種注釋.灞河流域17個(gè)水樣的高通量測(cè)序共得到1392466條高質(zhì)量基因序列.為了研究樣品的物種組成多樣性,對(duì)所有樣品的有效序列進(jìn)行聚類,以97%相似度劃分,得到7532條OTUs,單個(gè)水樣的OTU數(shù)量為1988~3111,平均值為2650.各樣本文庫(kù)的覆蓋率 (Coverage)范圍均在98.5%以上,能夠代表灞河水體細(xì)菌群落的真實(shí)情況.

對(duì)多樣性指數(shù)進(jìn)行分析(圖6a),Chao1指數(shù)的平均值為2866,最大值出現(xiàn)在S11采樣點(diǎn)(3459),最小值出現(xiàn)在S1采樣點(diǎn)(1779); Shannon 指數(shù)的平均值為7.58,最大值出現(xiàn)在S16采樣點(diǎn)(8.12),最小值出現(xiàn)在S4采樣點(diǎn)(6.61).基于多序列比對(duì)計(jì)算得出各采樣點(diǎn)的Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù),結(jié)果表明,各采樣點(diǎn)的Shannon指數(shù)為河口>中上游城鎮(zhèn)段>下游城市段>源區(qū); Simpson指數(shù)為中上游城鎮(zhèn)段>河口>下游城市段>源區(qū); Chao1指數(shù)為河口>下游城市段>中上游城鎮(zhèn)段>源區(qū); ACE指數(shù)為河口>下游城市段>中上游城鎮(zhèn)段>源區(qū).總體來(lái)看,Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)、Chao1指數(shù)和ACE指數(shù)為河口>下游城市段>上中游城鎮(zhèn)段>源區(qū),單因素方差分析表明不同采樣點(diǎn)Shannon指數(shù)不存在顯著差異(=0.257),Simpson指數(shù)、Chao1指數(shù)和ACE指數(shù)差異性顯著(<0.01).

描述灞河源頭到河口微生物物種組成的多樣性對(duì)于了解各種河流縱向尺度上水體中微生物多樣性的模式至關(guān)重要,可以考察不同河段的微生物生境多樣性,有利于了解整個(gè)灞河流域的微生物生產(chǎn)力差異.選用Weighted Unifrac距離指標(biāo)來(lái)衡量不同河段采樣點(diǎn)間的相異系數(shù)(圖6b).河流源頭(S1)與河口(S13)相異系數(shù)較大(0.532),浐、灞河交匯口之前(S10)與浐河城市段(S14)以及第三污水處理廠出水(S15)與第五污水處理廠出水(S11)相異系數(shù)較小,分別為0.076和0.094,下游河段微生物的多樣性降低,但其生產(chǎn)力提高.

2.3 灞河水體細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)變化特征

對(duì)17個(gè)灞河水樣進(jìn)行高通量分析得到6232條OTUs,在界、門、綱、目、科、屬和種分類水平上未能進(jìn)行分類的OTU 比例分別為3.61%,4.03%, 5.04%,7.07%,8.10%,27.64%和80.92%,表明在種分類水平上灞河水體存在大量未知類型細(xì)菌.圖7為門水平上的細(xì)菌分類,相對(duì)豐度最高的是變形菌門(Proteobacteria,54.22%),其次為擬桿菌門(Bacteroidetes, 19.40%)和厚壁菌門(Firmicutes, 12.28% ),三者占總基因序列的比例達(dá)到了85.91%.研究表明大多數(shù)的Proteobacteria門對(duì)DOM具有很強(qiáng)的代謝能力,使其在氮磷負(fù)荷較重的河流水體中占據(jù)主導(dǎo)地位[34]. Proteobacteria中豐度最高的是β-變形菌綱(Beta- proteobacteria,26.64%),其次為γ-變形菌綱(Gamma- proteobacteria,12.84%),ε-變形菌綱(Epsilon- proteobacteria,6.90%)和α-變形菌綱(Alpha- proteobacteria,5.90%). Bacteroidetes門是一個(gè)系統(tǒng)發(fā)育復(fù)雜且變化程度較高的群體,可以將復(fù)雜的有機(jī)高分子轉(zhuǎn)化為簡(jiǎn)單化合物,在水體生態(tài)系統(tǒng)中起著重要的作用[35].Bacteroidetes中豐度最高的是擬桿菌綱(Bacteroidia,7.94%),其次為黃桿菌綱(Flavobacteriia,7.02%);Firmicutes門中豐度最高的是梭菌綱(Clostcridia,5.69%),其次為芽孢桿菌綱(Bacilli,3.55%)和丹毒絲菌綱(Erysipelotrichia, 2.78%).此外,相對(duì)豐度較高的依次為藍(lán)藻菌門(Cyanobacteria,6.46%),放線菌門(Actinobacteria, 3.13%),疣微菌門(Verrucomicrobia,0.97%),梭桿菌門(Fusobacteria, 0.62%), Parcubacteria (0.37%),螺旋體菌門(Saccharibacteria,0.17%)和柔膜菌門(Tenericutes, 0.13%),其它門類別的平均相對(duì)豐度均小于0.1%.系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)表明位于同一河段的細(xì)菌組成可能較為相似,河源區(qū)(S1)中Bacteroidetes明顯高于Proteobacteria,下游河段Cyanobacteria豐度增加明顯,可能與下游景觀橡膠壩建設(shè)形成的湖泊水體停留時(shí)間較長(zhǎng)有關(guān),而中游城鎮(zhèn)河段采樣點(diǎn)中和污水排放有關(guān)的細(xì)菌門類Firmicutes則占據(jù)優(yōu)勢(shì).

圖8為細(xì)菌群落的屬水平分類,選取屬水平下相對(duì)豐度>1%的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌重新進(jìn)行相對(duì)豐度的計(jì)算,以更顯著地表明不同河段水體中優(yōu)勢(shì)細(xì)菌的豐度差異性(圖8).其中歸屬于Others的細(xì)菌主要有氣單孢菌屬()、極地單胞菌屬()、不動(dòng)桿菌屬()、阿克曼菌屬()等.河源區(qū)(S1)的主要優(yōu)勢(shì)類群為擬桿菌屬()、副狀桿菌屬()和無(wú)害梭菌屬([]__group),平均豐度分別為26.14%、7.61%和5.01%;河口區(qū)(S13)的主要優(yōu)勢(shì)類群為_(kāi)、和,平均豐度分別達(dá)到16.88%、7.89%和5.87%;值得注意的是,在每個(gè)采樣點(diǎn)均有檢出,其中S9的最高,其次是S3;、、、和分別在S4、S14、S3、S11和S1豐度最高.

圖7 UPGMA聚類樹(shù)與門水平優(yōu)勢(shì)灞河水體細(xì)菌

圖8 屬水平優(yōu)勢(shì)細(xì)菌豐度

選取門、綱、目、屬水平下相對(duì)豐度>1%的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌與不同河段進(jìn)行差異顯著性分析(表2).單因素方差分析表明,不同優(yōu)勢(shì)細(xì)菌在河段之間的差異顯著性不同.1類門水平優(yōu)勢(shì)細(xì)菌Proteobacteria (=0.011)、2類綱水平優(yōu)勢(shì)細(xì)菌Betaproteobacteria (=0.010)和Bacteroidia (=0.011)在河源區(qū)、城鎮(zhèn)段和城市段之間差異不顯著(30.01).3類門水平優(yōu)勢(shì)細(xì)菌(Bacteroidetes、Firmicutes和Cyanobacteria)、2類綱水平優(yōu)勢(shì)細(xì)菌(Gamma-proteobacteria和Cyanobacteria)、3類目水平優(yōu)勢(shì)細(xì)菌(Burkholderiales、Bacteroidales和Pseudomonadales)和3 類屬水平優(yōu)勢(shì)細(xì)菌(和)在不同河段之間差異非常顯著(<0.01).

表2 不同分類水平下優(yōu)勢(shì)細(xì)菌差異顯著性

注:**30.01.

浮游細(xì)菌是生源物質(zhì)循環(huán)轉(zhuǎn)化和生態(tài)系統(tǒng)能量流動(dòng)的關(guān)鍵物種,在水生生態(tài)系統(tǒng)中起著重要作用.國(guó)內(nèi)外大多數(shù)研究表明,Proteobacteria, Bacteroidetes和Actinobacteria等3個(gè)門類細(xì)菌是主導(dǎo)河流、湖泊等淡水水體中的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門類[35];黃河水體中微生物的研究表明,水體中細(xì)菌群落的季節(jié)差異性顯著,水電梯級(jí)開(kāi)發(fā)對(duì)微生物群落變化影響劇烈,種群分布的生物地理學(xué)特征明顯[36];南明河的研究表明TN和TP是細(xì)菌群落特征變化主要水質(zhì)因子[37].另外,河流的源流特征和流量變化也會(huì)影響細(xì)菌隨流輸運(yùn)的能力,對(duì)某些類型細(xì)菌如Firmicutes影響明顯[38-39].贛江豐水期細(xì)菌群落特征研究表明,暴雨徑流中Firmicutes會(huì)取代Actinobacteria和Proteobacteria成為豐度最高的菌群[38,40];Jeon等[41]研究發(fā)現(xiàn),沙塵細(xì)菌的優(yōu)勢(shì)群落為Firmicutes (53%)和Actinobacteria (18%); 英國(guó)Thames河的研究[42]表明,受河流的水流特性及輸運(yùn)能力的影響,細(xì)菌門類在河流的上、下游會(huì)發(fā)生結(jié)構(gòu)性變化.本次研究區(qū)從灞河上游到灞河河口,Proteobacteria雖然一直是相對(duì)豐度最高的門分類群落,但下游河段中Cyanobacteria的相對(duì)豐度在逐漸增加,與以上研究結(jié)果相類似;但Cyanobacteria的豐度位于Bacteroidetes和Firmicutes之后,這主要是由于冬季溫度較低,抑制了Cyanobacteria細(xì)菌的生長(zhǎng)和繁殖,而冬季灞河流量較小,中游水體中未經(jīng)處理的生活及糞便污水排放貢獻(xiàn)增加,導(dǎo)致Firmicutes和Bacteroidetes豐度較高.Vannote等[43]提出了河流連續(xù)體概念,認(rèn)為河流生態(tài)群落能夠改變自己的結(jié)構(gòu)和功能牲,使之適應(yīng)具有連續(xù)梯度的非生物環(huán)境.本次研究區(qū)上、下游河流長(zhǎng)度約為107km,較短的距離使各采樣點(diǎn)間的生物多樣性及群落結(jié)構(gòu)差異不顯著.

2.4 浮游細(xì)菌與水環(huán)境因子的相關(guān)性

為探究環(huán)境因子對(duì)水體中微生物種群分布的影響,對(duì)主要門分類種群(平均豐度大于0.5%)和水質(zhì)因子進(jìn)行冗余分析(圖9),第一主軸對(duì)門水平細(xì)菌群落方差變化的解釋量為46.3%,第二主軸的解釋量為16.3%.其中DO、pH值和TP與第一主軸呈顯著正相關(guān);水溫()、NO3--N、TN、EC和Chl-a與第一主軸呈顯著負(fù)相關(guān);除了ORP與第二主軸呈現(xiàn)弱負(fù)相關(guān)外,其余環(huán)境指標(biāo)均與第二主軸呈正相關(guān).可見(jiàn),水環(huán)境中的營(yíng)養(yǎng)鹽水平、水溫、電導(dǎo)率及pH值均對(duì)灞河冬季水體中細(xì)菌群落有一定影響.

第一大門分類種群Proteobacteria受溫度影響較大,且與NO3--N呈較強(qiáng)正相關(guān)關(guān)系,相關(guān)系數(shù)均大于0.850; 而第二大門分類種群Bacteroidetes則恰好相反,與溫度、NO3--N、DOC、TN等環(huán)境因子呈較強(qiáng)的負(fù)相關(guān)關(guān)系;第三大門類種群Firmicutes與DO呈現(xiàn)顯著正相關(guān)性(<0.05),相關(guān)系數(shù)為0.881,且與pH和TP呈正相關(guān).Cyanobacteria和Actinobacteria門類種群與DO、pH值和TP呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)關(guān)系,Verrucomicrobia門類種群與DO呈現(xiàn)正相關(guān),與溫度和NO3--N呈現(xiàn)負(fù)相關(guān).

圖9 浮游細(xì)菌與環(huán)境因子的RDA圖

河流水體細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)受多種環(huán)境及水質(zhì)因子的影響,不同研究中得到結(jié)論差別較大(表3).就單次采樣結(jié)果而言,水質(zhì)指標(biāo)對(duì)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的空間變化產(chǎn)生主要影響.如Liu等[44]對(duì)東江研究發(fā)現(xiàn)氮營(yíng)養(yǎng)鹽是影響細(xì)菌群落的主要因素;唐婧等[37]對(duì)南明河細(xì)菌群落研究發(fā)現(xiàn)TN和TP是其主要影響因子.地中海間歇性河流的研究表明河流水文破碎影響了河流環(huán)境特征(如氧化還原勢(shì)和DOC質(zhì)量),促使細(xì)菌群落選擇性分布[45].在淡水系統(tǒng)中,溶解性無(wú)機(jī)氮(DIN)對(duì)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響,特定細(xì)菌系統(tǒng)構(gòu)型與DIN之間存在明顯相關(guān)關(guān)系.Gao等[46]發(fā)現(xiàn)溪流水體生物膜的Beta-proteobacteria和Gamma- proteobacteria多存在于DOC和NO3--N濃度高的區(qū)域,而Alpha-proteobacteria則在DOC和NO3--N負(fù)荷低的環(huán)境中更豐富.相比之下,不同形態(tài)的P則對(duì)細(xì)菌群落的豐度或組成影響不大,盡管之前的觀測(cè)表明夏季浮游生物群落在河流受到P的限制強(qiáng)烈.從我們的研究結(jié)果來(lái)看,在灞河流域水體中,NO3--N是驅(qū)動(dòng)細(xì)菌群落變化的更重要因素,這與之前的研究結(jié)果類似.然而,需要指出的是,土地利用、河流生態(tài)水文過(guò)程及人類活動(dòng)均會(huì)對(duì)微生物群落特征產(chǎn)生重要影響,需要對(duì)復(fù)雜因素進(jìn)行更深入分析和辨明.

表3 國(guó)內(nèi)外河流基于16S rRNA方法的細(xì)菌群落及影響因子研究結(jié)果

注:——表示文獻(xiàn)中未進(jìn)行細(xì)菌群落影響因子的研究.

表4 灞河水體DOM不同熒光組分之間的相關(guān)性

注:**<0.01.

2.5 DOM熒光組分與水體細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的相關(guān)性

進(jìn)一步探究DOM各熒光組分對(duì)灞河水體細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響可以發(fā)現(xiàn),第一主成分中所包含的類腐殖質(zhì)組分(C1,C2和C5)以及類蛋白質(zhì)組分(C3和C4)之間表現(xiàn)出正相關(guān)關(guān)系(表4),而DOM各組分與Beta-proteobacteria和Chloroplast菌群表現(xiàn)出弱正相關(guān)關(guān)系,與Bacteroidia和Clostridia菌群則表現(xiàn)出弱負(fù)相關(guān)關(guān)系(圖10),且對(duì)上游和中游點(diǎn)位的影響比較明顯.DOM熒光組分之間正相關(guān)性暗示第一主成分中類腐殖質(zhì)和類蛋白質(zhì)組分可能具有相同的來(lái)源,而類腐殖質(zhì)熒光組分C1和C2具有典型的“陸生源”性質(zhì),在河流水體陸源DOM生物地球化學(xué)轉(zhuǎn)化和光解動(dòng)力學(xué)過(guò)程中Beta-proteobacteria和Chloroplast菌群對(duì)其有一定促進(jìn)作用[34],因此第一主成分主要反映了由灞河流域外源輸入的DOM熒光組分(含腐殖質(zhì)類和蛋白質(zhì)類),其貢獻(xiàn)率為41.8%.第二主成分中Alpha-proteobacteria、Beta-proteobacteria和Chloroplast之間表現(xiàn)為正相關(guān)關(guān)系,而DOM各組分與其他菌群均表現(xiàn)出弱負(fù)相關(guān)關(guān)系.第二主成分中,隨著采樣點(diǎn)分布變化,Beta-proteobacteria、Alpha-proteobacteria和Chloroplast等細(xì)菌呈縱向梯度變化.因此第二主成分主要反映了灞河流域在河流縱向梯度上細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)變化特征,其貢獻(xiàn)率為15.5%.

圖10 浮游細(xì)菌與DOM組分的主成分分析載荷圖

已有研究表明,河流的生物地球化學(xué)過(guò)程對(duì)微生物種群組成和功能有重要影響[4].通常認(rèn)為DOM的濃度和組成、細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)以及其他因素以復(fù)雜的方式相互作用以促進(jìn)胞外酶活性,從而驅(qū)動(dòng)DOM的水解,并最終在水生生態(tài)系統(tǒng)中通過(guò)異養(yǎng)細(xì)菌使DOM礦化[45].河流中的DOM通常以陸生有機(jī)物質(zhì)為主,其穩(wěn)定性相對(duì)較高.浮游生物生成的DOM富含蛋白質(zhì)和不穩(wěn)定多糖,而陸生DOM含有腐殖質(zhì)和結(jié)構(gòu)多糖,如纖維素和木質(zhì)素,陸生DOM對(duì)微生物礦化作用具有相對(duì)較高的抗性.DOM組成及來(lái)源對(duì)細(xì)菌的影響不僅體現(xiàn)在細(xì)菌的豐度、形態(tài)類型、細(xì)胞大小以及附著細(xì)菌與自由活動(dòng)細(xì)菌比例上的變化,還體現(xiàn)在細(xì)菌群組內(nèi)不同群體之間相對(duì)貢獻(xiàn)上.此外,DOM還與一些細(xì)菌群落具有較強(qiáng)相關(guān)性,特別是當(dāng)與Beta-proteobacteria共存時(shí),它們?nèi)郝涞呢S度隨著DOM濃度的增加而增加.Beta-proteobacteria通常包括快速生長(zhǎng)的大細(xì)胞,這些細(xì)胞可快速影響不穩(wěn)定的DOM組分的光解和生物動(dòng)力學(xué)過(guò)程.藻類的裂解產(chǎn)物可能富含不穩(wěn)定的有機(jī)化合物,細(xì)菌系統(tǒng)中的一些已知菌屬則會(huì)利用某些浮游植物的分泌物來(lái)促進(jìn)其細(xì)胞生長(zhǎng)和菌群的發(fā)育[55-56].因此,從灞河上游到下游水域,Beta-proteobacteria數(shù)量的增加可能部分與浮游植物群落季節(jié)性變化所產(chǎn)生的DOM的生物可利用性或來(lái)源的變化有關(guān).

然而,相關(guān)研究同時(shí)也表明,僅僅依靠DOM組成和濃度對(duì)細(xì)菌多樣性進(jìn)行預(yù)測(cè)的效果并不理想,因?yàn)椴煌木簩?duì)DOM的質(zhì)量和不穩(wěn)定性有不同的反應(yīng).Cottrell和Kirchman[49]發(fā)現(xiàn)特定細(xì)菌對(duì)DOM使用上的差異,在Proteobacteria和Cytophaga- like細(xì)菌的系統(tǒng)分類中,Cytophaga-like細(xì)菌擅長(zhǎng)使用生物聚合物和高分子量的DOM,如果這些菌群使用DOM的方式或?qū)OM的反應(yīng)存在系統(tǒng)性差異,或者這些菌群始終由DOM利用率不同的少數(shù)菌屬所主導(dǎo),則DOM的變化可能影響這些系統(tǒng)發(fā)育群的豐度.然而,目前尚不清楚細(xì)菌對(duì)DOM使用在這個(gè)系統(tǒng)發(fā)育水平上是否具有普遍性,因?yàn)檫@些菌群每一個(gè)都包含不同分類水平,這些分類水平下的子群落變化可能隨時(shí)間和空間而差異很大,因此,細(xì)菌各分類水平下菌群變化對(duì)DOM不同組分的作用機(jī)制有待進(jìn)一步探索.

3 結(jié)論

3.1 灞河水體DOM熒光組分中含有3個(gè)腐殖質(zhì)類組分和2個(gè)蛋白類組分,5各組分之間相關(guān)性較好.從河流源區(qū)到河口,DOM在縱向河流梯度有明顯的降解程度和來(lái)源的空間差異,下游城市河段緩流水體DOC濃度升高并趨于穩(wěn)定,微生物及光解過(guò)程對(duì)下游水體有機(jī)質(zhì)的降解能力逐步增強(qiáng).

3.2 灞河水體中相對(duì)豐度最高的是變形菌門(Proteobacteria,54.22%),其次分別為擬桿菌門(Bacteroidetes,19.40%)、厚壁菌門(Firmicutes, 12.28%)、藍(lán)藻菌門(Cyanobacteria,6.46%)和放線菌門(Actinobacteria,3.13%).在屬分類水平上,黃桿菌屬(,6.37%)與弓形桿菌屬(, 6.30%)是灞河水體中優(yōu)勢(shì)類群.在屬和種分類水平上,灞河水體存在大量未知類型細(xì)菌.

3.3 河流水體細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)受水體中營(yíng)養(yǎng)鹽水平、水溫、電導(dǎo)率及pH值影響明顯.DOM各組分與浮游菌群有一定相關(guān)關(guān)系,且沿河流縱向梯度變化明顯,不同菌群對(duì)DOM的質(zhì)量和穩(wěn)定性有不同反應(yīng).

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Fluorescence spectroscopic characteristics of DOM and its effects on bacterial composition in Bahe River basin.

YUAN Bo, WU Wei, GUO Meng-jing, ZHENG Xing, ZHOU Xiao-de*

(State Key Laboratory of Eco-hydraulics in Northwest Arid Region, Xi'an University of Technology, Xi'an 710048, China)., 2019,39(8)：3383~3395

In order to explore the effects of dissolved organic matter (DOM) composition and source on bacterial community structure and diversity, and the role of bacterial community structure in controlling DOM composition and degradation, the fluorescence components and spatial distribution of DOM in Bahe River during dry season (December) were examined using three-dimensional fluorescence spectroscopy combined with parallel factor analysis (EEM-PARAFAC). The results showed that the DOM fluorescent components of Bahe River were divided into five components by PARAFAC, including three humus components (C1:240,320/400nm; C2:260~295/478~504nm; C5:240/480nm) and two protein components (C3:240,272~284/350~360nm; C4:255~275/326~336nm). A relatively strong correlation was observed among the five components, respectively. It was shown that these two types of fluorescent components had similar source properties. Proteobacteria (54.22%), Bacteroidetes (19.40%), Firmicutes (12.28%), Cyanobacteria (6.46%) and Actinobacteria (3.13%) were the dominant phylum in Bahe River. The nutrient concentration, water temperature, electrical conductivity and pH of river water had effects on the bacterial community. The correlation between fluorescent components (humic-like and proteinic-like) of DOM and the bacterioplankton community was significant along the longitudinal gradient of the river. Different bacterial communities may have different responses to the quality and instability of DOM, which can provide information on the effects of biogeochemical processes of rivers on the composition and function of the microbial population.

dissolved organic matter；bacterial community structure；high throughput sequencing；environmental factors

X172

A

1000-6923(2019)08-3383-13

袁 博(1986-),男,陜西洛南人,西安理工大學(xué)博士生,主要研究方向?yàn)樗こ躺鷳B(tài)環(huán)境效應(yīng)與生物地球化學(xué)循環(huán).

2019-01-11

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(91747206,41807156);陜西省教育廳重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室資助項(xiàng)目(18JS073)

* 責(zé)任作者, 教授, zhouxd@mail.xaut.edu.cn