寡養(yǎng)單胞菌對S2-氧化特性及主要代謝途徑

徐瑤瑤,宋 晨,路金霞,王 進,岳正波,劉曉玲*

寡養(yǎng)單胞菌對S2-氧化特性及主要代謝途徑

徐瑤瑤1,2,宋 晨3,4,路金霞1,王 進2,岳正波2,劉曉玲1*

(1.中國環(huán)境科學研究院,北京 100012；2.合肥工業(yè)大學資源與環(huán)境工程學院,安徽 合肥 230009；3.南京瑞迪建設科技有限公司,江蘇 南京 210029；4.南京水利科學研究院,江蘇 南京 225600)

以無機硫(S2)-為目標污染物,從北京東沙河黑臭水體篩選出一株能夠高效氧化S2-的土著硫氧化菌,并對其進行16S rRNA測序及生理生化特性鑒定,結果表明,該菌株屬于寡養(yǎng)單胞菌屬(),命名為sp.sp3.菌株sp3在溫度25℃,初始pH值7.0,初始葡萄糖濃度0.25%,初始菌濃度1.00g/L時,菌株sp3對S2-的氧化率最高.在此適宜條件下,反應60h后,菌株sp3對S2-的最高氧化率達到86.6%.S2-的濃度在整個氧化過程中持續(xù)下降后保持穩(wěn)定,在此過程中產生了S0,S2O32-,SO32-以及SO42-這4種其它存在形態(tài)的硫.隨著S2-被氧化,SO42-的濃度呈緩慢上升的趨勢.利用高通量測序技術推測菌株sp3主要是通過副球菌硫氧化途徑(PSO)將非穩(wěn)定態(tài)的S2-逐步轉化為穩(wěn)定態(tài)的SO42-.在此代謝途徑中,一部分S2-被氧化為S0,另一部分S2-則直接氧化為SO32-;S0與SO32-可自發(fā)反應生成S2O32-,而S2O32-發(fā)生歧化反應再釋放出SO32-和S0;反應生成的部分SO32-繼續(xù)直接氧化為SO42-.菌株sp3在黑臭水體的水質凈化過程中有一定的應用前景.

S2-；篩選；硫氧化特性；代謝途徑

近年來工業(yè)化、城市化的快速發(fā)展造成了嚴重的水環(huán)境污染,城市建成區(qū)及周邊許多河流出現(xiàn)了常年性或者季節(jié)性的黑臭現(xiàn)象,已成為中國日益突出的環(huán)境問題之一.國務院頒布的《水污染防治行動計劃》[1]對黑臭水體提出了分階段治理目標,要求到2020年,地級及以上城市建成區(qū)黑臭水體均控制在10%以內.據(jù)統(tǒng)計,截至2018年5月,全國排查確認黑臭水體2100個,其中36個重點城市黑臭水體總數(shù)為897個,整治完成率平均為70%[2].加快城市黑臭水體治理已成為我國當前解決突出環(huán)境問題的主要任務之一.

水體黑臭現(xiàn)象成因復雜,涉及物理、化學和生物等諸多過程,影響因素較多.已有研究表明,上覆水中的S2-是導致水體變黑的關鍵因素,它與水體中Fe2+、Mn2+、Cu2+等金屬離子結合,并累積生成金屬硫化物,從而引起水體變黑[3-6].因此,將黑臭水體中的S2-氧化為價態(tài)穩(wěn)定的SO42-可避免水體變黑現(xiàn)象的產生.S2-的氧化過程在自然環(huán)境下非常緩慢,主要依靠天然水體中的土著硫氧化菌(SOB)完成[7-8].這使得外源輸入的S2-在黑臭水體中進一步富集,導致水質出現(xiàn)惡化[9].S2-等黑臭水體中污染物質的去除方法主要包括曝氣復氧[10]、底泥疏浚[11-12]、強化混凝[13-14]和微生物法[15-16]等.其中,微生物法具有針對性強、對環(huán)境無二次污染等優(yōu)點,已被成功應用于中小河道的治理中[17-18].目前,針對黑臭水體治理,微生物菌劑的開發(fā)已開展了一些研究工作,主要包括不動桿菌()、乳酸菌()、芽孢桿菌()和假單胞菌()等[19-21].但是,這些微生物菌劑以非硫氧化菌為主,且集中于菌劑對水體中COD、NH3-N和TP等污染物的去除效果研究,鮮少涉及對黑臭水體中致黑關鍵污染物S2-的去除影響研究.

本研究從北京東沙河黑臭水體中篩選分離1株能夠高效氧化S2-的土著硫氧化菌株,考察菌株的生長特性及其對S2-的氧化特性,研究S2-的氧化過程,并利用高通量測序技術探討菌株對S2-生物氧化的主要代謝途徑,以期為黑臭水體治理及含S2-工業(yè)廢水的處理提供高效硫氧化菌菌源.

1 材料與方法

1.1 硫氧化菌的篩選及富集

1.1.1 硫氧化菌的來源 東沙河是北京市典型的黑臭水體[3].本實驗從北京東沙河采集底泥與水樣等比例混合均勻,以此泥水混合物作為微生物富集分離培養(yǎng)的來源.水樣采集于東沙河表層水,經10μm的膜過濾,剔除大塊懸浮顆粒、藻類和浮萍等雜質.底泥用抓泥斗采集于水下0.5~1.0m,剔除石塊和動植物殘體等雜質.采樣時進行多點布置,確保菌源的多樣性.

1.1.2 培養(yǎng)基 實驗所用培養(yǎng)基分別為富集培養(yǎng)基:Na2S·9H2O 0.162g/L,可溶性淀粉2g/L,KNO30.1g/L,K2HPO40.05g/L,NaCl 0.05g/L,MgSO4·7H2O 0.05g/L,FeSO40.001g/L,營養(yǎng)瓊脂 2%;分離純化培養(yǎng)基:Na2S·9H2O 0.162g/L,KNO30.1g/L,K2HPO40.05g/L,NaCl 0.05g/L,MgSO4·7H2O 0.05g/L,FeSO40.001g/L,葡萄糖 20g/L,蛋白胨10g/L,酵母浸膏粉5g/L,瓊脂 15~20g/L;液體培養(yǎng)基:葡萄糖 20g/L,蛋白胨10g/L,酵母浸膏粉10g/L. 每種培養(yǎng)基在使用前均調節(jié)pH值至7.0,在100Mpa和121℃條件下滅菌20min.

1.1.3 菌種的富集與分離 取5mL泥水混合物稀釋于500mL濃度為5%無菌NaCl溶液,再將其接種于富集培養(yǎng)基(S2-濃度為21.6mg/L)中,于25℃恒溫培養(yǎng)2~3d.待硫氧化菌在培養(yǎng)基中大量生長后,選取長勢較好的單菌落在分離純化培養(yǎng)基上進行劃線,于25℃恒溫培養(yǎng)2~3d.不斷重復進行劃線分離,直至平板上所有菌落特征一致,即為硫氧化單菌株.

1.1.4 種子液的制備與擴培發(fā)酵 用接種環(huán)挑取分離純化出來的硫氧化菌,接種到裝有100mL液體培養(yǎng)基的錐形瓶中,轉速120r/min,25℃恒溫培養(yǎng)2d后用作種子液,再按照5%的接種量轉接至新鮮的液體培養(yǎng)基中,于25℃,120r/min的恒溫搖床中培養(yǎng)2d分批次發(fā)酵,用于黑臭水體硫氧化實驗.

1.2 菌株的鑒定

1.2.1 16S rRNA測序 采用生工生物工程(上海)股份有限公司的Ezup柱式細菌基因組DNA抽提試劑盒SK8255對硫氧化菌總DNA進行抽提,具體實驗步驟遵照試劑盒說明書進行.設計引物序列為27F(AGTTTGATCMTGGCTCAG)和1492R(GGTTACCTTGTTACGACTT).以細菌總DNA為模板,PCR擴增,長度為1500bp.最后由生工生物工程(上海)股份有限公司完成測序工作.將堿基序列測序結果通過Blast程序和GenBank中核糖數(shù)據(jù)進行同源性分析,構建系統(tǒng)發(fā)育樹.

1.2.2 形態(tài)及生理生化特性實驗 (1)菌落形態(tài)觀察:采用平板稀釋法將分離純化所獲得的硫氧化單菌株涂布于固體培養(yǎng)基上,在25℃下恒溫培養(yǎng)2~3d,待菌落生長出來后,觀察并記錄其表面形態(tài),大小,顏色等菌落特征.(2)菌株生理生化特性實驗:參考東秀珠等編著的《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》[22]和沈萍等編著的《微生物學實驗》[23],完成硫氧化菌株生理生化特性實驗.

1.3 含S2-廢水的配制

實驗采用人工配置的含S2-廢水.根據(jù)Zhuang等[24]的描述對配水成分進行優(yōu)化,主要成分見表1.含S2-廢水配制后滅菌備用.滅菌條件為:100MPa, 121℃滅菌20min.

表1 含S2-人工配制廢水

1.4 硫氧化最適條件及硫氧化菌的生長

將擴培發(fā)酵實驗中生長至穩(wěn)定期的硫氧化菌接入裝有200mL含S2-人工配制廢水的錐形瓶中,于120r/min轉速條件下進行生物氧化反應,分別考察溫度(5,15,20,25,30,35℃),pH值(4,5,6,7,8),葡萄糖濃度(0.05%,0.10%,0.25%,0.50%,1.00%)及初始菌濃度(0.01,0.10,1.00,2.00,5.00g/L)對S2-氧化率的影響,測定反應過程中細菌生長量OD600值,進而確定硫氧化菌對S2-的最適生物氧化條件.在最適S2-氧化條件下,通過定時測定細菌生長量和剩余S2-濃度,繪制硫氧化菌的生長曲線和S2-氧化曲線.

硫氧化菌對S2-的生物氧化途徑研究在最適的硫氧化條件下進行.實驗設計2組容積為5L的生化反應裝置,每組設置3個平行實驗.將硫氧化菌按1g/L的接種量轉接至含S2-人工配制廢水中(實驗組),設立不添加硫氧化菌的對照組.反應過程中定時取樣,測定水樣中S2-,S0,S2O32-,S4O62-,SO32-和SO42-的質量濃度.

1.5 硫氧化菌對硫離子的生物氧化途徑分析

1.5.1 基因組制備與測序 硫氧化菌總DNA提取采用美國Omega公司的E.Z.N.A.? DNA Kit試劑盒進行樣品DNA抽提,PE文庫構建采用美國Illumina公司的TruSeq? DNA Sample Prep Kit試劑盒,橋式PCR建立采用美國Illumina公司的HiSeq PE Cluster Kit v4 cBot,最后進行Illumina Hiseq測序過程.基因組測序事宜委托上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成.

1.5.2 基因組組裝與注釋 對測序完成后所獲得的Reads進行質量剪切工作,以去除Illumina Hiseq原始測序過程中產生的一些質量較低的Reads,使用IDBA-UD軟件拼接組裝優(yōu)化序列,以獲得最優(yōu)選的組裝結果.利用Glimmer 3.02軟件進行細菌的基因預測,將預測基因的蛋白序列分別與Nr、Genes、String和Go等數(shù)據(jù)庫進行blastp比對,從而獲得所預測基因的注釋信息.

1.6 硫氧化菌對黑臭水體處理實驗

黑臭水樣取自于北京市東沙河黑臭河段,具體水質參數(shù)如表2所示.將培養(yǎng)后的硫氧化菌以1g/L的接種量接種于裝有200mL黑臭水樣的錐形瓶中.同時設立不添加硫氧化菌的對照組,每組設置3個平行實驗.在120r/min轉速和25℃下反應60h,測定S2-的氧化率,以及COD,NH3-N,TP及色度的去除率.

表2 黑臭水樣主要水質參數(shù)

1.7 分析測定方法

水樣中測定指標包括S2-,S0,S2O32-,S4O62-,SO32-, SO42-,COD,NH3-N,TP,色度和OD600.S2-和S0采用分光光度法測定,S2O32-,SO32-和SO42-采用離子色譜儀(CIC-D120,青島盛翰)測定.S4O62-采用高效液相色譜法(LC-10AD,島津液相)測定.COD和NH3-N采用HACH多參數(shù)水質測定儀(DB2800,美國哈希)測定,TP采用紫外分光光度計(UV-1800,日本島津)測定.色度評價參照稀釋倍數(shù)法[25].硫氧化菌生長量按照馮玉雪等[26]描述的細菌計數(shù)法測定,即以OD600值來表示細菌的生長量.

每組實驗設置3個平行樣品,每組實驗數(shù)據(jù)測3次求平均值.數(shù)據(jù)處理及分析分別采用OriginPro 9.0和Microsoft Excel 2013軟件.

2 結果與討論

2.1 硫氧化菌的篩選與分離

用以硫化鈉為目標物的培養(yǎng)基進行菌種篩選和分離.通過富集培養(yǎng)和分離純化,從東沙河泥水混合物中分離得到1株能高效氧化黑臭水體致黑關鍵污染物即S2-的土著硫氧化菌,在S2-濃度為21.6mg/L的培養(yǎng)基上,S2-氧化率可達到60%以上,將其命名為sp3.

2.2 菌種的鑒定

2.2.1 16S rRNA測序鑒定 通過NCBI中的Blast工具將測序得到的菌株sp3的16S rRNA 基因序列與GenBank中其它菌株的16S rRNA序列進行同源性對比.結果表明,菌株sp3的16S rRNA基因序列與菌屬的多株菌株同源性高達99%以上.為此,菌株sp3鑒定為屬.為進一步分析菌株sp3的系統(tǒng)進化位置,選取相似度最高的10條已命名純培養(yǎng)菌株的16S rRNA基因序列,利用Mega7軟件構建系統(tǒng)發(fā)育樹,結果如圖1所示.

2.2.2 形態(tài)及生理生化鑒定 菌株sp3在營養(yǎng)瓊脂上進行25℃恒溫培養(yǎng)后,為灰黃色不透明圓形菌落,邊緣光滑,部分不規(guī)則,質地粘稠,菌落有氨氣味,直徑0.5~1mm,中央突起.通過革蘭氏染色實驗觀察到菌株sp3顏色呈紅色,為革蘭氏陰性菌,且菌體微小呈短桿狀.生理生化特性實驗結果表明,菌株sp3具有賴氨酸脫羧酶活性,可還原硝酸鹽和利用麥芽糖,并可水解七葉苷和液化明膠.由此可見,菌株sp3與的個體形態(tài)和生理生化特性具有相似性[27].結合菌株sp3的16S rRNA測序鑒定結果,初步確定菌株sp3為寡養(yǎng)單胞菌屬.寡養(yǎng)單胞菌屬代謝功能多樣,大多體現(xiàn)在對抗生素的耐藥性、降解有機磷、降解DDT[28-30]等方面的研究,關于硫氧化功能研究鮮有報道.

圖1 菌株sp3系統(tǒng)發(fā)育樹

2.3 菌株sp3的生長及硫氧化特性

2.3.1 溫度對菌株生長及S2-氧化率的影響 如圖2(a)所示,菌株sp3的生長量和對S2-的氧化率均隨著溫度的升高而增加,在溫度為25℃時達到最高,此時S2-的氧化率高達85.2%.當溫度繼續(xù)提高至35℃時,菌株sp3的生長量和對S2-的氧化率略有下降.可以明顯得出,菌株sp3嗜中溫,能夠在溫度適宜的條件下,尤其是25℃進行各項代謝活動.因此,控制溫度為25℃對S2-的氧化較為適宜.

2.3.2 初始pH值對菌株生長及S2-氧化率的影響 如圖2(b)所示,菌株sp3的生長量和對S2-的氧化率隨著初始pH值由強酸性到弱堿性呈現(xiàn)先上升后顯著下降的變化趨勢.當初始pH值在6~7范圍內時,菌株sp3的生長較好,S2-的氧化率亦較高,皆達到85%左右.堿性條件不適合菌株sp3生長,也不利于對S2-的生物氧化.因此,初始pH值為7時較為適宜菌株sp3的生長及對S2-的生物氧化.

2.3.3 初始葡萄糖濃度對菌株生長及S2-氧化率的影響 如圖2(c)所示,當初始葡萄糖濃度由0.05%提高至0.25%時,菌株sp3的生長量顯著增加.這說明葡萄糖是菌株sp3可利用的碳源,能促進細菌的生長繁殖.當初始葡萄糖濃度繼續(xù)提高至1%時,菌株sp3生長量的增長趨于緩慢,這是因為微生物細胞膜輸入葡萄糖的能力趨近飽和.S2-的氧化率隨著初始葡萄糖濃度的提高呈現(xiàn)先增加后下降的變化趨勢.當初始葡萄糖濃度為0.25%時,菌株sp3對S2-的生物氧化能力最強,S2-的氧化率達到83%左右.因此,最適宜的初始葡萄糖濃度為0.25%.

2.3.4 初始菌濃度對菌株生長及S2-氧化率的影響 如圖2(d)所示,初始菌濃度是影響S2-去除效率的重要因素之一.當初始菌濃度由0.01g/L提高至1.00g/L時,S2-的氧化率達到最高,為81.3%.繼續(xù)提高初始菌濃度后,菌株sp3對S2-的氧化卻保持基本穩(wěn)定.Pradhan等[31]研究亦發(fā)現(xiàn),將菌株生物量由0.064g提高1倍時,微生物對Cu2+的去除率卻不再增加.因此,在本研究中最適的初始菌濃度為1.00g/L.

2.3.5 菌株sp3的生長曲線與S2-氧化曲線 將菌株sp3在最適條件下培養(yǎng)72h,得到S2-的剩余濃度及菌株生長量的變化曲線,如圖3所示.菌株sp3的生長曲線符合細菌的群體生長規(guī)律.前16h為菌株的延滯期.隨著菌株的加入,S2-剩余濃度開始迅速下降.在第16h后,菌株開始快速生長,至第35h達到最大值.因此,這19h為菌株的對數(shù)生長期.在此期間,菌株對S2-的氧化反應繼續(xù)進行,促使S2-的剩余濃度持續(xù)下降.在第35~60h,菌株sp3的數(shù)量處于基本穩(wěn)定的狀態(tài),菌株的生長進入穩(wěn)定期.在菌株sp3穩(wěn)定期,S2-的剩余濃度緩慢下降,在第60h達到最低值,為2.9mg/L,S2-氧化率高達86.6%.此后,菌株的數(shù)量開始迅速下降,菌株sp3處于衰亡期.而S2-的剩余濃度在菌株sp3的衰亡期保持基本穩(wěn)定的狀態(tài).可以明顯得出,菌株sp3對S2-的生物氧化過程發(fā)生在前35h,即菌株sp3的延滯期和對數(shù)生長期.

2.4 菌株sp3對S2-的生物氧化過程與主要代謝途徑

2.4.1 菌株sp3對S2-的生物氧化過程 S2-在生物氧化過程中可能涉及6種不同的存在形態(tài),包括S2-,S0,S2O32-,S4O62-,SO32-以及SO42-.因此,通過測定這6種無機硫存在形態(tài)的變化可推測S2-的生物氧化過程.在最適條件下,S2-在菌株sp3氧化作用過程中硫的存在形態(tài)變化如圖4(a)所示.隨著S2-生物氧化過程的進行,檢測到不同存在形態(tài)的無機硫,包括S2-,S0,S2O32-,SO32-以及SO42-,并且這些無機硫濃度的變化在整個反應過程中呈現(xiàn)明顯差異.由于S2-作為電子供體被氧化為其它價態(tài)的無機硫,它的濃度在前10h迅速下降;隨后緩慢減少并逐漸趨于平緩,在反應30h后,水樣中S2-的剩余濃度為3.0mg/L,其氧化率達到86.1%.S0,S2O32-和SO32-的濃度隨著反應進行呈現(xiàn)明顯的波動,這說明這些存在形態(tài)的無機硫在反應過程中同時存在生成與消耗2個過程.S0和SO32-濃度均呈現(xiàn)先上升后下降再上升的變化趨勢,它們的濃度分別于18和45h達到最大值,這可能與前18h內S2-的氧化消耗有關.S2O32-的濃度呈現(xiàn)先上升后下降并逐漸趨于平穩(wěn)的變化趨勢,它的濃度在第8h取得最大值,為11.2mg/L.與S2-的濃度變化相反,SO42-的濃度在反應過程中則持續(xù)增加,最終達到9.2mg/L.Zhuang等[24]發(fā)現(xiàn),初始濃度為200mg/L的含S2-廢水在加入菌株ZJY-7后,SO42-的濃度隨著S2-的不斷氧化持續(xù)增加,達到91.8mg/L后保存穩(wěn)定.

圖3 菌株sp3的生長曲線和S2-氧化曲線

上述結果表明,菌株sp3對S2-的氧化過程是將非穩(wěn)定態(tài)的S2-逐步轉化為穩(wěn)定態(tài)SO42-的過程.其中伴隨著一系列中間存在形態(tài)無機硫的產生.這些無機硫最終部分轉化為SO42-.需要說明的是,在整個反應中并未檢測到S4O62-.此外,在未添加菌株sp3的對照組中,S2-的濃度呈現(xiàn)略微下降的趨勢,并檢測到極低濃度的S2O32-和SO42-產生,如圖4(b)所示.其它存在形態(tài)的無機硫在反應過程中并未檢測到.可以得出,菌株sp3的添加可明顯促進S2-的生物氧化.

2.4.2 硫離子氧化功能基因 為了探討硫氧化菌sp3對S2-氧化的主要代謝途徑,進一步采用高通量測序技術進行分析.基因組測序結果顯示,總堿基數(shù)為1047369985bp,平均測序深度為204×.根據(jù)剪切后的數(shù)據(jù),將Reads拼接成Contigs;而后,將Contigs按順序排列在一起形成Scaffolds.利用Glimmer 3.02軟件對菌株sp3組裝后的Scaffolds進行分析和基因預測.統(tǒng)計獲得的基因數(shù)量,基因總長度和GC含量等指標,結果如表3所示.

研究得出SOB對無機硫氧化的2條主要途徑[32-33].一條為PSO(副球菌硫氧化)途徑,即從S0氧化為SO32-,再氧化為SO42-的硫氧化途徑.另一條為S4I(連四硫酸鹽)途徑,即伴隨有多硫酸鹽產生的四硫化物中間物途徑.S4O62-僅存在于S4I途徑,是此途徑中重要的中間代謝產物[34-35].PSO和S4I這2條途徑都存在3個階段的氧化過程,包括S2-到S0,低價態(tài)無機硫到SO32-,SO42-的生成,涉及硫化物醌氧化還原酶(SQR),亞硫酸鹽還原酶(SRN),硫代硫酸鹽-硫轉移酶(TST),異二硫化物還原酶(HDR),連四硫酸鹽水解酶(TTH)以及亞硫酸鹽氧化酶(SO)等關鍵酶[36].其中,TTH酶僅存在于S4I途徑中,起到將S4O62-轉化為SO42-的作用.

表3 菌株sp3基因測試結果

根據(jù)現(xiàn)有文獻報道與公共數(shù)據(jù)庫KEGG中有關硫氧化代謝途徑中相關基因的描述,結合基因組測序結果,在菌株sp3中檢測出31種與無機硫生物氧化過程相關的功能基因,如表4所示.前人研究表明,在菌株sp3檢測出的部分硫氧化功能基因同樣存在于其它SOB中[37-39],例如編碼半胱氨酸脫硫酶的ES基因,編碼吡啶核苷酸二硫鍵氧化還原酶的A基因,編碼TST酶的基因,編碼NAD(P)H-泛醌氧化還原酶的基因,以及編碼硫酸鹽ABC轉運體滲透酶的基因等.此外,還檢測出其它一些與硫氧化相關的功能基因[40-41],包括編碼SRN酶的IJ基因,編碼FAD黃素腺嘌呤二核苷酸F,編碼電子傳遞體的B基因以及編碼SO酶的基因簇.雖然測序結果中未檢測出編碼SQR酶的基因,但是檢測到編碼吡啶核苷酸二硫鍵氧化還原酶的A基因.此基因已被證實同樣可以起到編碼SQR酶的作用[42-43].

2.4.3 硫氧化主要代謝途徑 基因測序結果表明,在菌株sp3中不存在編碼連四硫酸鹽水解酶TTH的H基因,結合本研究未檢測出中間產物S4O62-,可推測菌株sp3對S2-的氧化可能僅存在PSO途徑,見圖5所示.此途徑中涉及的無機硫存在形態(tài)包含S2-、S0、S2O32-、SO32-以及SO42-.S2-在菌株sp3作用下的主要氧化途徑推測如下:一部分底物S2-作為電子供體被氧化為S0,此過程涉及到編碼SQR酶的A基因和編碼FAD黃素腺嘌呤二核苷酸的F基因[41-44];另一部分底物S2-在編碼SRN酶的IJ基因調控下直接氧化為SO32-[45-46];在氧化過程中生成的S0與SO32-可自發(fā)反應生成S2O32-,而S2O32-可在編碼TST酶的基因調控下發(fā)生歧化反應釋放出SO32-和S0[36];SO32-在編碼SO酶的基因簇調控進一步氧化生成SO42-[33,47].

表4 菌株sp3基因組中無機硫生物氧化過程相關基因

A基因可編碼SQR酶,該酶主要起催化S2-轉化為S0的作用[45].IJ基因通過控制SRN酶的合成調控S2-至SO32-的生化反應[45-46],此過程為可逆.過量的SO32-可對微生物細胞產生毒害作用[48].而SO32-還原為S2-的反應有助于減少SO32-在體系中的累積并降低對細胞的毒害風險.S2-直接氧化為SO32-的代謝途徑僅存在于少數(shù)SOB中[47].此外,SRN酶通路亦發(fā)現(xiàn)于具有有機硫化物礦化功能的微生物中,起著調節(jié)SO32-的作用[49].這說明菌株sp3可能同樣具有有機硫化物礦化功能,可能成為降解黑臭水體中致味硫醇和硫醚類致臭污染物的功能微生物.S0也可直接氧化為SO32-.此反應需通過異二硫化物還原酶通路,該通路存在于大多數(shù)SOB中[50].在此通路中,S0在硫醇基團RSH的作用下被活化為硫烷硫原子RSSH,接著經異二硫化物還原酶催化轉化為SO32-,并重新形成RSH[51].RSSH的生成過程由基因調控[39],而異二硫化物還原酶由BC基因編碼[50].在菌株sp3中雖然檢測到基因,但未檢測出BC基因.這表明在菌株sp3中可能無S0→ RSH→RSSH→SO32-的通路.因此,菌株sp3中可能僅存在S0與SO32-之間的自發(fā)反應,以及S2O32-的歧化反應.SO32-可直接或間接氧化為SO42-.在直接氧化途徑中,基因簇,尤其是C基因扮演著重要作用,其通過調控SO酶的合成控制SO42-的生成[47].而間接氧化途徑是指SO32-由Apr基因調控磷酸腺苷硫酸鹽(APS)途徑而被氧化成SO42-[33].在菌株sp3中未檢測出Apr基因,故SO32-的氧化可能只存在直接氧化途徑.

圖5 菌株sp3對S2-的生物氧化主要途徑

SQR:硫化物醌氧化還原酶; SRN:亞硫酸鹽還原酶; TST:硫代硫酸鹽-硫轉移酶; SO:亞硫酸鹽氧化酶

2.5 菌株sp3對黑臭水樣的去除效果

圖6 菌株sp3對北京東沙河水樣中污染物的去除效果

菌株sp3對北京東沙河黑臭水樣中的主要污染物去除效果如圖6所示.結果表明,菌株sp3對實際黑臭水體中的S2-亦表現(xiàn)出較好的氧化能力.S2-由12.9mg/L的初始濃度降低為5.7mg/L,氧化率達到55.8%.水樣中的色度隨著S2-濃度的降低而下降,去除率高于50%.同時,菌株sp3對COD、NH3-N和TP亦具有明顯的去除效果,去除率分別為38.9%, 45.4%和44.1%.未添加菌劑sp3的對照組中S2-氧化率僅為5.1%,且COD等污染物去除率變化并不明顯.

3 結論

3.1 從北京東沙河黑臭水體中篩選分離到一株能高效氧化S2-的菌株,經鑒定,該菌株屬于寡養(yǎng)單胞菌屬(),命名為sp. sp3.

3.2 在溫度25℃,初始pH值7.0,初始葡萄糖濃度0.25%,初始菌濃度1.00g/L的適宜條件下,菌株sp3對S2-的氧化率最高可達86.6%.

3.3 在S2-生物氧化過程中產生了S0,S2O32-,SO32-和SO42-這4種存在形態(tài)的硫.利用高通量測序技術推測菌株sp3主要通過副球菌硫氧化途徑(PSO)將非穩(wěn)定態(tài)的S2-逐步轉化為穩(wěn)定態(tài)的SO42-.

3.4 菌株sp3對北京東沙河黑臭水樣中S2-氧化率為55.8%.同時,色度、COD、NH3-N和TP的去除率分別為51.3%、38.9%、45.4%和44.1%.

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S2--oxidizing characteristics and main bio-oxidation metabolic pathway ofsp.sp3.

XU Yao-yao1,2, SONG Chen3,4, LU Jin-xia1, WANG Jin2, YUE Zheng-bo2, LIU Xiao-ling1*

(1.Chinese Research Academy of Environmental Sciences, Beijing 100012, China；2.School of Resources and Environmental Engineering, Hefei University of Technology, Hefei 230009, China；3.Nanjing R&D Technology Group Co., Ltd, Nanjing 210029, China；4.Nanjing Hydraulic Research Institute, Nanjing 225600, China)., 2019,39(8)：3373~3382

Inorganic sulfur (S2-) was used as the target pollutant, and a single strain capable of S2--oxidizing was obtained from Dongsha river (a black-stinking river) located in Beijing. Through both of the physiological-biochemical characteristics and the 16S rRNA sequencing experiment, this single strain was identified as, and named assp.sp3. The experiment on the growth and S2--oxidizing characteristics of this strain sp3 was then carried out. The best conditions of S2--oxidizing were as follows: initialpH of 7.0, 25℃, initial glucoseconcentration of 0.25%along with initial cell concentrationof 1.00g/L. Under the above bio-oxidation conditions, the highest S2--oxidizing ratio was arrived at 86.6% by this strain sp3 after the bio-reaction of 60h. The concentration of S2-decreased continually and then kept in a stable status in the whole bio-reaction process, and other sulphur chemical forms including S0, S2O32-, SO32-and SO42-were produced in this period. With the bio-oxidation of S2-, the concentration of SO42-increased slowly. High-throughput sequencing technologies were used to investigate the main metabolic pathway of S2-bio-oxidation by this strain sp3. The paracoccus sulfur oxidation process was the possibly main metabolic pathway of S2-(unstable valence state)to SO42-(stable valence state). It was initially concluded that a portion of S2-was oxidized to S0, while other part of S2-was directly oxidized to SO32; and then S0reacted with SO32-spontaneously to form S2O32-, while the latter was released SO32-and S0by the disproportionate reaction again. The SO32-accumulated gradually in the system was further directly oxidized to SO42-. This study indicated that this strain sp3 has potential application in water purification of the black-stinking wate bodies.

S2-；screening；sulphur oxidation characteristics；metabolic pathway

X172

A

1000-6923(2019)08-3373-10

徐瑤瑤(1992-),女,安徽銅陵人,合肥工業(yè)大學資源與環(huán)境工程學院碩士研究生,主要從事黑臭水體治理技術研究.

2019-01-03

北京市自然科學基金資助項目(8182058);中央院所基本科研業(yè)務專項(2019YSKY-003)

* 責任作者, 研究員, liuxl@craes.org.cn