連翹葉中連翹苷元制備工藝的研究

鄧祥敏，朱星宇

(江蘇護(hù)理職業(yè)學(xué)院，江蘇 淮安 223005)

連翹為木犀科植物連翹Forsythiasuspensa(Thunb．)Vahl的干燥果實(shí)，功效清熱解毒、消腫散結(jié)，《神農(nóng)本草經(jīng)》有言：“本品主寒熱，癰腫惡瘡，瘰疬，癭瘤，結(jié)熱?！迸R床常用于風(fēng)熱感冒、溫病初起、高熱煩渴、癰瘍腫毒、小便淋閉等的治療[1-2]?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，連翹中主要含有揮發(fā)油類、木脂素類、萜類及黃酮類等化學(xué)成分[3]，其中木脂素類成分連翹苷元具有抗自由基、抗氧化、保肝等作用[4-5]，但是連翹苷元在連翹果實(shí)中含量極低，只有0.008%左右，其連翹葉中連翹苷元含量約為果實(shí)中的5～8倍[6-7]，因此從連翹葉制備連翹苷元更具可行性。目前連翹苷元的制備方法主要有微生物轉(zhuǎn)化法[8]、纖維素酶水解法[9]等，具有工藝復(fù)雜，可操作性差，難以規(guī)?；a(chǎn)等缺點(diǎn)。

本實(shí)驗(yàn)研究了連翹葉中連翹苷元的制備工藝，具有效率高、成本低、周期短、易于推廣的優(yōu)點(diǎn)。制備得到純度大于99.0%的連翹苷元單體化合物，為連翹苷元的制備工藝研究以及連翹葉的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供參考。

1 儀器與材料

AG-135型電子分析天平(梅特勒公司)；安捷倫高效液相色譜儀Agilent1100(美國(guó)安捷倫公司)；GL-10M高速冷凍離心機(jī)(長(zhǎng)沙湘智離心機(jī)儀器有限公司)。

連翹葉購(gòu)于淮安市廣濟(jì)醫(yī)藥連鎖有限公司(產(chǎn)地山東，批號(hào)：20160907)，藥材飲片經(jīng)黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院孫慧峰教授鑒定為木犀科植物連翹Forsythiasuspensa(Thunb．)Vahl的干燥葉；連翹苷元對(duì)照品(批號(hào)：170521，寶雞市生物辰光生物科技有限公司，純度>98%)；甲醇為色譜純，95%乙醇，乙酸乙酯為分析純。

2 方法和結(jié)果

2.1 分析方法

2.1.1 色譜條件

色譜柱：Agilent Extent C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動(dòng)相：0.01 mol·L-1磷酸二氫鉀溶液(用稀磷酸調(diào)節(jié)pH值至3.2)-甲醇(45：55)；流速：1.0 mL·min-1；柱溫：30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：230 nm；進(jìn)樣量10 μL。對(duì)照品與樣品色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 對(duì)照品(A)和供試品溶液(B)色譜圖

2.1.2 對(duì)照品溶液配制

精密稱取連翹苷元對(duì)照品10.00 mg，置100 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，得0.100 mg·mL-1的對(duì)照品溶液。

2.1.3 供試品溶液配制

精密稱取取樣品約5.00 mg，置于100 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，過(guò)0.22 μm微孔濾膜，即得。

2.1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

分別精密吸取“2.1.2”中對(duì)照品溶液適量，分別用甲醇稀釋0、2、4、10、20、80倍，按“2.1.1”項(xiàng)下條件測(cè)定，以對(duì)照品質(zhì)量濃度(mg·mL-1)為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得連翹苷元回歸方程為Y=451231.34x+1354.725，r=0.9999。線性范圍為:0.013～1.000 μg。

2.2 連翹苷元粗品的制備

2.2.1 提取

根據(jù)參考文獻(xiàn)[10]并考慮到生產(chǎn)成本與安全環(huán)保等，選擇水作為連翹葉中連翹苷元的提取溶媒，對(duì)連翹苷元粗提物的提取條件進(jìn)行了單因素考察，結(jié)果顯示，提取時(shí)間在2～5 h范圍內(nèi)對(duì)提取率影響很小，可以忽略，從節(jié)約成本、降低能耗考慮，提取時(shí)間定為2 h；其他三個(gè)因素對(duì)提取率影響較大，當(dāng)提取溫度為60 ℃、溶劑倍數(shù)為20倍、提取次數(shù)為2次時(shí)，提取率最高。單因素考察因素水平見(jiàn)表1。

表1 單因素考察提取條件

在單因素考察的基礎(chǔ)上進(jìn)行正交試驗(yàn)，以浸膏中連翹苷元含量為指標(biāo)，考察因素為提取溫度(A)、溶劑倍數(shù)(B)、提取次數(shù)(C)。取連翹葉粗粉9份，每份30 g，加水按照正交試驗(yàn)表對(duì)應(yīng)條件提取，正交試驗(yàn)方案與結(jié)果見(jiàn)表2。

由表2、表3正交試驗(yàn)結(jié)果可見(jiàn)，提取溫度(A)、溶劑倍數(shù)(B)、提取次數(shù)(C)三個(gè)因素對(duì)連翹苷元提取率的影響大小順序依次為：C>A>B，即提取次數(shù)影響最大，其次為提取溫度和溶劑倍數(shù)。理論上最優(yōu)提取工藝為A2B2C3，但提取次數(shù)第2、3水平間差距明顯小于第1、2水平間差距，綜合考慮成本，確定最優(yōu)提取工藝為A2B2C2，即60℃下，20倍量水，提取2次。按照最優(yōu)提取工藝制備連翹提取液，將其減壓濃縮至稠膏狀。

表2 連翹苷元正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

表3 方差分析表

2.2.2 醇沉

量取“2.2.1”項(xiàng)所得浸膏3份，每份100 mL，進(jìn)行單因素考察醇沉條件。方法如下：分別加入2、3、4倍量95%乙醇常溫?cái)嚢?0 min。醇沉過(guò)夜，過(guò)濾后取相同體積的濾液稀釋至同一體積，即得供試品溶液，以醇沉濾液中連翹苷元含量及醇沉沉淀中連翹苷元含量為考察指標(biāo)，考察因素與結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 醇沉考察因素與結(jié)果

由表4結(jié)果可知，醇沉體積為4倍量時(shí)，濾液中連翹苷元含量最高，沉淀中所剩連翹苷元極少，可以忽略不計(jì)，因此醇沉工藝條件為4倍量95%乙醇。

2.2.3 萃取反洗

以連翹苷元溶解度為考察指標(biāo)，采用單因素考察粗提物萃取反洗工藝，結(jié)果連翹苷元在水、乙醇、甲醇、二氯甲烷、乙酸乙酯中的溶解度分別為0.02,7.86,5.57,39.3,36.9 g·L-1，其中連翹苷元在二氯甲烷和乙酸乙酯的溶解度明顯優(yōu)于水、乙醇和甲醇。其在二氯甲烷和乙酸乙酯中溶解度相近，但二氯甲烷毒性較大，因此優(yōu)選粗提物萃取反洗工藝定為：乙酸乙酯攪拌萃取，水反洗。具體如下：取“2.2.2”項(xiàng)所得粗提物10 g置于分液漏斗中，加入乙酸乙酯攪拌萃取30 min。乙酸乙酯相加入純化水反洗2次，每次30 min。收集乙酸乙酯相，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至稠膏狀，得粗品。粗品含量以連翹苷元計(jì)不低于75.0%。

2.3 單次結(jié)晶

2.3.1 單次結(jié)晶溶劑的考察

以連翹苷元溶解度為指標(biāo)考察單次結(jié)晶溶劑，考察指標(biāo)與結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 連翹苷元溶解度的考察

由表5結(jié)果可知，連翹苷元在乙酸乙酯中常溫與回流狀態(tài)下溶解度都很大，損失較大，不適合做結(jié)晶溶劑。連翹苷元在熱乙醇中的溶解度很大，常溫下溶解度很小，甲醇中次之。從環(huán)保及危害方面綜合考慮，選用乙醇作為結(jié)晶溶劑。但實(shí)驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，連翹苷元粗提物在乙醇中不易析晶，而在甲醇中很容易析晶。故選甲醇做一次結(jié)晶溶劑。

2.3.2 單次結(jié)晶條件的考察

精密稱取“2.2.3”項(xiàng)下所得連翹苷元粗品10 g，以結(jié)晶溫度、溶劑倍數(shù)、結(jié)晶時(shí)間三個(gè)因素對(duì)單次結(jié)晶的工藝條件進(jìn)行單因素考察，結(jié)果見(jiàn)表6～8。

表6 單次結(jié)晶溫度的考察

注：參照2.3.1項(xiàng)溶劑倍數(shù)暫定為3倍

表7 單次結(jié)晶溶劑倍數(shù)的考察

注：結(jié)晶溫度為0～4℃

表8 單次結(jié)晶時(shí)間的考察

注：溶劑倍數(shù)為3倍，結(jié)晶溫度為0 ℃～4 ℃

由表6～8可知，單次結(jié)晶的最佳條件為3倍量甲醇回流溶解，冷卻至室溫，0～4 ℃靜置析晶48 h，晶體用甲醇淋洗，干燥，即得質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于95%的單次結(jié)晶。

2.4 重結(jié)晶

2.4.1 重結(jié)晶溶劑的考察

稱取單次結(jié)晶2份，每份10 g，按照“2.3.1”項(xiàng)下方法考察，確定甲醇為重結(jié)晶溶劑。

2.4.2 重結(jié)晶條件的考察

精密稱取單次結(jié)晶3份，每份10 g，按照“2.3.2”項(xiàng)下方法，對(duì)重結(jié)晶最佳工藝條件進(jìn)行單因素考察，結(jié)果顯示，以3倍量甲醇回流溶解，放至室溫，置于0～4 ℃冰箱內(nèi)靜置析晶36 h，甲醇淋洗析出晶體，減壓干燥，可得連翹苷元成品，經(jīng)檢測(cè)連翹苷元含量大于99.0%。

2.5 小試工藝驗(yàn)證

將100 g連翹葉藥材置于2 L圓底燒瓶中，分別加20倍量飲用水，60 ℃浸提2次，每次2 h，浸提結(jié)束，過(guò)濾，濾液減壓濃縮至密度約1.2 g·mL-1的稠膏，向其加入95%乙醇，調(diào)至醇濃度80%左右進(jìn)行醇沉。抽濾，上清液減壓濃縮至無(wú)醇味，得粗提物。

將粗提物置于分液漏斗中，加入15.0 mL的乙酸乙酯萃取30 min，將乙酸乙酯相加入純化水反洗2 次，每次30 min。收集乙酸乙酯相，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至稠膏狀，干燥得粗品并測(cè)定其質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

向粗品中加入16.0 mL甲醇回流溶解，0～4 ℃下反復(fù)靜態(tài)析晶，晶體用甲醇淋洗，干燥得單次結(jié)晶并測(cè)定其質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

向單次結(jié)晶中加入13.2 mL甲醇回流溶解，0～4 ℃下反復(fù)靜態(tài)析晶，晶體用甲醇淋洗，干燥得成品并測(cè)定其質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

按上述工藝試驗(yàn)3批，進(jìn)一步確定工藝參數(shù)，考察工藝的重復(fù)性，相關(guān)數(shù)據(jù)見(jiàn)表9。

表9 3批小試的相關(guān)數(shù)據(jù)

由表9可知，最終得到連翹苷元質(zhì)量為(3.60±0.05)g (RSD為1.47%)，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為(99.11±0.03)g (RSD為0.03%)，收率穩(wěn)定，工藝可行，為規(guī)?；苽涞於搜芯炕A(chǔ)。

3 討論

本研究通過(guò)單因素考察和正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)制定了連翹中連翹苷元的最佳制備工藝，實(shí)驗(yàn)中涉及提取、醇沉、萃取、單次結(jié)晶、重結(jié)晶5個(gè)主要工藝步驟，最終確定制備工藝為：以20倍量水，在60℃下提取2次，得到提取物以4倍量95%乙醇進(jìn)行醇沉，再加乙酸乙酯攪拌萃取，得質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于75.0%的粗品，再將粗品采用甲醇進(jìn)行結(jié)晶，可得質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于99.0%的連翹苷元成品。

近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)連翹苷與連翹苷元的藥理活性有明顯差異，連翹苷可能是連翹苷元的前體物質(zhì)[9]，所以研究如何制備連翹苷元，對(duì)連翹資源深度開(kāi)發(fā)具有重要意義?，F(xiàn)有的連翹苷元制備工藝首先是制備連翹苷，然后用微生物或者纖維素酶水解，將其轉(zhuǎn)化為連翹苷元，如此放大生產(chǎn)周期長(zhǎng)、成本高、可操作性差，不適合規(guī)?；苽溥B翹苷元。在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)初期我們嘗試在提取過(guò)程中加入酸水解這一步驟以期促進(jìn)連翹苷水解成連翹苷元，從而增加其得率，但是發(fā)現(xiàn)由于連翹苷水解產(chǎn)生的副產(chǎn)物較多，構(gòu)型容易轉(zhuǎn)變，生成的同分異構(gòu)體難以分離，難以實(shí)現(xiàn)后期連翹苷元的分離純化，因此采用直接提取連翹苷元的方法。

本研究摒棄由連翹苷制備連翹苷元的傳統(tǒng)方式，由熱水浸提醇沉再精制的方法直接制備連翹苷元，其過(guò)程僅用了乙酸乙酯、甲醇兩種溶劑，有機(jī)溶劑種類少，用量少，安全性高。本研究制定的連翹苷元制備工藝與傳統(tǒng)工藝相比，具有操作簡(jiǎn)單、工藝用時(shí)短、所得連翹苷元成品純度高的優(yōu)勢(shì)。經(jīng)3批小試工藝驗(yàn)證，可見(jiàn)該制備工藝穩(wěn)定、可行，可為試驗(yàn)和生產(chǎn)中連翹苷元的制備提供一種切實(shí)可行的工藝，并進(jìn)一步擴(kuò)大連翹苷元的應(yīng)用和開(kāi)發(fā)。