miR-29c在慢性腎臟病患者血清中的表達及臨床意義研究

謝媚媚 潘敏 龔裕強

慢性腎臟病（CKD）是一種病因復(fù)雜的的進行性疾病，是導(dǎo)致慢性腎衰竭的主要病因。腎間質(zhì)纖維化(RIF)是CKD進展到慢性腎衰竭過程中腎臟組織發(fā)生的主要病理改變。miRNA是一類約18～24個核苷酸長度的非編碼單鏈小分子RNA，可與靶基因配對引起其降解，或者抑制其翻譯，進行轉(zhuǎn)錄后調(diào)控[1]。筆者團隊前期研究發(fā)現(xiàn)，miR-29c在大鼠單側(cè)輸尿管梗阻模型腎組織中表達下調(diào)，可能參與RIF的發(fā)生、發(fā)展[2]。miRNA在血清中相對穩(wěn)定，且具有抗酸、抗堿、抗凍融處理、抗RNA酶的特性[3]，血液樣本容易獲取，這為研究miRNA在血清中的表達提供了可行性。基于此，本研究采用實時熒光定量PCR法檢測miR-29c在CKD患者中的表達情況，分析其與RIF的關(guān)系，探討miR-29c作為診斷RIF的生物標志物的可能性，并以期為臨床治療RIF提供新的靶點，現(xiàn)報道如下。

1 對象和方法

1.1 對象 選取2013年5月至2018年9月本院收治的CKD患者135例為CKD組，其中男71例，女64例；年齡 18～65（40.9±4.8）歲；BMI 18.5～25.8（21.9±2.4）；均符合K/DOQI指南中CKD的診斷標準[4]，其中慢性腎小球腎炎78例，糖尿病腎病25例，高血壓腎病24例，多囊腎8例；均經(jīng)腎穿刺活檢明確有不同程度的RIF，所有患者均未開始行透析治療（包括血液透析和腹膜透析）；排除紅斑狼瘡性腎炎、紫癜性腎炎、乙肝相關(guān)性腎炎等繼發(fā)性病變以及遺傳性腎小球腎炎、腎小管間質(zhì)病變，排除合并心肺疾病、腎功能突發(fā)進行性惡化患者。另擇同期健康體檢無腎臟疾病者135例為正常對照組，其中男 70 例，女 65 例；年齡 19～64（41.2±5.1）歲；BMI 18.6～26.1（21.7±2.1）；均無糖尿病、高血壓等基礎(chǔ)疾病。兩組受檢者性別、年齡、BMI等一般資料比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準，研究對象知情同意。

1.2 方法

1.2.1 試劑和儀器 Trizol試劑購于美國Invitrogen公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green I熒光定量試劑盒購于日本TOYOBO公司；實時熒光定量PCR引物由上海Invitrogen公司設(shè)計并提供；低速臺式離心機購于上海安亭儀器廠；超低溫冰箱購于美國Thermo公司；PCR儀購于德國Eppendorf公司；實時熒光定量PCR儀購于美國ABI公司。

1.2.2 檢測方法

1.2.2.1 血清肌酐、胱抑素C水平檢測 抽取兩組受檢者清晨空腹靜脈血10ml，室溫下靜置1～2h，低速離心分離（室溫下3 000r/min離心10min），冰上取上清液，部分上清液分裝于EP管中，-80℃保存用于提取RNA，另一部分上清液用于檢測血清肌酐、胱抑素C。血清胱抑素C檢測采用膠乳增強免疫比濁法，試劑盒由金華市強盛生物科技有限公司生產(chǎn)。血清胱抑素C、血肌酐使用西門子ADVIA 2400全自動生化分析儀進行測定。

1.2.2.2 腎臟病理學(xué)檢查 CKD組患者入院后均首次在B超引導(dǎo)下行經(jīng)皮腎活檢穿刺術(shù)，取新鮮腎臟活檢標本進行Masson染色，在顯微鏡下觀察腎臟組織病理圖片判斷RIF的嚴重程度。RIF指數(shù)評估方法：每例標本在光學(xué)顯微鏡下（×200）隨機選取10個不重復(fù)的腎皮質(zhì)區(qū)進行拍照，采用IPP 6.0圖像分析軟件計算每個視野小管間質(zhì)纖維化面積與同視野小管間質(zhì)總面積的百分比；0分，無損傷，≤5%；1分，輕度損傷，6%～25%；2分，中度損傷，26%～50%；3分，重度損傷，＞50%[5]。10個視野取平均分為RIF指數(shù)。

1.2.2.3 miR-29c、膠原Ⅰ（ColⅠ）mRNA水平檢測 ColⅠ基因是miR-29c的靶基因之一，ColⅠ是細胞外基質(zhì)（ECM）的主要組成成份。采用Trizol法提取兩組受檢者血清總RNA，按照勻漿、兩相分離、沉淀、清洗、溶解沉淀步驟進行，提取的RNA置于-80℃超低溫冰箱中保存。用紫外分光光度法確定RNA濃度及鑒定純度。在普通PCR儀進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cDNA。反應(yīng)體系20μl，包括總 RNA 3μg、Oligo（dT）18 2μl、M-MLV 逆轉(zhuǎn)錄酶 1μl、RNase inhibitor 1μl、dNTP 1μl、DEPC 水加至20μl。反應(yīng)條件：16℃ 30min，42℃ 30min，70℃ 15min，結(jié)束后反應(yīng)產(chǎn)物于-20℃保存。使用SYBR Green法，反應(yīng)體系 20μl，其中前向引物 1.5μl、反向引物 1.5μl、逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物 1μl、plus solution 2μl、SYBR GreenⅠMaster mix 10μl、雙蒸水加至 20μl。反應(yīng)條件為 95℃ 2min，95℃ 15s，60℃ 1min（ColⅠmRNA 為 58 ℃ 1min），進行40個循環(huán)反應(yīng)，所有樣品均做3個復(fù)孔[2]。應(yīng)用實時定量 PCR儀進行PCR反應(yīng)，用2-ΔΔCt法計算相對定量，miR-29c的內(nèi)參為U6，ColⅠmRNA的內(nèi)參為GAPDH，ΔΔCt=[Ct目的基因（CKD組）-Ct內(nèi)參（CKD組）] -[Ct目的基因（正常對照組）-Ct內(nèi)參（正常對照組）] ，正常對照組的ΔΔCt為0，因此以2-ΔΔCt表示CKD組相對于正常對照組的表達水平。

1.3 觀察指標 觀察并比較兩組受檢者血清肌酐、胱抑素C水平及miR-29c、ColⅠmRNA表達水平；分析CKD組患者血清miR-29c表達水平與RIF指數(shù)、血清肌酐、血清胱抑素C、ColⅠmRNA之間的關(guān)系。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件；計量資料以表示，組間比較采用兩獨立樣本t檢驗，相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)；P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組受檢者血清肌酐、胱抑素C水平及miR-29c、ColⅠmRNA表達水平比較 CKD組患者血清肌酐、胱抑素C水平均高于正常對照組（均P＜0.05），血清miR-29c表達水平低于正常對照組（P＜0.05），ColⅠmRNA表達水平高于正常對照組（P＜0.05），見表1。

2.2 CKD組患者血清miR-29c表達水平與RIF指數(shù)、血清肌酐、血清胱抑素C、ColⅠmRNA相關(guān)性分析CKD組患者RIF指數(shù)為（2.39±0.77）分。CKD組患者血清miR-29c表達水平與RIF指數(shù)、血清肌酐水平、血清胱抑素C水平、ColⅠmRNA表達水平均呈負相關(guān)（均P＜0.05），見表 2。

表2 CKD組患者血清miR-29c表達水平與RIF指數(shù)、血清肌酐、血清胱抑素C、ColⅠmRNA相關(guān)性分析

3 討論

CKD已成為全球公共健康問題，成人CKD全球患病率約為10%～13%[6]。RIF是各種原因?qū)е碌腃KD進展為終末期腎衰竭的共同途徑[7]，因ECM產(chǎn)生與降解失衡，導(dǎo)致ECM在腎間質(zhì)過度沉積，包括ColⅠ、ColⅢ、ColⅣ和纖連蛋白等。miRNA參與細胞凋亡、增殖、分化及炎癥、免疫反應(yīng)等生理病理過程[8]。miRNA與器官纖維化密切相關(guān)，miR-29c在大鼠單側(cè)輸尿管梗阻模型腎組織中以及轉(zhuǎn)分化后的大鼠腎間質(zhì)成纖維細胞中表達下調(diào)，可能參與RIF的發(fā)生、發(fā)展過程[2，9]。本研究CKD組患者均經(jīng)腎臟穿刺活檢明確有不同程度的RIF，與正常對照組相比，血清miR-29c表達明顯下調(diào)，提示miR-29c表達下調(diào)可能與RIF有關(guān)。

ColⅠ在人肝癌（HepG2）體外細胞株中證實是miR-29c的靶基因[1]。本研究結(jié)果顯示，CKD組患者血清miR-29c表達明顯下調(diào)，ColⅠmRNA表達明顯上升，兩者呈負相關(guān)，這說明miR-29c負向調(diào)控ColⅠ。miR-29c的靶基因包括 ColⅠ、ColⅢ、ColⅣ、ColⅤ、原纖維蛋白、層粘連蛋白、血管內(nèi)皮生長因子A等[10-11]，大部分編碼ECM，血管內(nèi)皮生長因子A促進ECM在內(nèi)皮細胞外堆積。在CKD患者中，血清miR-29c表達明顯下調(diào)，可能通過以上靶基因使ECM生成增多并促進ECM堆積而參與RIF，且miR-29c與RIF指數(shù)呈負相關(guān)，說明miR-29c可能是RIF發(fā)生、發(fā)展中的一個重要參與因子。

腎臟疾病的預(yù)后與RIF程度密切相關(guān)。腎臟穿刺活檢行病理學(xué)檢查能夠直接反應(yīng)腎組織的病理特點，目前仍是檢測RIF的主要手段。但腎臟穿刺活檢具有一定危險性，術(shù)后存在出血、繼發(fā)感染等風(fēng)險，且需重復(fù)活檢了解病情進展以及評估治療效果。miRNA在血液循環(huán)、尿液或其他體液中能夠穩(wěn)定存在，不易降解，被認為是最有潛力的疾病生物標志物，可反映某些疾病病變及病情嚴重程度。本研究結(jié)果表明CKD患者血清miR-29c表達水平隨著RIF的加重而下降，提示miR-29c的表達水平可作為評價RIF嚴重程度的指標。實時熒光定量PCR檢測血清中miRNA表達水平已經(jīng)是一項成熟技術(shù)，因此，檢測CKD患者血清miR-29c表達水平可作為診斷RIF以及隨訪的檢查指標。

血清肌酐是最常用來評價腎功能的指標，血清胱抑素C作為內(nèi)源性標志物，與腎小球濾過率相關(guān)性最好，其主要由腎小球濾過率決定，不受性別、肌肉容積、炎癥、腫瘤影響，是反映腎功能的敏感指標[12]。本研究中CKD組患者血清miR-29c表達水平與血清肌酐、血清胱抑素C水平均呈負相關(guān)，提示miR-29c的表達水平可作為評價腎功能的輔助指標。

已有研究發(fā)現(xiàn)，將人工合成的miR-29c mimics轉(zhuǎn)染大鼠腎間質(zhì)成纖維細胞上調(diào)miR-29c，可抑制ColⅠ表達起到抗纖維化作用[9]。本研究在CKD患者中證實miR-29c負向調(diào)控ColⅠ，這為今后治療RIF提供了新的方向。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示，CKD患者血清miR-29c表達明顯下調(diào)，miR-29c可能通過相應(yīng)靶基因使ECM生成增多，并促進ECM堆積而參與RIF。血清miR-29c表達水平可作為診斷RIF以及隨訪的生物標志物，且可作為評價腎功能的輔助指標，其抗纖維化作用為臨床治療RIF提供了新的方向。