FoxO1在高糖誘導小鼠胰島β細胞去分化中的作用機制研究

高倩 章文俊 楊國軍 潘曄 陳乃君 朱巍 金華偉

糖尿病的病因和發(fā)病機制極為復雜，至今未完全闡明。胰島素作為人體內(nèi)最主要的降糖激素，由胰島β細胞合成和分泌。目前研究認為，胰島β細胞去分化在糖尿病的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用，然而其去分化的機制尚不明確。Talchai等[1]研究發(fā)現(xiàn)，敲除FoxO1基因的小鼠在代謝壓力（多產(chǎn)、高齡）下分化成熟的胰島β細胞會轉(zhuǎn)化成一種表達神經(jīng)元素3、八聚體轉(zhuǎn)錄因子4（Oct4）的前體細胞，小鼠最終患上糖尿病。劉嬋等[2]則發(fā)現(xiàn)體外培養(yǎng)的小鼠胰島β細胞在高糖培養(yǎng)誘導下會發(fā)生去分化，并發(fā)現(xiàn)磷酸化的FoxO1表達改變。本研究通過觀察高糖培養(yǎng)誘導的小鼠胰島β細胞磷酸化FoxO1（p-FoxO1）、FoxO1 蛋白和 mRNA、前 β 細胞標志物Oct4蛋白以及β細胞標志物胰腺十二指腸同源盒-1（PDX1）蛋白表達水平變化，并于FoxO1磷酸化酶抑制劑渥曼青霉素干預后觀察其對β細胞去分化的影響，探討FoxO1在高糖培養(yǎng)誘導小鼠胰島β細胞去分化中的作用機制，現(xiàn)報道如下。

1 材料和方法

1.1 材料 小鼠胰島β細胞MIN-6細胞由中南大學細胞室提供，HTCC編號：9號。渥曼青霉素為中國solarbio公司產(chǎn)品（批號：200706）。DMEM培養(yǎng)液為美國HyClone公司產(chǎn)品，F(xiàn)BS為澳大利亞BOVOGEN公司產(chǎn)品。p-FoxO1（位點：256、319）一抗、FoxO1、Oct4 和PDX1一抗為美國bioworld公司產(chǎn)品，HRP標記二抗為美國jackson公司產(chǎn)品。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（RR037A）和SYBR Premix Ex TapTM（RR420）購于日本 TaKaRa公司。Molecular Imager ChemiDocTMXRS+成像系統(tǒng)為美國Bio-Rad公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)和分組 MIN-6細胞常規(guī)培養(yǎng)在含10%FBS、葡萄糖濃度25mmol/L的DMEM培養(yǎng)液中，置于37℃、5%CO2的孵箱中培養(yǎng)，2～3d換液1次。細胞分組如下：常規(guī)糖濃度組（葡萄糖濃度25mmol/L，RG組）、高張濃度組（葡萄糖濃度25mmol/L+甘露醇35mmol/L，RG+M組）、高糖濃度組（葡萄糖濃度 60mmol/L，HG組）、高糖濃度+渥曼青霉素干預組（葡萄糖濃度60mmol/L+渥曼青霉素 50nmol/L，HG+W組）。

1.2.2 p-FoxO1（256）、p-FoxO1（319）、FoxO1、Oct4、PDX1蛋白表達水平檢測 采用Western blot法。MIN-6細胞分組培養(yǎng)后用BCA法測定蛋白濃度，操作按說明書進行。變性后取40μg總蛋白上樣，SDS-PAGE膠進行電泳，轉(zhuǎn)膜、封閉后分別加入 p-FoxO1（256）、p-FoxO1（319）、FoxO1、Oct4、PDX1、β-actin 一抗孵育過夜；洗膜后分別加入相應的HRP標記的二抗，再次洗膜后予ECL化學發(fā)光顯色，Molecular Imager ChemiDocTMXRS+成像系統(tǒng)自動曝光掃描并用Imagelab軟件分析結(jié)果，以所測得的各條帶的吸光度與內(nèi)參照β-actin吸光度的比值作為蛋白表達的半定量值。實驗重復3次。

1.2.3 FoxO1 mRNA表達水平檢測 采用qRT-PCR法。用Trizol法提取細胞總RNA，分光光度計檢測RNA濃度及純度，并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。用SYBR Green熒光染料定量PCR擴增。引物設計采用Primer Premier 5.0軟件包。引物的特異性比對采用NCBI的Primer BLAST。引物由上海桑尼生物科技有限公司合成。實時熒光定量PCR采用20μl體系，SYBR熒光染料 10μl、上下游Primer各 0.5μl、DEPC 水 8μl、cDNA 1μl。以 β-actin 為內(nèi)參，各引物序列如下：（1）FoxO1上游引物 5′-GAGCGTGCCCTACTTCAA-3′，下游引物 5′-CCATCTCCCAGGTCATCC-3′;（2）β-actin上游引物5′-CTGTCCCTGTATGCCTCTG-3′，下游引物 5′-ATGTCACGCAGATTTCC-3′。用SYBR Green染料熒光定量PCR分析，擴增條件為95℃預變性30s；隨后 95℃ 5s，60℃20s，40 個循環(huán)。采用相對定量 2-ΔΔCT法計算 mRNA 表達水平。實驗重復3次。

1.3 觀察指標 觀察并比較：（1）不同培養(yǎng)時間（培養(yǎng)0、12、24、48h）HG 組 MIN-6 細胞 p-FoxO1（256）、p-FoxO1（319）、FoxO1 蛋白表達水平；（2）不同培養(yǎng)時間（培養(yǎng) 0、12、24、48、72h）HG 組 MIN-6 細胞 FoxO1 mRNA 表達水平；（3）培養(yǎng) 12h時 RG、RG+M、HG、HG+W組 MIN-6 細胞 p-FoxO1（256）、p-FoxO1（319）、FoxO1蛋白表達水平，及培養(yǎng)72h時4組MIN-6細胞Oct4、PDX1蛋白表達水平。

1.4 統(tǒng)計學處理 應用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件。計量資料以表示，多組比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 不同培養(yǎng)時間HG組MIN-6細胞p-FoxO1（256）、p-FoxO1（319）、FoxO1蛋白表達水平比較 見圖1、2。

圖1 不同培養(yǎng)時間HG組MIN-6細胞p-FoxO1（256）、p-FoxO1（319）、FoxO1蛋白表達電泳圖

圖2 不同培養(yǎng)時間HG組MIN-6細胞p-FoxO1（256）、p-FoxO1（319）、FoxO1蛋白表達水平比較（與0h比較，*P＜0.05）

由圖1、2可見，HG組MIN-6細胞高糖培養(yǎng)0、12、24、48h 時 p-FoxO1（256）、p-FoxO1（319）表達水平比較差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05），而FoxO1蛋白表達水平比較無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。高糖培養(yǎng)12、24、48h 時 MIN-6 細胞 p-FoxO1（256）、p-FoxO1（319）表達水平均明顯高于0h（均P＜0.05），提示在一定時間范圍內(nèi)，高糖可以刺激MIN-6細胞FoxO1信號分子256及319位點發(fā)生磷酸化。

2.2 不同培養(yǎng)時間HG組MIN-6細胞FoxO1 mRNA表達水平比較 見圖3。

圖3 不同培養(yǎng)時間HG組MIN-6細胞FoxO1 mRNA表達水平比較

由圖3可見，HG組MIN-6細胞高糖培養(yǎng)0、12、24、48、72h時FoxO1 mRNA表達水平比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

2.3 培養(yǎng) 12h時 RG、RG+M、HG、HG+W 組 MIN-6細胞 p-FoxO1（256）、p-FoxO1（319）、FoxO1 蛋白表達水平比較 見圖4、5。

圖4 培養(yǎng)12h時RG、RG+M、HG、HG+W組MIN-6細胞p-FoxO1（256）、p-FoxO1（319）、FoxO1 蛋白表達電泳圖

圖5 培養(yǎng)12h時RG、RG+M、HG、HG+W組MIN-6細胞p-FoxO1（256）、p-FoxO1（319）、FoxO1蛋白表達水平比較（與RG組比較，*P＜0.05；與 HG 組比較，△P＜0.05）

由圖 4、5可見，培養(yǎng) 12h時 RG、RG+M、HG、HG+W 組 MIN-6 細胞 p-FoxO1（256）、p-FoxO1（319）表達水平比較差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05），而FoxO1蛋白表達水平比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。與RG 組比較，HG 組 MIN-6 細胞 p-FoxO1（256）、p-Fox－O1（319）蛋白表達水平升高（P＜0.01），而 RG+M 組差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。與HG組比較，RG+M組MIN-6 細胞 p-FoxO1（256）、p-FoxO1（319）蛋白表達水平均明顯降低（均P＜0.05）。

2.4 培養(yǎng) 72h時 RG、RG+M、HG、HG+W 組 MIN-6細胞Oct4蛋白表達水平比較 見圖6、7。

圖6 培養(yǎng)72h時RG、RG+M、HG、HG+W組MIN-6細胞 Oct4蛋白表達電泳圖

圖7 培養(yǎng)72h時RG、RG+M、HG、HG+W 組MIN-6細胞 Oct4蛋白表達水平比較（與RG組比較，*P＜0.05；與HG組比較，△P＜0.05）

由圖 6、7可見，培養(yǎng) 72h時 RG、RG+M、HG、HG+W組MIN-6細胞Oct4蛋白表達水平比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。與RG組比較，HG組MIN-6細胞Oct4蛋白表達水平升高（P＜0.05），RG+M組差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。與HG組比較，RG+M組MIN-6細胞Oct4蛋白表達水平明顯降低（P＜0.05）。

2.5 培養(yǎng) 72h時 RG、RG+M、HG、HG+W 組 MIN-6細胞PDX1蛋白表達水平比較 見圖8、9。

由圖 8、9可見，培養(yǎng) 72h時 RG、RG+M、HG、HG+W組MIN-6細胞PDX1蛋白表達水平比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。與RG組比較，HG+W組MIN-6細胞PDX1蛋白表達水平明顯降低（P＜0.05），RG+M組差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。與HG組比較，HG+W組MIN-6細胞PDX1蛋白表達水平明顯升高（P＜0.05）。

圖 8 培養(yǎng) 72h時 RG、RG+M、HG、HG+W 組 MIN-6細胞 PDX1蛋白表達電泳圖

圖9 培養(yǎng)72h時RG、RG+M、HG、HG+W組MIN-6細胞PDX1蛋白表達水平比較（與RG組比較，*P＜0.05；與HG組比較，△P＜0.05）

3 討論

近30年來，我國糖尿病的發(fā)病率逐年上升，已成為繼心血管疾病和腫瘤之后的第三大疾病，2007年流行病學調(diào)查資料顯示，我國20歲以上成年人糖尿病患病率為9.7%，中國成人糖尿病總數(shù)達9 240萬。2010年中國國家疾病預防控制中心調(diào)查顯示我國糖尿病患病率為9.7%，再次證實我國可能已成為世界上糖尿病患病人數(shù)最多的國家[3]。糖尿病是一組以高血糖為主要特征的臨床綜合征。高血糖的產(chǎn)生主要是由胰島β細胞功能缺陷，引起胰島素相對或絕對不足，以及周圍胰島素敏感組織對胰島素抵抗引起。過去一直認為胰島β細胞凋亡是β細胞缺陷的主要形式，但現(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)2型糖尿病患者胰島β細胞去分化比例高達31.9%（非糖尿病患者為8.7%）[4]，在2型糖尿病動物模型的胰島中觀察到大量胰島素表達陰性的細胞，該類細胞能表達嗜鉻粒蛋白-A、neurogenin3、Oct4等前β細胞標志物，并觀察到了FoxO1的進行性丟失[5]。本研究發(fā)現(xiàn)，在高糖培養(yǎng)誘導下，MIN6細胞去分化為表達Oct4的前β細胞，β細胞標志物PDX1表達水平降低。

FoxO1是Forkhead蛋白大家族的一個亞群，主要表達在胰腺β細胞、肝細胞、脂肪細胞，是一種多功能蛋白，參與調(diào)節(jié)細胞增殖、凋亡、衰老、分化、應激、自噬、代謝。研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)oxO1可抑制胰島α細胞向β細胞轉(zhuǎn)化、保護β細胞免受氧化應激損傷、維持β細胞終末分化狀態(tài)以及抑制胰腺祖細胞分化為β細胞[6-9]。FoxO1的活性主要受磷酸化/去磷酸化水平調(diào)節(jié)[10]。本研究發(fā)現(xiàn)，在高糖培養(yǎng)誘導下，MIN6細胞中FoxO1 mRNA、蛋白表達水平無明顯變化，但其256及319位點出現(xiàn)磷酸化，通過FoxO1磷酸化酶抑制劑渥曼青霉素抑制FoxO1的磷酸化，去分化的細胞再次分化為表達PDX1的β細胞。這說明FoxO1通過磷酸化與去磷酸化的轉(zhuǎn)換在β細胞去分化中發(fā)揮作用。

FoxO1有多個蘇氨酸和絲氨酸磷酸化位點，分別為N端的1個蘇氨酸和中部的2個絲氨酸位點。無刺激因子時，F(xiàn)oxO1以去磷酸化狀態(tài)位于細胞核內(nèi)。當受刺激后，F(xiàn)oxO1發(fā)生磷酸化而由核內(nèi)轉(zhuǎn)運到細胞質(zhì)中。FoxO1在細胞質(zhì)和核內(nèi)穿梭，與14-3-3蛋白密切相關。14-3-3蛋白主要存在細胞核內(nèi)，可以識別絲氨酸和蘇氨酸殘基。FoxO1磷酸化后，構象發(fā)生改變，與14-3-3蛋白結(jié)合，介導了FoxO1的核輸出[11-13]。Ser256是核定位關鍵位點，它的磷酸化與FoxO1的核輸出密切相關，Ser319則影響FoxO1的核輸出效率[14]。伴隨著FoxO1的磷酸化和去磷酸化、與DNA的解離和結(jié)合，可以關閉或啟動某些基因的表達而產(chǎn)生不同的生理反應。本研究發(fā)現(xiàn)FoxO1 256和319位點磷酸化參與了高糖培養(yǎng)誘導的MIN6細胞去分化，但具體機制仍需要進一步探討。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示，高糖可能通過FoxO1 256和319位點磷酸化而參與誘導體外培養(yǎng)小鼠胰島β細胞發(fā)生去分化。