農(nóng)村生活污水高效降解菌的篩選?鑒定及工藝優(yōu)化

魯姍 段開紅

摘要 [目的]篩選并優(yōu)化能夠降解農(nóng)村生活污水中有機(jī)物的高效降解菌。[方法]利用普遍適用性培養(yǎng)基和選擇性培養(yǎng)基進(jìn)行菌株的分離篩選，以化學(xué)需氧量為評(píng)判指標(biāo)進(jìn)行復(fù)篩、鑒定及高效復(fù)合菌的初步構(gòu)建，通過單因素及正交試驗(yàn)優(yōu)化高效降解菌的發(fā)酵條件。[結(jié)果]從35株初篩菌株中復(fù)篩出5株有機(jī)物降解率在40%以上的菌株，最優(yōu)發(fā)酵條件為：接種量0.3%、發(fā)酵時(shí)間5 d、復(fù)合菌的配比B2（假單胞菌）∶N1（棒狀桿菌）為4∶1時(shí)，有機(jī)物降解率可達(dá)84.46%。[結(jié)論]該研究可為農(nóng)村生活污水的治理提供參考。

關(guān)鍵詞 生活污水;化學(xué)需氧量;高效復(fù)合菌;優(yōu)化

中圖分類號(hào) X172文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

文章編號(hào) 0517-6611（2019）14-0080-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.14.025

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Abstract [Objective] To screen and optimize highly efficient bacteria which can degrade organic matter in rural domestic sewage. [Method] The strains were isolated and screened by universal applicability medium and selective medium. The chemical oxygen demand （COD） was used as the evaluation index for rescreening， identification and preliminary construction of highefficiency composite bacteria. The fermentation conditions of highefficiency degradation bacteria were optimized by single factor and orthogonal test. [Result] Among the 35 strains， 5 strains with more than 40% degradation rate of organic matter were screened out. The optimum fermentation conditions were inoculation amount of 0.3%， fermentation time of 5 days， and the ratio of B2 （Pseudomonas sp.） to N1 （Corynebacterium sp.） was 4∶1， and the degradation rate of organic matter could reach 84.46%. [Conclusion] The study can provide reference for the treatment of rural domestic sewage.

Key words Domestic sewage;COD;Efficient compound bacteria;Optimization

作者簡(jiǎn)介 魯姍（1993—），女，內(nèi)蒙古通遼人，碩士研究生，研究方向：微生物處理污水。*通信作者，教授，碩士生導(dǎo)師，從事發(fā)酵工程研究。

收稿日期 2019-03-04;修回日期 2019-03-19

近年來，隨著我國經(jīng)濟(jì)實(shí)力的快速發(fā)展，農(nóng)村地區(qū)生活用水量增加的同時(shí)也伴隨著污水排放量的急劇增加，農(nóng)村生活污水如何科學(xué)、高效的處理受到了政府及社會(huì)各界的重視[1]?！秲?nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)村牧區(qū)人居環(huán)境整治三年行動(dòng)方案（2018-2020年）》中也提到了梯次推進(jìn)農(nóng)村牧區(qū)生活污水治理及科學(xué)選擇污水處理模式等[2]。所以，尋求適合農(nóng)村生活污水處理的方法成為當(dāng)下要?jiǎng)?wù)。生物法是污水處理中最常用的技術(shù)手段之一，具有成本低、效率高、反應(yīng)條件溫和及無二次污染等顯著優(yōu)點(diǎn)，利用微生物技術(shù)處理污水，體現(xiàn)了可持續(xù)發(fā)展的理念。國內(nèi)近幾年利用微生物處理污水的研究雖然取得一定進(jìn)展，但國內(nèi)微生物菌劑的研發(fā)仍需加快腳步以改變菌劑針對(duì)性不強(qiáng)及效果受多因素影響等問題[3- 6]。

內(nèi)蒙古巴彥淖爾市五原縣塔爾湖鎮(zhèn)污水處理廠日平均處理污水350 t。當(dāng)?shù)厣钗鬯械闹饕廴疚餅榈矸?、糖類、油脂、纖維素、蛋白質(zhì)等無毒有機(jī)物，屬于生物易降解物質(zhì)。該試驗(yàn)主要目的是篩選出對(duì)農(nóng)村生活污水具有高效降解能力的菌株，為工業(yè)化生產(chǎn)菌種、推廣農(nóng)村生活污水處理技術(shù)及降低成本提供參考。為此，筆者試圖在塔爾湖鎮(zhèn)污水處理廠

的污泥及周邊土壤中篩選高效降解菌，以評(píng)價(jià)污水水質(zhì)的化學(xué)需氧量（COD值）為評(píng)判指標(biāo)進(jìn)行降解試驗(yàn)，并對(duì)高效降解菌的降解性能進(jìn)行初步研究及工藝優(yōu)化。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

內(nèi)蒙古巴彥淖爾市五原縣塔爾湖鎮(zhèn)污水處理廠周邊土壤及廠內(nèi)處理池中的污水（COD：663 mg/L）、污泥。

電子分析天平（FA1004B，上海佑科儀器儀表有限公司），手提式壓力蒸汽滅菌器（DSX-280KB30，上海申安醫(yī)療器械廠），恒溫培養(yǎng)搖床（HPY-92，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司），高速離心機(jī)（HC-3018，安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司），電熱鼓風(fēng)干燥箱（DL100，天津市實(shí)驗(yàn)儀器廠），生物顯微鏡（XSP-2CA，上海佑科儀器儀表有限公司），pH計(jì)（PHS-3C，上海晶磁儀器有限公司），COD消解裝置（COD-571-1，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司），化學(xué)需氧量（COD）測(cè)定儀（COD-571，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司）等。

1.2 方法

1.2.1 初篩。采用常用的細(xì)菌、放線菌、真菌普遍適用性培養(yǎng)基和篩選固氮菌所用的Ashby無氮培養(yǎng)基及篩選解磷菌所用的無機(jī)磷培養(yǎng)基[7]，將污泥及土壤稀釋成濃度為10-1、10-2、10-3、10-4、10-5 g/L的懸液，然后取10-4和10-5 g/L濃度的懸液涂布于篩選培養(yǎng)基相應(yīng)的固體平板上，選擇其中出現(xiàn)時(shí)間早、出現(xiàn)次數(shù)多及長勢(shì)好的菌種進(jìn)一步純化。

1.2.2 復(fù)篩。將純化后的單一菌株菌懸液（活菌數(shù)>108 CFU/mL，LB液體培養(yǎng)基）以1%的添加量接入200 mL滅菌生活污水中，放入25 ℃、140 r/min的搖床中振蕩。每24 h測(cè)一次COD值，監(jiān)測(cè)周期為120 h。選擇COD去除率在40%以上的菌株進(jìn)行后續(xù)研究。

為去除懸浮物的影響，測(cè)定COD時(shí)需把消解后的待測(cè)樣品于8 000 r/min離心5 min，取上清液測(cè)定COD值。

1.2.3 鑒定。將已分離、純化的菌株交由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行16SrDNA測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果通過基因數(shù)據(jù)庫（NCBI）進(jìn)行相似性比對(duì)，下載相似性最高序列，采用MEGA7構(gòu)建進(jìn)化樹。

1.2.4

復(fù)合菌的初步構(gòu)建。將復(fù)篩出的、互相之間沒有拮抗作用的降解菌，進(jìn)行等體積隨機(jī)復(fù)配并測(cè)定其降解有機(jī)物的性能，選擇其中降解有機(jī)物能力最好的復(fù)合菌進(jìn)行研究。

1.2.5

發(fā)酵條件的優(yōu)化。將降解有機(jī)物能力最好的復(fù)合菌的菌懸液接入滅菌生活污水中，對(duì)接種量、反應(yīng)時(shí)間、復(fù)合菌的配比進(jìn)行單因素試驗(yàn)：接種量：0.1%、0.3%、0.5%、0.7%、1%、1.5%、2%;反應(yīng)時(shí)間：3、4、5、6、7、8、9 d;復(fù)合菌的配比（B2∶N1）：1∶4、1∶3、1∶2、1∶1、2∶1、3∶1、4∶1。

考慮單因素試驗(yàn)優(yōu)化得到的結(jié)果，建立3因素3水平的正交試驗(yàn)，確定復(fù)合菌的發(fā)酵條件參數(shù)，并根據(jù)結(jié)果計(jì)算極差進(jìn)行分析。工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)因素水平見表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 降解性菌株的篩選

2.2 16SrDNA序列分析

通過鑒定結(jié)果比對(duì)NCBI可知：B1、B4為芽孢桿菌屬（Bacillus），B2為假單胞菌屬（Pseudomonas），B6為克雷伯氏菌屬（Klebsiella），N1為棒狀桿菌屬（Corynebacterium），Blast比對(duì)相似度均為99%。

菌種B1、B4為促生、分解磷鉀化合物細(xì)菌類菌種，分別為短小芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌，能夠分解污水中的磷鉀化合物;菌種B2所屬的假單胞菌多分布于土壤和水中的各種植物體，有極強(qiáng)的分解有機(jī)物的能力，可以將多種有機(jī)物作為能源來源，Misiak K等[10]、Su J J等[11]做過關(guān)于Pseudomonas knackmussii用于廢水處理中膜曝氣生物反應(yīng)器的研究，結(jié)果表明假單胞菌在生物法處理污水中具有降解氨氮的能力。菌種B6為產(chǎn)酸克雷伯氏菌，王強(qiáng)等[12]的研究表明其具有降解污水中苯酚的能力;菌種N1為帚石南棒桿菌（Corynebacterium callunae），已有研究報(bào)道將該菌種作用于化工污水處理[13]。

2.3 復(fù)合菌系的構(gòu)建 將所篩得的5株降解菌在LB培養(yǎng)基中兩兩劃線觀察是否有拮抗作用，發(fā)現(xiàn)5株菌之間均無拮抗。將5株降解菌的單菌及隨機(jī)復(fù)配按等體積混合的菌懸液1%的接種量接入滅菌生活污水中反應(yīng)84 h，每24 h監(jiān)測(cè)一次COD值，采用COD值最低點(diǎn)計(jì)算COD去除率，從而確定其降解有機(jī)物的性能。結(jié)果表示（表3），B2、N1等體積混合處理污水的COD去除率為72.08%，優(yōu)于單菌及其他復(fù)合菌的處理效果。

2.4 發(fā)酵工藝的優(yōu)化結(jié)果

2.4.1 單因素試驗(yàn)。根據(jù)按所設(shè)置的參數(shù)將復(fù)合菌接入滅菌生活污水中，以化學(xué)需氧量（COD值）為評(píng)價(jià)指標(biāo)，對(duì)其降解污水中有機(jī)物能力進(jìn)行評(píng)估。圖2～4表明，接種量0.3%時(shí)，COD去除率最高;發(fā)酵時(shí)間5 d，COD去除率最高;復(fù)合菌配比（B2∶N1）3∶1時(shí)，COD去除率最高;當(dāng)接種量0.3%、發(fā)酵5 d、復(fù)合菌配比（B2∶N1）3∶1時(shí)，COD去除率為79.24%。

3 結(jié)論

該試驗(yàn)共篩選出細(xì)菌21株、真菌5株、放線菌10株，且分離出來的菌株對(duì)污水中的有機(jī)物都有一定的降解作用。復(fù)篩出來的5株高效降解菌經(jīng)鑒定后得出均為細(xì)菌，說明細(xì)菌是生活污水中的主要降解類群，這與黃世臣等[14]、李德舜 等[15]的研究結(jié)果一致。

以化學(xué)需氧量（COD值）為評(píng)價(jià)指標(biāo)，對(duì)5株高效降菌及等體積隨機(jī)復(fù)配的復(fù)合菌降解污水中有機(jī)物能力進(jìn)行測(cè)定，選擇效果最好的單菌或復(fù)合菌進(jìn)行研究;對(duì)反應(yīng)時(shí)間、接種量、復(fù)合菌的配比3個(gè)因素進(jìn)行考察，通過正交試驗(yàn)進(jìn)一步確定了復(fù)合菌處理污水的最優(yōu)工藝。結(jié)果表明，將菌株B2（Pseudomonadaceae knackmussii）與N1（Corynebacterium callunae）復(fù)合降解污水中有機(jī)物的效果最好;當(dāng)反應(yīng)時(shí)間5 d、接種量0.3%、復(fù)合菌配比（B2∶N1）4∶1時(shí)，有機(jī)物降解率達(dá)到84.46%。該研究對(duì)農(nóng)村污水的治理具有一定的參考作用。

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