苦菜總黃酮超聲波輔助提取及抗氧化能力研究

單科開 王鴻飛 許 鳳 羅 潔 韓愛茹 李艷霞 邵興鋒 韋瑩瑩

(寧波大學(xué)食品科學(xué)與工程系,浙江寧波 315211)

苦菜(Sonchus oleraceusL.)為菊科(Compositae)苦苣菜屬(Sonchus)一年生或兩年生草本植物,又稱為苦荬菜、苣荬菜[1]。 我國苦菜資源十分豐富,主要分布在西北、華北、東北、華中地區(qū),多生長在林下、山坡或平地田間。 苦菜作為藥食同源植物[2],富含對人體有益的內(nèi)酯、萜類、酚酸、多糖、氨基酸及黃酮類化合物等成分[3-5],其中黃酮類物質(zhì)與苦菜的藥用價(jià)值有很大的關(guān)系。 黃酮作為一種活性物質(zhì),具有抗氧化、抗過敏、抗炎、抗菌、抗突變、抗腫瘤、保肝、保護(hù)心腦血管系統(tǒng)、抗病毒及殺蟲等廣泛的生理活性[6]。 因此,提取并研究苦菜中的黃酮具有重要的意義。

黃酮的提取方法主要有回流提取法、微波提取法、超臨界提取法、酶解法、機(jī)械力化學(xué)提取法、超聲波-乙醇提取法等[7]。 而苦菜中黃酮類物質(zhì)的提取方法主要有超聲波法、回流提取法,翟碩莉等[8]通過超聲波水提法提取苦菜黃酮,得到苦菜黃酮的提取率為2.47%；戴水平等[9]利用乙醇回流提取苦菜根中的黃酮,提取率為3.66%。 為了提高黃酮提取率并降低成本,單一提取方法越來越不能滿足需求,復(fù)合法提取黃酮已成為主要趨勢。 研究表明,超聲波-乙醇提取法具有振動、空化、細(xì)胞破壁、熱效應(yīng)、超聲湍流和流體邊界層等綜合效應(yīng),有利于植物細(xì)胞內(nèi)容物向溶劑擴(kuò)散,加速提取過程,從而縮短提取時(shí)間,減少溶劑用量[10-11]。 本試驗(yàn)以干苦菜為原料,采用超聲波-乙醇提取法提取苦菜總黃酮,通過響應(yīng)面法對提取工藝條件進(jìn)行優(yōu)化,并對苦菜總黃酮提取物的抗氧化能力進(jìn)行研究,以期為苦菜總黃酮的提取及開發(fā)利用提供理論依據(jù)和科學(xué)指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

干苦菜購自安國藥源商貿(mào)有限公司。

三吡啶三吖嗪[2,4,6-Tris(2-pyridyl)-s-triazine,TPTZ],分析純(≥99%),美國Sigma-Aldrich 公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH),日本和光純藥工業(yè)株式會；三羥甲基氨基甲烷(Tris Base),青島生工生物科技有限公司；鄰菲羅啉,阿法埃莎(Alfa Aesar)天津化學(xué)有限公司；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥95%)、無水乙醇、鄰苯三酚、硫酸亞鐵、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、L-抗壞血酸、結(jié)晶三氯化鋁,均為分析純,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 主要儀器與設(shè)備

Cary50Scan 紫外分光光度計(jì),美國瓦里安技術(shù)中國有限公司；WK-200B 高速藥物粉碎機(jī),山東青州市精誠機(jī)械有限公司；SB3200D 超聲波清洗機(jī),寧波新芝生物科技股份有限公司；H1850-R 臺式高速冷凍離心機(jī),湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 苦菜總黃酮的提取 參照王鴻飛等[12]的方法并略作修改。 將干苦菜粉碎,過60 目篩得苦菜干粉。精確稱取1 g 苦菜干粉,加入60%乙醇溶液,超聲波輔助提取(150 W,40 min),水浴浸提(60℃,60 min),經(jīng)常溫離心(5 000 r·min-1,15 min)后將上清液進(jìn)行抽濾,濾液定容至100 mL,備用。

1.3.2 苦菜總黃酮含量的測定 采用氯化鋁法[13]。精確稱取0.022 4 g 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品,用30%乙醇溶液定容至100 mL 容量瓶中,此時(shí)溶液的質(zhì)量濃度為0.224 g·L-1。精密移取標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.2、0.4、0.5、0.6、0.8、1.0 mL 于10 mL 比色管中,各加入1 mL 2%三氯化鋁溶液,用30%乙醇溶液定容至刻度,分別配置成質(zhì)量濃度為0、0.004 48、0.008 96、0.011 20、0.013 44、0.017 92、0.022 40 g·L-1的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液,混勻靜置20 min,在270 nm 波長下測定其吸光度值。 以蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),以吸光度值A(chǔ) 為縱坐標(biāo)作圖,進(jìn)行線性回歸分析。 按照標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算苦菜中總黃酮含量,其計(jì)算公式為：

式中,y為苦菜總黃酮得率,%；m 為樣品液中總黃酮的質(zhì)量,g；M 為干物料的質(zhì)量,g。

1.3.3 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì) 在超聲功率150 W、超聲時(shí)間1 h 的基礎(chǔ)條件上,以總黃酮得率為指標(biāo),分別考察乙醇濃度、浸提溫度分別設(shè)為浸提時(shí)間、料液比對苦菜總黃酮含量的影響。 其中,乙醇濃度分別設(shè)為20%、30%、40%、50%、60%、70%；浸提溫度分別設(shè)為40、50、60、70、80、90℃；浸提時(shí)間分別設(shè)為30、60、90、120、150、180 min；料液比分別設(shè)為1 ∶20、1 ∶30、1 ∶40、1 ∶50、1 ∶60、1 ∶70(m/v)。

1.3.4 Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上,以乙醇濃度(A)、浸提溫度(B)、浸提時(shí)間(C)、料液比(D)為自變量,總黃酮得率(Y)為響應(yīng)值,采用Box-Behnken 設(shè)計(jì)法對苦菜總黃酮的提取工藝條件進(jìn)行優(yōu)化。 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及因素水平見表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與因素水平Table1 Factors and levels of response surface methodology

1.3.5 苦菜黃酮抗氧化能力的測定

1.3.5.1 苦菜黃酮總抗氧化能力的測定 采用FRAP 法[14]。 Fe3+還原力標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：分別取濃度為0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 mmol·L-1的FeSO4溶液各3 mL,然后加入3 mL FRAP 工作液,混勻后放置于37℃恒溫水浴中反應(yīng)10 min,在593 nm波長處測定吸光度值。 以FeSO4濃度為橫坐標(biāo),吸光度值為縱坐標(biāo),進(jìn)行線性回歸分析。

分別取3 mL 不同質(zhì)量濃度的苦菜總黃酮提取液,依次加入3 mL FRAP 工作液,混勻后于37℃條件下恒溫水浴10 min,在593 nm 波長處測定其吸光度值。 苦菜黃酮總抗氧化能力以用相同吸光度值的FeSO4濃度進(jìn)行表示。 以相同濃度的維生素C(Vc)作為對照。

1.3.5.2 苦菜黃酮對DPPH 自由基清除能力的測定 參照楊娜等[15]的方法。 取3 mL 一定質(zhì)量濃度的苦菜總黃酮提取液,加入等體積的0.2 mmol·L-1無水乙醇溶液,混勻后在黑暗處放置30 min,以無水乙醇作為空白組,在517 nm 波長處測定其吸光度值。 以相同濃度的Vc 作對照。 按照公式計(jì)算DPPH 自由基的清除率：

式中,A0為DPPH 溶液+無水乙醇的吸光度值；A1為無水乙醇+苦菜黃酮提取液的吸光度值；A2為DPPH 溶液+苦菜黃酮提取液的吸光度值。

1.3.5.3 苦菜黃酮對羥基自由基清除能力的測定 參照Fenton 法[16]中的分光光度法。 取2 mL 一定濃度的苦菜黃酮提取物,分別加入2 mL PBS 緩沖液(pH值7.4)、2 mL 0.75 mmol·L-1鄰菲羅啉無水乙醇溶液、2 mL 0.75 mmol·L-1FeSO4溶液、1 mL 0.01%雙氧水及3 mL 蒸餾水,混合均勻后于37℃恒溫水浴中反應(yīng)1 h,隨后迅速測定該混合溶液在536 nm 波長處的吸光度值。 以相同濃度的Vc 作對照。 按照公式計(jì)算羥基自由基的清除率：

式中,A0為PBS 緩沖液+鄰菲羅啉溶液+蒸餾水+FeSO4溶液的吸光度值；A1為PBS 緩沖液+鄰菲羅啉溶液+蒸餾水+FeSO4溶液+H2O2的吸光度值；A2為PBS 緩沖液+鄰菲羅啉溶液+FeSO4溶液+苦菜黃酮溶液+H2O2的吸光度值。

1.3.5.4 苦菜黃酮超氧陰離子自由基清除能力的測定 采用鄰苯三酚自氧化法[17]。 鄰苯三酚自氧化速率測定：4.5 mL 50 mmol·L-1Tris-HCl 緩沖液(pH 值8.2)于37℃水浴中預(yù)熱20 min,加入4 mL 蒸餾水,均勻混合后于37℃條件下水浴20 min,隨后快速加入0.5 mL 3 mmol·L-1鄰苯三酚溶液(37℃水浴中預(yù)熱20 min)并開始計(jì)時(shí)1 min,1 min 后迅速搖勻倒入比色皿中,以10 mmol·L-1HCl 溶液調(diào)零,于325 nm 波長處每間隔30 s 測定該溶液的吸光度值。 以時(shí)間為橫坐標(biāo),吸光度值為縱坐標(biāo),繪制線性回歸曲線,其斜率即為鄰苯三酚的自氧化速率(Ⅴ0)。

按照以上步驟,將加入4 mL 的蒸餾水替換為4 mL 不同質(zhì)量濃度的苦菜黃酮溶液。 同樣以10 mmol·L-1HCl 溶液調(diào)零,測定其吸光度值。 按照同樣的方法進(jìn)行線性回歸分析,斜率記為Ⅴ1。 按照公式計(jì)算超氧陰離子自由基的清除率：

1.3.6 數(shù)據(jù)處理 使用Origin Pro 9.0、SAS 8.1 和Design Expert 8.06 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析、建立方程模型和作圖。 每試驗(yàn)均重復(fù)3 次,取平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

按照1.3.2 的方法繪制的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。 其回歸方程為y=34.834x+0.012 1,相關(guān)系數(shù)R2=0.998 3。

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Rutin standard curve

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 乙醇濃度對苦菜總黃酮得率的影響 由圖2可知,隨著乙醇濃度的增加,苦菜總黃酮得率呈先升高后降低趨勢,當(dāng)乙醇濃度為50%時(shí),苦菜總黃酮得率達(dá)到最大值(3.11%)。 乙醇濃度在較低范圍內(nèi),隨著乙醇濃度的增加,苦菜細(xì)胞發(fā)生溶脹現(xiàn)象,細(xì)胞中黃酮類化合物溶出,苦菜總黃酮得率升高[18]；當(dāng)乙醇濃度繼續(xù)增加,一方面,因?yàn)楦邼舛鹊囊掖荚诩訜徇^程中會揮發(fā)損失而影響提取效果,另一方面,根據(jù)相似相溶的原理,高濃度的乙醇溶液會溶解細(xì)胞中色素、脂溶性等物質(zhì),從而使得總黃酮得率降低[19-20]。 因此,選擇50%作為苦菜總黃酮提取的最佳乙醇濃度。

圖2 乙醇濃度對苦菜總黃酮得率的影響Fig.2 Effect of ethanol concentration on the total flavonoids yield in Sonchus oleraceus

2.2.2 浸提溫度對苦菜總黃酮得率的影響 由圖3可知,隨著浸提溫度的升高,苦菜總黃酮得率呈先升高后降低趨勢,當(dāng)浸提溫度為70℃時(shí),苦菜總黃酮的得率達(dá)到最大值(3.12%)。 這是因?yàn)檫m當(dāng)提高溫度會加快分子運(yùn)動,有利于苦菜黃酮的擴(kuò)散和浸出,當(dāng)溫度繼續(xù)升高時(shí),黃酮分子結(jié)構(gòu)遭到破壞,導(dǎo)致其提取率降低[21-22]。 故選用70℃作為苦菜總黃酮提取的最優(yōu)浸提溫度。

圖3 浸提溫度對苦菜總黃酮得率的影響Fig.3 Effect of extraction temperature on the total flavonoids yield in Sonchus oleraceus

2.2.3 浸提時(shí)間對苦菜總黃酮得率的影響 由圖4可知,當(dāng)浸提時(shí)間為30 ～150 min 時(shí),苦菜總黃酮得率呈上升趨勢,浸提時(shí)間為150 min 時(shí),苦菜總黃酮得率達(dá)到最大值(3.18%),浸提時(shí)間大于150 min后其得率略有下降。 這可能是因?yàn)殡S著浸提時(shí)間的延長,苦菜細(xì)胞壁逐漸被破壞,大量的黃酮類物質(zhì)溶出,進(jìn)而總黃酮得率升高[23]。 浸提時(shí)間達(dá)到150 min 時(shí)黃酮溶出已達(dá)到平衡,繼續(xù)延長浸提時(shí)間會使黃酮中一些熱敏性物質(zhì)遭到破壞,且乙醇濃度隨著浸提時(shí)間的延長而降低,導(dǎo)致苦菜總黃酮得率下降[24]。 因此,選用150 min 作為苦菜總黃酮提取的最佳浸提時(shí)間。

2.2.4 料液比對苦菜總黃酮得率的影響 由圖5可知,不同的料液比下提取得到的苦菜總黃酮含量不同,當(dāng)料液比為1 ∶60(m/v)時(shí),苦菜總黃酮得率達(dá)到最大值(3.71%)。 這可能是由于料液比較低時(shí),溶質(zhì)和溶劑接觸不充分,導(dǎo)致細(xì)胞中的黃酮不易溶出[25]；而過大的料液比會降低超聲波的超聲效果,使苦菜細(xì)胞壁不易破壞,黃酮難以溶出,而且會造成原料的浪費(fèi)[26]。 因此,選擇1 ∶60(m/v)作為苦菜總黃酮提取的最佳料液比。

2.3 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 試驗(yàn)方案設(shè)計(jì)及結(jié)果 利用Design Expert 8.06 軟件里的Box-Behnken 設(shè)計(jì)試驗(yàn)方案,其響應(yīng)值及方差分析結(jié)果見表2、表3。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table2 Design and results of response surface experiment

表3 響應(yīng)面方差分析表Table3 Variance analysis of regression equation

圖5 料液比對苦菜總黃酮得率的影響Fig.5 Effect of solid-liquid ratio on the total flavonoids yield in Sonchus oleraceus

對表2數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,得到總黃酮得率(Y)和編碼自變量A、B、C、D的回歸方程：

Y=3.70-0.019A-0.041B+0.013C+0.13D-2.5×10-3AB+2.5×10-3AC+2.5×10-3AD+5×10-3BD+2.5×10-3CD-0.065A2-0.17B2-0.017C2-0.45D2。

由表3可知,該方程模型極顯著(P＜0.000 1),且失擬項(xiàng)不顯著(P＞0.05),說明所得方程擬合較好,回歸顯著[27]。 方程模型的校正相關(guān)系數(shù)R2=0.995 4,校正絕對系數(shù)=0.990 4,說明試驗(yàn)因素A、B、C、D對苦菜總黃酮得率影響顯著。 其中B、D、A2、B2、D2的P值小于0.01,說明對苦菜總黃酮得率影響極顯著；試驗(yàn)因素A的P值小于0.05,說明對苦菜總黃酮得率影響顯著。 根據(jù)回歸方程中各項(xiàng)系數(shù)的絕對值表示各因素對響應(yīng)值影響的大小,正負(fù)表示對響應(yīng)值影響的方向的原理[28],得到影響苦菜總黃酮得率的因素大小依次為：料液比(D)＞浸提溫度(B)＞乙醇濃度(A)＞浸提時(shí)間(C)。

2.3.2 浸提溫度與料液比交互作用對苦菜總黃酮得率的影響 在Design Expert 8.06 軟件中因素的交互作用顯著性是根據(jù)等高線的形狀來表現(xiàn)的[29]。 一般等高線為橢圓形,且密集陡峭,說明因素的交互作用顯著；等高線為圓形,且稀疏平滑,說明因素的交互作用不顯著[30]。 由圖6可知,浸提溫度與料液比的等高線圖陡峭,說明兩者之間的交互作用顯著,這與表3中結(jié)果一致,響應(yīng)圖中存在最高點(diǎn),說明苦菜總黃酮得率存在最大值[31]。

圖6 浸提溫度與料液比交互作用對苦菜總黃酮得率的影響Fig.6 Effect of interaction between extraction temperature and solid-liquid ratio on the total flavonoids yield in Sonchus oleraceus

2.3.3 驗(yàn)證試驗(yàn) 響應(yīng)面優(yōu)化得到苦菜總黃酮的最優(yōu)提取工藝條件為：乙醇濃度48.66%、浸提溫度68.82℃、 浸 提 時(shí) 間 162.05 min、 料 液 比1 ∶61.49(m/v),此條件下苦菜總黃酮得率的理論值為3.71%。為便于實(shí)際操作,將該條件調(diào)整為：乙醇濃度49%、浸提溫度69℃、浸提時(shí)間162 min、料液比1 ∶62(m/v),經(jīng)驗(yàn)證,此條件下苦菜總黃酮得率的實(shí)際值為3.73%±0.03%,與理論值誤差僅為0.54%,證明該試驗(yàn)方程可靠、有效,可以用于模擬苦菜總黃酮提取工藝。

2.4 苦菜總黃酮的抗氧化活性分析

2.4.1 苦菜總黃酮提取液的Fe3+還原能力分析 由圖7可知,FeSO4濃度在0.01 ～0.10 mmol·L-1范圍內(nèi)與吸光度值呈良好線性關(guān)系。 回歸方程為y=8.164 4x-0.004 2,相關(guān)系數(shù)R2=0.999 9。

由圖8可知,苦菜總黃酮提取液具有明顯的總抗氧化能力。 當(dāng)苦菜總黃酮提取液質(zhì)量濃度為0.005 ～0.020 mg·mL-1時(shí),其Fe3+還原能力幾乎呈直線上升,當(dāng)苦菜總黃酮提取液質(zhì)量濃度大于0.02 mg·mL-1后,其Fe3+還原能力增大趨勢變緩。 根據(jù)總抗氧化標(biāo)準(zhǔn)曲線y=8.164 4x-0.004 2 可知,0.01 mg·mL-1苦菜總黃酮提取液的抗氧化能力等同于0.18 mmol·mL-1FeSO4溶液；與相同質(zhì)量濃度的Vc 溶液相比,苦菜總黃酮提取液的Fe3+還原能力較低,這與向極釬等[32]的研究結(jié)果相似。

圖7 Fe3+還原力標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.7 The standard curve of Fe3+ reducing power

圖8 苦菜總黃酮提取液對Fe3+還原力的影響Fig.8 Effect of total flavonoids extract from Sonchus oleraceus on Fe3+ reducing power

2.4.2 苦菜總黃酮提取液的DPPH 自由基清除能力分析 由圖9可知,苦菜總黃酮提取液對清除DPPH自由基有明顯作用。 當(dāng)苦菜黃酮提取液質(zhì)量濃度為0.001～0.01 mg·mL-1時(shí),其DPPH 自由基清除率幾乎呈直線上升；當(dāng)苦菜黃酮提取液質(zhì)量濃度為0.01 ～0.02 mg·mL-1時(shí),其DPPH 自由基清除率上升趨勢變緩；當(dāng)苦菜黃酮提取液質(zhì)量濃度大于0.02 mg·mL-1時(shí),其DPPH 自由基清除率幾乎保持不變,說明此時(shí)溶液中大多數(shù)DPPH 自由基已經(jīng)被清除[33]。 與相同質(zhì)量濃度的Vc 相比,質(zhì)量濃度小于0.01 mg·mL-1時(shí),苦菜黃酮提取液對DPPH 自由基表現(xiàn)出更強(qiáng)的清除能力；質(zhì)量濃度大于0.01 mg·mL-1時(shí),則Vc 對DPPH自由基表現(xiàn)出更強(qiáng)的清除能力,這與楊申明等[34]的研究結(jié)果相似。 根據(jù)擬合曲線可知,苦菜總黃酮提取液的半抑制濃度(IC50)為0.005 9 mg·mL-1。

圖9 苦菜總黃酮提取液對DPPH 自由基清除率的影響Fig.9 Effect of total flavonoids extract from Sonchus oleraceus on DPPH radical scavenging rate

2.4.3 苦菜黃酮提取液的羥基自由基清除能力分析 由圖10 可知,與相同質(zhì)量濃度的Vc 相比,苦菜總黃酮提取液對羥基自由基的清除能力更強(qiáng)。 當(dāng)苦菜總黃酮提取液的質(zhì)量濃度為0.1 ～0.3 mg·mL-1時(shí),其羥基自由基清除率上升迅速；當(dāng)苦菜總黃酮提取液的質(zhì)量濃度大于0.3 mg·mL-1時(shí),其羥基自由基清除率上升變緩,說明此時(shí)溶液中的大多數(shù)羥基自由基已經(jīng)被清除[35]。 根據(jù)擬合曲線得到苦菜總黃酮的IC50為0.153 mg·mL-1。

2.4.4 苦菜總黃酮提取液的超氧陰離子自由基清除能力分析 由圖11 可知,與相同質(zhì)量濃度的Vc 相比,苦菜總黃酮對超氧陰離子自由基的清除能力較弱。 苦菜總黃酮提取液的質(zhì)量濃度為0.005 ～0.03 mg·mL-1時(shí),其對超氧陰自由基的清除率逐漸上升,表現(xiàn)出一定的清除能力,這與白生文等[36]的研究結(jié)果相似。 根據(jù)擬合曲線得到苦菜總黃酮的IC50為0.024 8 mg·mL-1。

圖10 苦菜總黃酮提取液對羥基自由基清除率的影響Fig.10 Effect of total flavonoids extract from Sonchus oleraceus on hydroxyl radical scavenging rate

圖11 苦菜總黃酮提取液對超氧陰離子自由基清除率的影響Fig.11 Effect of total flavonoids extract from Sonchus oleraceus on superoxide anion radical scavenging rate

3 討論

植物細(xì)胞壁是植物有效成分提取的主要阻礙,只有將封閉目標(biāo)產(chǎn)物的細(xì)胞壁破壞掉,目標(biāo)產(chǎn)物流出,才能提高有效成分的提取率[37]。 超聲波輔助提取技術(shù)因其操作簡便、經(jīng)濟(jì)省時(shí)等優(yōu)點(diǎn)已被廣泛應(yīng)用于提取植物黃酮類物質(zhì)。 夏寧等[38]采用水溶法提取荷葉總黃酮,通過優(yōu)化得到荷葉總黃酮最佳得率為2.49%,而丁芳林等[39]采用超聲波輔助法提取荷葉總黃酮,通過正交優(yōu)化得到荷葉總黃酮最佳提取率為4.4%。 本試驗(yàn)結(jié)果表明,在優(yōu)化后的工藝條件下,苦菜總黃酮理論得率為 3.71%,高于權(quán)美平[6]的試驗(yàn)結(jié)果(1.96%),但比張晶晶等[19]的試驗(yàn)結(jié)果(6.64%)低。以上除了工藝條件的差異,還可能與原料本身差異有關(guān),不同地區(qū)的苦菜由于生長環(huán)境不同,導(dǎo)致其本身黃酮類物質(zhì)含量不同[40],此外,原料顆粒的大小也影響總黃酮的提取效果。

研究表明,在人體正常代謝下自由基有一定的免疫和傳遞信號的功能,但過量的自由基會嚴(yán)重影響人的身體健康,引發(fā)多種疾病,如心臟病、老年癡呆癥等,因此降低自由基對人體危害已勢在必行[41]。 黃酮類物質(zhì)具有清除自由基的能力,本試驗(yàn)中,苦菜總黃酮提取液具備DPPH 自由基、羥基自由基、超氧陰離子自由基的清除能力,其中苦菜總黃酮提取液對DPPH 自由基的清除能力與張坤等[42]的試驗(yàn)結(jié)果相似,但表現(xiàn)出更強(qiáng)的DPPH 自由清除基能力,這可能是因?yàn)榭嗖酥泻休^多的酚酸[2]；在清除羥基自由基能力上,本試驗(yàn)結(jié)果與周勸娥等[43]的研究結(jié)果有差異,這可能是因?yàn)椴煌瑵舛鹊囊掖继崛∪軇?導(dǎo)致苦菜總黃酮中成分的不同,且苦菜總黃酮提取液中含有單寧、多酚類等抗氧化物質(zhì),相互間產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng),從而提高了對羥基自由基的清除能力；在清除超氧陰離子自由基能力上,與周勸娥等[43]的研究結(jié)果相比,本試驗(yàn)中苦菜總黃酮提取液對超氧陰離子自由基表現(xiàn)出更強(qiáng)的清除能力。在總抗氧化能力(Fe3+還原力)上,本研究結(jié)果與張坤等[42]的試驗(yàn)結(jié)果相似,說明苦菜總黃酮提取液表現(xiàn)出一定的總抗氧化能力。

4 結(jié)論

采用超聲波-乙醇法提取苦菜總黃酮,利用響應(yīng)面法得到苦菜總黃酮的最優(yōu)提取條件為：乙醇濃度49%、浸提溫度69℃、浸提時(shí)間162 min、料液比1 ∶62(m/v),此條件下苦菜總黃酮得率為3.73%±0.03%,較單因素得率有相應(yīng)的提高,說明采用響應(yīng)面法優(yōu)化工藝可靠。 苦菜總黃酮提取液具有較強(qiáng)的抗氧化活性,在清除羥基自由基能力上,苦菜總黃酮較同質(zhì)量濃度Vc 表現(xiàn)出更強(qiáng)的清除能力,這為苦菜總黃酮的開發(fā)和應(yīng)用提供了科學(xué)依據(jù)。 但本試驗(yàn)中苦菜總黃酮為粗提液,含有許多雜質(zhì),所以下一步可對苦菜總黃酮提取液進(jìn)一步分離純化并對其成分進(jìn)行分析,深入探究苦菜總黃酮的抗氧化功效。