杜蛭丸灌胃對缺血性腦卒中大鼠的保護作用及其機制探討

王瑞雪，張 敬，趙 珍，李春蕾，王志勇

(中國醫(yī)藥工業(yè)研究總院上海醫(yī)藥工業(yè)研究院 上海市生物物質(zhì)成藥性評價專業(yè)技術(shù)服務(wù)平臺，上海 200437)

腦卒中是繼冠心病和腫瘤之后居第3位的世界危險疾病，我國腦卒中死亡人數(shù)占世界腦卒中死亡人數(shù)的33%，是近年來導(dǎo)致我國城鄉(xiāng)居民殘疾和死亡的主要疾病之一[1]。臨床上，缺血性腦卒中占全部腦卒中患者的60%～80%，是由于大腦部分區(qū)域缺血缺氧引起的級聯(lián)反應(yīng)，包括興奮性氨基酸毒性、氧自由基和活性氧類的產(chǎn)生、炎癥以及細胞凋亡等[2-3]。本病治療的關(guān)鍵在于改善患者腦血循環(huán)通路和神經(jīng)保護，但目前的治療方案和用藥療效尚有進一步優(yōu)化的空間[4]。有研究報道杜蛭丸對氣虛血瘀型缺血性腦卒中具有顯著的臨床療效，在降低大腦缺血狀態(tài)下血管通透性的同時可提高腦組織耐缺氧功能，而且還具有抗血小板聚集和抗血栓形成的功效，從而有效改善腦部血液循環(huán)[5]。為進一步研究杜蛭丸對缺血性腦卒中的作用及其可能的機制，本研究擬通過線栓法誘導(dǎo)大鼠大腦中動脈阻塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)模型，從神經(jīng)行為評分、腦梗死百分率等方面評價杜蛭丸對MCAO模型大鼠的保護作用，期望能為臨床應(yīng)用杜蛭丸治療缺血性腦卒中提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實驗材料

1.1.1實驗動物 SPF級雄性SD大鼠共142只，體重250～280 g，購自上海斯萊克實驗動物有限公司。實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(滬)2012-2002，使用許可證號：SYXK(滬)2014-0018。

1.1.2藥物與試劑 杜蛭丸(吉林敖東延邊藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)，批號：1603101；規(guī)格：每25粒重5 g)為黑色水蜜丸，組分：杜仲(制)、巴戟天、淫羊藿、黃芪、當歸、水蛭、赤芍、益母草、地黃、白薇、石菖蒲及伸筋草；依諾肝素鈉注射液購自賽諾菲(北京)制藥有限公司(規(guī)格：0.6 mL∶6000AxalU，批號：5SJ78)；2,3,5-三苯基氯化四氮唑(2,3,5-triphenyl tetrazolium chloride，TTC，批號：20120315)和水合氯醛(批號：20101026)均購自上海國藥集團化學(xué)試劑有限公司；腺苷二磷酸(adenosine diphosphate，ADP)購自美國Sigma公司(批號：SLBB1854V)。

1.1.3主要儀器 全自動血液流變儀(型號：LBY-N6 COMPACT)購自北京普利生儀器有限公司；血小板聚集儀(型號：560CA)購自美國CHRONO-LOG公司。

1.2試驗分組及藥物干預(yù) 將142只健康雄性SD大鼠隨機分為以下7組：A組(正常對照組，n=16，給予等量氯化鈉溶液灌胃)和B組[n=6，給予中劑量杜蛭丸溶液,1.0 g/(kg·d)灌胃]均每日1次,連續(xù)7 d,第8天予水合氯醛腹腔注射麻醉后，分別采集腹腔主動脈血各5 mL；C組、D組、E組和 F組各24只，依次分別給予等量氯化鈉溶液、低劑量杜蛭丸溶液[0.5 g/(kg·d)]、中劑量杜蛭丸溶液[1.0 g/(kg·d)]、高劑量杜蛭丸溶液[2.0 g/(kg·d)]灌胃，均每日1次，連續(xù)7 d,第8天予水合氯醛腹腔注射麻醉后，采用線栓法建立大鼠MCAO模型，造模成功第24小時采集大鼠腹腔主動脈血各5 mL。G組(陽性對照組，n=24)第1～7天不予任何處理，自由喂食和飼養(yǎng)，第8天時在大鼠尾靜脈注射依諾肝素鈉(500 U/kg)，10 min后給予水合氯醛腹腔注射麻醉，其他后續(xù)操作同C組、D組、E組和F組。以上灌胃藥物均為100 g/mL。

1.3MCAO模型的制備 參考既往文獻[6]對 C組、D組、E組、F組和G組(均n=24)大鼠施行MCAO造模手術(shù)，并進行缺血再灌注，改進方法如下：以12%的水合氯醛分別對大鼠進行腹腔注射麻醉(360 mg/kg)后，將大鼠取仰臥位并固定于手術(shù)臺上，室溫約25 ℃，切開大鼠右側(cè)頸部皮膚，分離和結(jié)扎右側(cè)頸總動脈、頸外動脈及其分支動脈，分離右側(cè)頸總、頸內(nèi)及頸外動脈，至鼓泡處可見其顱外分支翼腭動脈，從根部結(jié)扎該分支。在頸外動脈遠端結(jié)扎備線和放置動脈夾，拉直頸外動脈后，在分叉處切口，插入直徑為0.26 mm的尼龍線17～20 mm，栓線從頸外動脈進入經(jīng)頸內(nèi)至大腦中動脈起始端附近，阻斷大腦中動脈供血區(qū)全部血流。扎緊備線，阻斷血流90 min后，拔出栓線，使血流再灌注，結(jié)扎備線，縫合皮膚，將各組手術(shù)后大鼠分籠飼養(yǎng)。參照賈淑偉和夏青[7]研究中MCAO模型判定標準判定本研究中各組大鼠造模成功與否。

1.4檢測指標和方法

1.4.1神經(jīng)行為學(xué)評估及腦梗死面積測量 對C組(n=12)、D組(n=12)、E組(n=12)、F組(n=12)、G組(n=12)共60只施行MCAO造模手術(shù)的大鼠檢測梗死面積及神經(jīng)性為評分，待缺血再灌注24 h后，應(yīng)用Longa評分法評估其神經(jīng)行為學(xué)改變情況，評分標準[8]：0分為沒有神經(jīng)功能障礙；1分為提起大鼠尾巴時，其對側(cè)前肢屈曲；2分為大鼠在地面行走時出現(xiàn)打轉(zhuǎn)現(xiàn)象，靜止時身體未見偏向?qū)?cè)；3分為大鼠在地面行走時出現(xiàn)打轉(zhuǎn)現(xiàn)象，靜止時身體偏向?qū)?cè)；4分為出現(xiàn)嚴重意識障礙；5分為大鼠死亡。評分完畢后剪斷大鼠頭頸部，取出腦組織，剔除小腦組織，將大腦組織均等分為5片，進行TTC染色后，應(yīng)用數(shù)碼相機拍照，Image J軟件統(tǒng)計全部腦區(qū)面積和梗死區(qū)面積，腦梗死百分率(%)=腦梗死區(qū)面積(cm2)/全腦區(qū)面積(cm2)[9]。

1.4.2血小板聚集實驗 包括體內(nèi)實驗和體外實驗兩部分。體外實驗用A組5只正常大鼠制備血小板，杜蛭丸水溶液濃度依次為0.01、0.03、0.1、0.3及1.0 mg/mL，以0.9%氯化鈉溶液作為空白對照組。血小板聚集率測定時，每組重復(fù)測定7次，最終統(tǒng)計以重復(fù)測定結(jié)果為準，體內(nèi)外實驗測定次數(shù)保持一致，測定方法參考文獻[10]并略有改進，具體如下：血小板聚集儀中加入198 μL血小板及2 μL待測杜蛭丸溶液，連續(xù)攪拌并孵育5 min，再加入ADP，使其與處理后的待檢血小板充分反應(yīng)，并用血小板聚集儀記錄加入ADP后的反應(yīng)過程，即為血小板聚集率，并由此計算相應(yīng)的血小板聚集抑制率。體內(nèi)實驗應(yīng)用上述制備好的血小板，用A組5只大鼠制備含藥血清，方法如下：4只大鼠分別給予杜蛭丸(0.5 g/kg，2只；2.0 g/kg，2只)灌胃1 h后，予以水合氯醛腹腔注射麻醉，經(jīng)腹主動脈采血5 mL，以1 811×g離心15 min得上清，即為含藥血清；1只大鼠給予等量氯化鈉溶液作為空白對照組。血小板聚集抑制率(%)=[聚集率(溶劑組)-聚集率(實驗組)]/聚集率(溶劑組)×100%[9]。

1.4.3血液黏度和凝血檢測 對A組(n=6)、B組(n=6)及C、D、E、F、G各組剩余的12只施行MCAO造模手術(shù)的大鼠進行血液黏度和凝血檢測。缺血再灌注24 h后在其腹主動脈采集血標本各5 mL 用于后續(xù)實驗研究,其中取1 mL全血加肝素鈉抗凝，應(yīng)用全自動血液流變儀測定全血黏度、全血相對黏度及血細胞比容；同時取2 mL全血加3.2%枸櫞酸鈉抗凝，用于測定凝血酶原時間(prothrombin time，PT)、凝血酶時間(thrombin time，TT)、活化部分凝血活酶時間(activated partial thromboplastin time，APTT)及纖維蛋白原(fibrinogen，F(xiàn)IB)。

2 結(jié) 果

2.1各組MCAO模型大鼠神經(jīng)行為學(xué)評分和腦梗死百分率的比較 線栓法致大鼠局灶性腦缺血后，C組、D組、E組、F組、G組分別死亡5只、3只、3只、0只和6只，存活的43只大鼠均有明顯的神經(jīng)行為缺陷，表現(xiàn)為手術(shù)對側(cè)前肢內(nèi)收或屈曲，并向一側(cè)旋轉(zhuǎn)等，腦組織切片染色檢查可見明顯腦梗死病灶，見圖1。本研究中有43只大鼠造模成功。術(shù)前1周對各組大鼠予以不同濃度杜蛭丸溶液進行灌胃，各組大鼠神經(jīng)行為學(xué)評分和腦梗死百分率比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),其中F組和G組大鼠神經(jīng)行為學(xué)評分、腦梗死百分率低于C組(P<0.01)；其余各組大鼠神經(jīng)行為學(xué)評分和腦梗死百分率與C組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)。見表1。

MCAO：大腦中動脈阻塞；C組：0.9%氯化鈉溶液+MCAO組；D組：低劑量杜蛭丸溶液(0.5 g/kg)+MCAO組；E組：中劑量杜蛭丸溶液(1.0 g/kg)+MCAO組；F組：高劑量杜蛭丸溶液(2.0 g/kg)+MCAO組；G組：陽性對照(依諾肝素鈉，500 U/kg)+MCAO組

圖1 杜蛭丸對線栓法致大鼠局灶性腦缺血的影響(TTC染色)

組別只數(shù)神經(jīng)行為學(xué)評分(分)梗死百分率(%)C組73.29±0.7620.51±7.79D組93.00±0.8719.19±10.76E組92.89±0.9319.07±11.89F組122.33±0.49a12.23±6.09aG組62.17±0.41a6.95±3.41aF值3.2763.215P值0.0210.023

MCAO：大腦中動脈阻塞；C組：氯化鈉溶液+MCAO組；D組：低劑量杜蛭丸溶液+MCAO組；E組：中劑量杜蛭丸溶液+MCAO組；F組：高劑量杜蛭丸溶液+MCAO組；G組：陽性對照+MCAO組；a與C組比較，P<0.05

2.2各組MCAO模型大鼠血小板聚集情況的比較 體外實驗時，血小板同ADP在不同濃度的杜蛭丸水溶液(0.1 mg/mL，0.3 mg/mL和1.0 mg/mL)中充分反應(yīng)時，隨著杜蛭丸溶液濃度的逐漸升高，血小板聚集率逐漸下降(均P<0.01)，見表2。體內(nèi)含藥血清實驗結(jié)果顯示，空白對照組、0.5 g/kg杜蛭丸和2.0 g/kg杜蛭丸組血小板聚集率分別為(28.6±4.6)%、(29.0±4.9)%、(21.9±5.1)%，各組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=4.516,P=0.028),其中2.0 g/kg 杜蛭丸組血小板聚集率低于空白對照組和0.5 g/kg杜蛭丸(均P<0.05)。

2.3各組MCAO模型大鼠血細胞比容改變情況的比較 MCAO模型大鼠缺血再灌注24 h后，A組、B組、C組、D組、E組、F組、G組分別死亡0只、1只、2只、2只、2只、3只和3只，最終有59只大鼠存活。各組MCAO模型大鼠血細胞比容比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，其中C組大鼠血細胞比容明顯高于A組(P<0.01)，G組、F組大鼠血細胞比容明顯低于C組(P<0.01)。G組與F組大鼠血細胞比容比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

組別血小板聚集率(%)空白對照組100.0±7.1 0.01 mg/mL93.2±11.3 0.03 mg/mL96.7±9.4杜蛭丸組 0.10 mg/mL73.3±12.9a 0.30 mg/mL72.5±10.9a 1.00 mg/mL40.6±9.1a F值31.642 P值<0.001

MCAO：大腦中動脈阻塞；a與空白對照組比較，P<0.01

組別只數(shù)血細胞比容A組60.346±0.007B組50.357±0.018C組100.435±0.042aD組100.408±0.050E組100.422±0.029F組90.389±0.037bG組90.386±0.032bF值5.870P值<0.001

MCAO：大腦中動脈阻塞；A組：氯化鈉溶液+正常大鼠組；B組：中劑量杜蛭丸溶液+正常大鼠組；C組：氯化鈉溶液+MCAO組；D組：低劑量杜蛭丸溶液+MCAO組；E：中劑量杜蛭丸溶液+MCAO組；F：高劑量杜蛭丸溶液+MCAO組；G：陽性對照+MCAO組；a與A組比較，P<0.01；b與C組比較，P<0.01

2.4各組MCAO大鼠血液黏度與凝血情況的比較 各組大鼠低切全血黏度比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，其中B組低于A組(P<0.05)，C組高于A組(P<0.05)，缺血再灌注24 h后，G組和 D組血液黏度均較C組明顯降低(均P<0.05)；各組大鼠高切全血黏度比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，B組低于A組，C組高于A組(P<0.05)，G組低于C組(P<0.05)；各組大鼠低切全血相對黏度比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，其中D組、E組和G組低于C組(P<0.05)；各組大鼠高切全血相對黏度比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表4。各組大鼠APTT、PT水平比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)；各組大鼠TT、FIB水平比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.01)，其中B組和C組TT、FIB水平高于A組(P<0.05)。見表5。

3 討 論

缺血性腦卒中的高發(fā)病率、高致殘率、高死亡率嚴重影響人們的正常生活。目前有多種中藥復(fù)方研究用于治療缺血性腦卒中，但基于中藥的多種化學(xué)成分、多個作用靶點、多條作用通路使其在治療應(yīng)用的特異性上有一定的局限性。為探究杜蛭丸對缺血性腦卒中大鼠的作用，本研究事先予大鼠以低(0.5 g/kg)、中(1.0 g/kg)、高(2.0 g/kg)劑量杜蛭丸藥液灌胃7 d，發(fā)現(xiàn)MCAO模型大鼠手術(shù)后24 h，給予高劑量杜蛭丸溶液灌胃+MCAO模型大鼠腦梗死面積比其他組大鼠明顯減少，而且神經(jīng)行為缺陷改善明顯，提示杜蛭丸發(fā)揮神經(jīng)保護和治療缺血再灌注損傷作用的最佳劑量為2.0 g/kg。

目前已知異常血小板激活在腦卒中的發(fā)病機制中起關(guān)鍵作用，在腦缺血時,血小板功能亢進,血液處于高凝狀態(tài)[11]。本研究結(jié)果顯示在體內(nèi)含藥血清實驗中，高劑量杜蛭丸溶液組大鼠血小板聚集率明顯降低，而聚集抑制率明顯增加，提示該組大鼠具有良好的抑制血小板聚集能力，而且體外實驗結(jié)果與此相同。血液流變學(xué)異常改變與缺血性腦卒中有關(guān)。血液黏度升高時易形成血栓，阻礙血液循環(huán)，導(dǎo)致組織供血供氧不足。腦缺血后，血液黏度顯著升高，血細胞比容是影響血液黏度的重要因素，血液黏度會隨血細胞比容升高而增高，故血細胞比容增高提示紅細胞變形能力變低，且聚集能力升高，這可能導(dǎo)致血液黏滯性增加和流動性降低。陸春燕[12]對≤

組別只數(shù)全血黏度(mPa·s)低切11.5/s高切115/s全血相對黏度(mPa·s)低切11.5/s高切115/sA組69.56±0.604.00±0.229.56±0.774.00±0.32B組58.48±0.86a3.62±0.22a8.79±1.003.76±0.28C組1011.21±1.43a4.71±0.73a10.49±1.214.40±0.53D組109.80±1.07b4.22±0.429.06±0.79b3.91±0.32E組1010.25±1.404.47±0.669.34±1.01b4.07±0.50F組910.42±0.994.53±0.519.58±1.054.17±0.52G組99.74±0.82b4.08±0.28b9.29±0.85b3.89±0.32F值4.0773.7022.5792.014P值0.0020.0040.0290.080

MCAO：大腦中動脈阻塞；A組：氯化鈉溶液+正常大鼠組；B組：中劑量杜蛭丸溶液+正常大鼠組；C組：氯化鈉溶液+MCAO組；D組：低劑量杜蛭丸溶液+MCAO組；E：中劑量杜蛭丸溶液+MCAO組；F：高劑量杜蛭丸溶液+MCAO組；G：陽性對照+MCAO組；a與A組比較，P<0.05；b與C組比較，P<0.05

組別只數(shù)APTT(s)PT(s)TT(s)FIB(g/L)A組617.6±3.911.4±3.261.2±7.81.85±0.11B組515.2±0.79.4±0.350.3±3.4a2.01±0.11aC組1021.4±4.411.3±2.942.5±3.0a4.07±0.66aD組1020.1±5.111.3±2.842.5±1.94.05±0.87E組1019.1±4.69.7±2.241.5±2.94.43±1.02F組921.8±7.212.8±5.643.1±3.24.17±0.57G組921.0±3.211.0±2.640.2±6.63.88±0.58F值1.5740.17419.92215.229P值0.9270.483<0.001<0.001

MCAO：大腦中動脈阻塞；PT：凝血酶原時間；TT：凝血酶時間；APTT：活化部分凝血活酶時間；FIB：纖維蛋白原；A組：氯化鈉溶液+正常大鼠組；B組：中劑量杜蛭丸溶液+正常大鼠組；C組：氯化鈉溶液+MCAO組；D組：低劑量杜蛭丸溶液+MCAO組；E：中劑量杜蛭丸溶液+MCAO組；F：高劑量杜蛭丸溶液+MCAO組；G：陽性對照+MCAO組；a與A組比較，P<0.05

125例缺血性腦卒中患者和125名健康人進行研究發(fā)現(xiàn)，腦缺血患者的全血黏度、全血高切黏度、全血低切黏度水平均高于健康人。由此可見,罹患缺血性腦卒中的患者血液流變學(xué)指標會明顯升高。本研究結(jié)果與既往研究結(jié)果[12]相一致。本研究結(jié)果顯示，在給予大鼠高劑量杜蛭丸溶液后，血細胞比容與C組的差異有統(tǒng)計學(xué)意義，但與G組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，表明高劑量杜蛭丸治療可降低大鼠血細胞比容，保護紅細胞數(shù)量及形態(tài)，其作用強度與 G組應(yīng)用的依諾肝素鈉相近。本研究中F組和 G組大鼠血細胞比容和血液黏度的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義，提示杜蛭丸與依諾肝素鈉治療缺血性腦卒中大鼠的療效相當，但是前者口服給藥，方法便捷。另外，各組大鼠APTT、PT水平比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義；各組大鼠TT、FIB水平比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.01)，其中B組和C組TT、FIB水平高于A組(P<0.05)，說明杜蛭丸對缺血性腦卒中具有保護作用，這可能與其降低血細胞比容及抑制血小板聚集有關(guān)。

目前，治療缺血性腦卒中重在改善腦血循環(huán)和神經(jīng)保護，中醫(yī)稱前者為活血化瘀[13]。杜蛭丸主要成分為杜仲(制)、巴戟天、淫羊藿、黃芪、當歸、水蛭、赤芍、益母草、地黃、白薇、石菖蒲、伸筋草，其中杜仲、巴戟天、淫羊藿、黃芪具有補中益精和強筋骨之效；當歸可補血活血；水蛭、赤芍、白薇、益母草和地黃可活血祛瘀；石菖蒲和伸筋草可舒經(jīng)活絡(luò)[14]?，F(xiàn)代藥理學(xué)的研究認為杜仲、巴戟天、淫羊藿、黃芪等具有補中益精氣功效，可清除氧自由基，具有降低紅細胞過氧化物含量和提高細胞超氧化物歧化酶活性的作用[15-18]；水蛭中所含水蛭素是迄今為止發(fā)現(xiàn)的最強的凝血酶天然特異抑制劑，具有高效抗凝作用[19]；益母草、赤芍和當歸均能通過抑制血小板聚集[20-22]，降低血液黏度，從而抑制血栓形成。此外，石菖蒲能抑制缺血再灌注大鼠細胞凋亡；地黃能夠促進血細胞增殖[23]；白薇和伸筋草有抗炎作用[24-25]。本研究中，杜蛭丸能夠發(fā)揮對缺血性腦卒中的保護作用，可能與杜仲、巴戟天、淫羊藿、黃芪的抗氧化應(yīng)激作用有關(guān)[15-18]。同時，益母草、赤芍和當歸抑制血小板聚集，從而具有抑制血栓形成作用。

綜上所述，高劑量杜蛭丸溶液對缺血性腦卒中具有保護作用，這為臨床治療缺血性腦卒中提供了選擇應(yīng)用參考，但其作用機制尚未明確，可能涉及抗氧化應(yīng)激及抗血栓形成等方面，還需進一步論證。