東北傳統(tǒng)發(fā)酵酸菜中乳酸菌的篩選及發(fā)酵特性研究

桑建，王鑫宇，陳大衛(wèi)，葉海青，*，吳子健

（1.揚州大學江蘇省乳品生物技術(shù)與安全控制重點實驗室，江蘇揚州225127；2.吉林大學食品科學與工程學院，吉林長春130062；3.天津商業(yè)大學生物技術(shù)與食品科學學院，天津市食品生物技術(shù)重點實驗室，天津 300134）

中國酸菜的悠久歷史可以追溯到3 000多年前的周朝，北魏賈思勰所著的《齊民要術(shù)》中就有詳細記載。古人用腌漬方法來儲存蔬菜，便有了酸菜的雛形，經(jīng)過幾千年的歷史文化變遷，酸菜在中國的市場上仍然受追捧。酸菜通常是將新鮮的蔬菜浸泡在6%～8%的鹽溶液中，然后密封，使生鮮菜葉子上的固有微生物發(fā)酵產(chǎn)生乳酸及各種風味物質(zhì)而成[1-2]。乳酸菌群在酸菜的發(fā)酵體系中發(fā)揮主導作用[3]，其發(fā)酵產(chǎn)生的酸、醇、酯等呈味物質(zhì)，賦予了酸菜特有的風味及口感[4]；乳酸菌代謝產(chǎn)生的乳酸和細菌素等物質(zhì)可以抑制發(fā)酵體系中腐敗菌的生長[5]。此外，酸菜中的乳酸菌及其代謝物還具有助消化、調(diào)節(jié)腸道菌群、降血脂等保健功效[6-7]。傳統(tǒng)東北酸菜以白菜為原料經(jīng)自然發(fā)酵而成，因其所處獨特的地理環(huán)境及人文歷史成為中國酸菜家族的典型代表，并成為東北獨特的飲食文化元素[8]。目前，東北酸菜生產(chǎn)正在從傳統(tǒng)自然發(fā)酵向工業(yè)化接種發(fā)酵發(fā)展。乳酸菌的性能決定了酸菜的品質(zhì)，因為缺少性能優(yōu)良的專用酸菜發(fā)酵劑，發(fā)酵周期長、品質(zhì)不穩(wěn)定、腐爛率高、亞硝酸鹽高等一系列問題依然是阻礙酸菜的規(guī)?；?、標準化生產(chǎn)的主要矛盾[9-11]。因此，從傳統(tǒng)自然發(fā)酵的酸菜中篩選分離性能優(yōu)良，既能產(chǎn)生獨特的風味又能保證安全品質(zhì)的酸菜發(fā)酵劑是實現(xiàn)酸菜工業(yè)化的必要保證。本研究主要以吉林長春地區(qū)百姓家中發(fā)酵品質(zhì)良好的酸菜發(fā)酵液為樣品，通過菌落形態(tài)、革蘭氏染色、過氧化氫酶活性等分離乳酸菌，根據(jù)產(chǎn)酸特性、降亞硝酸鹽能力、抑菌活性從中篩選優(yōu)質(zhì)菌株，再用分離菌株作為發(fā)酵劑發(fā)酵酸菜，經(jīng)感官評價和風味成分分析最終得到理想的乳酸菌菌株，為東北酸菜實現(xiàn)高品質(zhì)規(guī)?；I(yè)化生產(chǎn)提供菌種資源。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

自發(fā)酵酸菜汁10份，分別采自長春市綠園小區(qū)、萬盛小區(qū)、中新花園小區(qū)10戶市民家中，居民自述所用白菜均為“東北大矮”，用滅菌吸管吸取5mL酸菜汁，裝入10 mL無菌離心管備用；大腸桿菌（ATCC8739）、金黃色葡萄球菌（ATCC95922）：國家標準菌株庫，吉林大學食品安全實驗室保存；沙門氏菌、李斯特菌：吉林大學人獸共患病研究室分離鑒定保存；MRS瓊脂培養(yǎng)基、MRS肉湯培養(yǎng)基、LBS肉湯培養(yǎng)基：北京奧博星生物技術(shù)有限責任公司；MRS瓊脂培養(yǎng)基中加入1.5%的碳酸鈣制成MRS-CaCO3選擇培養(yǎng)基[12]。Ezup柱式細菌基因組DNA抽提試劑盒、SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒、pMD 18-T Vector連接試劑盒：上海生工生物工程股份有限公司；其他試劑均為實驗室常備分析純或色譜純。

1.1.2 儀器與設備

HZQ-X400型恒溫培養(yǎng)箱：太倉市科教器材廠；SW-CJ-1D型超凈工作臺：浙江蘇州凈化設備有限公司；PHS-3C型pH計：上海儀電科學儀器有限公司；LC-20A型超高效液相色譜儀：日本島津公司；AMD9PLUS+AMD5型氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀：東莞市歐若斯儀器有限公司；DP-6027型固相微萃取儀：北京亞歐德鵬科技有限公司；DYCP-31A穩(wěn)壓電泳儀、WD-9413A凝膠成像儀：北京六一儀器廠；YS2-H型顯微鏡：Nikon China；721G-100可見分光光度計：上海精密科學儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 乳酸菌的分離純化

參照Wu等[13]的方法，分別取1mL酸菜汁用0.85%無菌生理鹽水梯度稀釋制備（10-1～10-8）濃度的酸菜汁，旋渦振蕩混勻。依次選擇10-4～10-7濃度的稀釋樣品，采用涂布平板法，在37℃厭氧條件下培養(yǎng)48 h～72 h，從MRS-CaCO3選擇培養(yǎng)基上挑出明顯溶鈣圈的單菌落，再經(jīng)過3次劃線分離直至菌落鏡檢無雜菌。純化后將革蘭氏陽性，過氧化氫酶陰性菌判斷為乳酸菌并進行編號，MRS斜面培養(yǎng)基于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 乳酸菌的產(chǎn)酸速度和產(chǎn)酸量測定

將分離菌株在MRS液態(tài)培養(yǎng)基中活化至109CFU/mL，以0.15%轉(zhuǎn)接MRS液體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)24 h，pH計測量pH值，空白培養(yǎng)基對照。產(chǎn)酸量參照GB/T 12456-2008《食品中總酸的測定》酸堿中和法測定。

昨天和今天一樣，今天和明天一樣，他一眼都能看到自己墳頭上一搖一擺的狗尾巴草，沒勁兒透頂。人生就應該這樣嗎？

1.2.3 抑菌活性檢測

采用牛津杯定量擴散法，以沙門氏菌、單增李斯特菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌為指示菌，在37℃培養(yǎng) 8 h～12 h，測量抑菌圈直徑[13]。

1.2.4 分子生物學鑒定

采用16S rDNA序列同源相似性分析做菌種鑒定，測序委托生工生物工程（上海）有限公司完成，測序引物設計如表1。

表1 測序引物序列設計Table 1 Sequence of the primer

1.2.5 發(fā)酵性能評價

1.2.5.1 不同菌株發(fā)酵劑制備及酸菜發(fā)酵工藝

MRS活化乳酸菌至對數(shù)生長期，4℃下6 000 r/min低溫離心10 min收集菌泥，加3倍體積保護劑（10%脫脂乳+6%海藻糖+1%麥芽糊精+1%甘油）[14-15]，-80℃下預凍2 h，用真空冷凍干燥機獲得凍干菌粉。

工藝：白菜整理→清洗→晾干→切分→入缸→注入鹽水→接種→密封→發(fā)酵→成品

鹽水濃度為2%，發(fā)酵劑接種量為白菜重量的0.2%；20℃～25℃密封發(fā)酵20 d。

1.2.5.2 酸菜感官評價

參照陳功、趙國忠等的標準[16-17]做相應調(diào)整，請10名同學擔任評價員，評價前統(tǒng)一培訓，按照表2感官評定標準打分，品評兩個樣品需間隔3 min以上，每個指標滿分10分，根據(jù)總分判斷優(yōu)劣。感官評價標準見表2。

表2 酸菜感官評價標準Table 2 Sensory evaluation standard table of fermented sauerkraut

1.2.5.3 發(fā)酵性能評價

酸菜中亞硝酸鹽測定采用鹽酸萘乙二胺法[18]。總酸的測定同1.2.2。酸菜中的還原糖測定參照GB 5009.7-2016《食品安全國家標準食品中還原糖的測定》。酸菜中的有機酸種類及含量測定參照GB 5009.157-2016《食品安全國家標準食品中有機酸的測定》。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

使用SPSS軟件21.0和OriginLab OriginPro 2017 SR2進行分析。所有數(shù)據(jù)均以平均值±標準偏差（standarddeviation，SD）表示。對總離子流圖中的各峰經(jīng)質(zhì)譜計算機數(shù)據(jù)系統(tǒng)檢索并對Nist2005和Wiley275標準質(zhì)譜圖進行核對，確定酸菜中揮發(fā)性風味成分，用峰面積歸一化法確定各成分的相對質(zhì)量分數(shù)。

2 結(jié)果與討論

2.1 乳酸菌的分離

從10份酸菜汁樣品中經(jīng)MRS-CaCO3選擇培養(yǎng)基3次劃線分離共得到73株菌株，再經(jīng)革蘭氏染色鏡檢和過氧化氫酶陰性試驗得到19株乳酸菌，分別編號為S1～S19，菌落形態(tài)描述見表3，部分菌株顯微鏡下形態(tài)見圖1。

表3 乳酸菌菌落形態(tài)及生物學鑒定Table 3 Colonial morphology of the isolated strains and authenticate

圖1 部分菌株在顯微鏡下的菌體形態(tài)Fig.1 Microbial morphology of some strains under microscope

2.2 各菌株產(chǎn)酸速度和產(chǎn)酸量

19株乳酸菌按0.15%接種24 h后的pH值變化如圖2。

由于酸的產(chǎn)生和乳酸菌的生長能力有關(guān)，乳酸菌菌株的生長速率與測定到的pH值降低呈正相關(guān)，所以比較菌株的生長速率以及產(chǎn)酸量可反應乳酸菌的發(fā)酵性能[19]。試驗數(shù)據(jù)表明，19株乳酸菌接種24 h后其培養(yǎng)液的pH值均顯著下降，pH值在4.5以下的菌株為 S3、S5、S7、S9、S11、S12、S14、S17、S18，其中 S7 和S9最低，均為4.02±0.01。各菌株的產(chǎn)酸量如圖3所示。

圖2 各菌株接種24 h的pH值變化Fig.2 pH changes of strains for 24 h

圖3 菌株接種24 h的產(chǎn)酸量Fig.3 Acid production of strains inoculated for 24 h

排在前五的菌株為 S3、S19、S7、S5、S4，產(chǎn)酸量分別達到1.87%、1.69%、1.54%、1.51%、1.49%。本文分離的乳酸菌產(chǎn)酸能力優(yōu)于很多報告，牛文靜等對分離自錦州腌漬小菜的28株耐鹽性乳酸菌的產(chǎn)酸能力進行分析，結(jié)果顯示pH值降低最顯著的為4.6，最高產(chǎn)酸量為1.03%[20]，賈志成從酸菜中分離培養(yǎng)的菌株最大產(chǎn)酸量為1.08%[21]。

2.3 分離菌株發(fā)酵液的抑菌活性

本文用牛津杯法檢測了19株乳酸菌分別對沙門氏菌、單增李斯特菌、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌圈，結(jié)果如表4。

除 S13、S15、S16 對沙門氏菌，S15、S16、S17 對單增李斯特菌沒產(chǎn)生抑菌圈，其余均表現(xiàn)不同程度抑菌作用，且抑菌圈大小與產(chǎn)酸能力成正相關(guān)。乳酸菌在發(fā)酵過程中通過產(chǎn)酸可抑制其他腐敗菌和致病菌的增殖，也有乳酸菌可以產(chǎn)生抗菌肽，是否存在產(chǎn)抑菌肽的菌株有待進一步篩選。

表4 分離菌株培養(yǎng)液的抑菌效果Table 4 Strains inhibition effect of indicator bacteria

2.4 16S rDNA菌株鑒定

綜合產(chǎn)酸能力和抑菌活性，本文篩選S3、S5、S11、S18、S19做16S rDNA鑒定，結(jié)果如表5。

S3、S5、S11、S18、S19 分別與植物乳桿菌（L.plantarum K25）、植物乳桿菌（L.plantarum KC28）、植物乳桿菌（L.plantarum X7021）、植物乳桿菌（L.plantarum K259）、植物乳桿菌（L.plantarum 7-5）同源性 100%。16S rDNA基因序列比對中，最低同源性為95%屬于同一個屬[22]，當同源性＞97%時，屬于同一個種[23]，無疑，這5株菌均為植物乳桿菌（L.plantarum）。天然發(fā)酵酸菜中后期植物乳桿菌是優(yōu)勢菌群，主導發(fā)酵過程[24]，所以不少學者在酸菜中分離出植物乳桿菌。趙山山等從傳統(tǒng)東北酸菜中分離出5株性能優(yōu)良的菌株，經(jīng)鑒定均為植物乳桿菌[25]。

2.5 發(fā)酵性能評價

2.5.1 酸菜成品感官評價

將分離鑒定的5株植物乳桿菌作為酸菜發(fā)酵劑，經(jīng)過20 d發(fā)酵，得到5份酸菜樣品，感官評價得分如表6。

表5 5株性能良好菌株的16S rDNA鑒定結(jié)果Table 5 Results of 16S rDNA identification

表6 酸菜樣品感官評分Table 6 Sensory evaluation scores of fermented sauerkraut samples

5份酸菜樣品均具有東北傳統(tǒng)發(fā)酵酸菜的柔和酸味和香氣，且口感爽脆，菜心嫩黃色，菜幫半透明有光澤，無腐爛。其中S3樣品的感官評分最高，且色澤、氣味和組織狀態(tài)評分都高于其他樣品，從感官評分認定為最優(yōu)菌株。

2.5.2 酸菜樣品中的亞硝酸鹽、總酸和還原糖含量

酸菜樣品中的亞硝酸鹽、總酸和還原糖含量見圖4。

圖4 酸菜樣品中的亞硝酸鹽、總酸和還原糖含量Fig.4 The nitrite content，titrate acid content and sugar content

亞硝酸鹽含量是評判酸菜質(zhì)量及其食用安全性的一個重要因素。我國國家標準規(guī)定腌制蔬菜中亞硝酸鹽（以NaNO2計）含量不能超過20 mg/kg，而綠色食品中不能超過4 mg/kg。本研究用篩選的乳酸菌發(fā)酵酸菜20d，5個樣品亞硝酸鹽含量為5.7mg/kg～10.2mg/kg，都符合國標。孟繁博等[26]研究3種商業(yè)乳酸菌（鼠李糖乳桿菌、嗜酸乳桿菌和發(fā)酵乳桿菌）按等量配比，3%接種量，在發(fā)酵第8天亞硝酸鹽降至6.05 mg/kg，雖然本文是20 d發(fā)酵，但也達到了理想的降亞硝酸鹽效果。乳酸菌對亞硝酸鹽的降解分為NiR降解和酸降解，pH值低于4.0后，亞硝酸鹽主要以酸降解為主，乳酸菌的產(chǎn)酸能力與降解亞硝酸鹽能力成正相關(guān)[27]。本文篩選的乳酸菌降解亞硝酸鹽能力應該歸功于于其產(chǎn)酸能力。酸味是酸菜的主體風味，可以給人爽口的感覺，并且具有開胃解膩、促進消化等功效，而總酸是表征酸菜酸味的理化指標，本文5種樣品的總酸含量分別為 （5.84±0.72）、（5.24±0.71）、（6.41±0.69）、（6.3±0.1）、（5.34±0.57）g/100 g。隨著發(fā)酵的進行，乳酸菌不斷利用還原糖產(chǎn)生乳酸等一系列代謝產(chǎn)物，蔬菜中的還原糖因消耗而含量不斷降低，可間接反應乳酸菌的發(fā)酵性能。沈昳瀟等比對了腌漬過程還原糖的變化情況，測得鮮白菜中還原糖含量為1.22%，腌制19 d時含量降至最低，此后不再能檢出[28]。馬歡歡等研究報道發(fā)酵從0 d～15 d還原糖含量較高，為乳酸菌大量繁殖提供了豐富的營養(yǎng)物，隨著乳酸菌數(shù)量增加，在發(fā)酵15 d～20 d，還原糖含量由1.93%下降到0.10%[8]。本文在腌制前測得白菜中還原糖含量為2.39%，腌制20 d后測得5種樣品中的還原糖含量分別為（0.54±0.3）%、（0.72±0.21）%、（0.53±0.17）%、（0.52±0.3）%、（0.68±0.62）%，結(jié)果與文獻報道基本一致。

2.5.3 有機酸測定結(jié)果

許多文獻報道，草酸、琥珀酸、檸檬酸、乳酸、醋酸是酸菜中的主要有機酸[29]。檸檬酸溫和且具有新鮮感；乳酸稍帶澀感、酸度較高；醋酸和草酸具有刺激性；而琥珀酸具有鮮味[30]。酸菜中的有機酸含量測定結(jié)果如表7所示。

表7 酸菜中的有機酸含量Table 7 Organic acids contents of sauerkraut

5個樣品中乳酸是主要有機酸，分別為（25.65±0.96）、（23.45±1.02）、（20.21±0.96）、（14.1±0.75）mg/g和（12.68±0.29）mg/g，乳酸在東北酸菜酸感形成中起主導作用。馬藝熒等[31]采用自然發(fā)酵法研究東北酸菜不同發(fā)酵時間有機酸變化及對產(chǎn)品酸感的影響，結(jié)果表明酸菜中的乳酸隨發(fā)酵時間而含量不斷增高，在發(fā)酵120 d時達到（15.25±0.11）mg/g。與傳統(tǒng)發(fā)酵相比，篩選的乳酸菌直投發(fā)酵20 d就達到相當?shù)娜樗岷浚蟠罂s短了發(fā)酵時間。S18和S19醋酸含量也較高，分別達到（24.73±1.3）mg/g和（17.52±0.86）mg/g，可能在發(fā)酵過程中污染了醋酸菌。蔬菜含有大量的草酸，能夠干擾鈣等礦物元素吸收，是典型的抗營養(yǎng)因子。馬藝熒等[31]研究報道，草酸在發(fā)酵過程中可從起初占有機酸比例的83.96%降至3.08%。本文結(jié)果在發(fā)酵20d后，草酸含量僅為（1.21±0.09）mg/g～（5.03±0.52）mg/g，占所測的5種有機酸總量在5%以下，直投發(fā)酵有效降解了白菜中的草酸。S3樣品中琥珀酸含量最高，為（9.38±0.86）mg/g，遠遠超過其他4個樣品[（1.08±0.46）、（0.82±0.06）、（0.71±0.05）mg/g 和（1.73±0.20）mg/g]，而琥珀酸可以提升酸菜的鮮味和愉悅的口感，這些有機酸含量及比例合適時對東北酸菜酸感柔和起到促進作用，反之會破壞酸感柔和。在感官評價中，S3樣品獲得最高評分，與其最佳的有機酸比例相關(guān)。

3 結(jié)論

東北傳統(tǒng)發(fā)酵酸菜是天然的乳酸菌資源庫，從中可以分離到性能優(yōu)良的乳酸菌菌株。本研究從傳統(tǒng)發(fā)酵酸菜中分離出73株乳酸菌，通過產(chǎn)酸能力、抑菌活性、降解亞硝酸鹽等篩選鑒定獲得5株發(fā)酵性能優(yōu)良的菌株，經(jīng)16S rDNA鑒定均為植物乳桿菌（L.plantarum），其中S3號菌株性能最優(yōu)。通過作為直投發(fā)酵劑發(fā)酵酸菜評價，篩選的乳酸菌可利用發(fā)酵基質(zhì)中還原糖作為能量快速增殖，降低發(fā)酵體系的pH值，有效降解酸菜中亞硝酸鹽和草酸含量，在20℃～25℃發(fā)酵20 d即可具備酸菜的美好風味，比傳統(tǒng)發(fā)酵時間大大縮短。菌株的遺傳穩(wěn)定性和其他耐受性能還需要進一步研究，為開發(fā)利用奠定理論基礎。