沉默STAT1對腸道病毒71型感染THP-1細胞的初步探討

李園園，史偉峰，江 濤，許德英

腸道病毒71型(enterovirus 71,EV71)是引起手足口病最主要的病原體之一，除引起手足口病外，還能導致嚴重的中樞神經系統(tǒng)并發(fā)癥，已居丙類傳染病的首位，且呈上升趨勢，死亡率高。我國研制的首批EV71疫苗已于2016年上市，為控制暴發(fā)和流行提供了有效手段[1]。然而，針對EV71的治療仍以對癥治療為主，目前尚無理想有效的抗病毒藥物。蛋白酪氨酸激酶和信號轉導與轉錄激活因子(janus kinase/signal transducers and activators of transcription,JAK/STAT)信號通路是機體固有免疫反應的必要條件，與病毒性疾病的發(fā)生密切相關[2-5]。已有報道，EV71感染人橫紋肌肉瘤細胞(rhabdomyosarcoma，RD)和THP-1細胞，JAK/STAT信號通路的反應不同[6]。本研究擬在分析EV71感染THP-1細胞后，STAT1、ISGs的表達及沉默STAT1對ISGs轉錄、EV71/VP1復制的影響，探討STAT1在EV71感染中的作用和相關機制，為EV71的治療尋找新的靶點提供依據?，F報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料人單核巨噬細胞(THP-1)和293T細胞由中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心提供。STAT1、p-STAT1(signalway antibody)；HRP標記的二抗(Santa Cruz公司)；GAPDH和相應HRP標記的二抗(ProteinTech公司)；β-action、Anti-Enterovirus 71 VP1 antibody和相應HRP標記的二抗(Abcam公司)； Trizol試劑(Invitrogen公司)，逆轉錄和實時熒光定量PCR試劑盒(TaKaRa公司)；ABI7500實時熒光定量PCR儀(美國ABI公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)THP-1細胞用含10%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基為基礎培養(yǎng)基，于37 ℃5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，THP-1細胞密度達到5×106時采用半定量換液或離心換液傳代培養(yǎng)，細胞密度不能超過1×107。293T細胞以含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基為基礎培養(yǎng)液，每2～3 d傳代1次，傳代時棄掉培養(yǎng)基，用0.25%胰酶消化細胞，于37 ℃5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取對數生長期的細胞進行試驗。

1.2.2 shRNA慢病毒的包裝、濃縮與病毒滴度測定293T細胞密度約70%～80%時采用磷酸鈣法包裝慢病毒，轉染前4 h對細胞進行換液，輔助質粒pSpAX2 3.2 μg 、PMD-2G 1.8 μg和包裝質粒shSTAT1 5 μg加入超純水至450 μL，混合均勻。將CaCl250 μL加入至含有質粒的離心管中。將質?！狢aCl2混合物加入至含有500 μL 2×HBS的離心管中，混勻后緩慢滴入培養(yǎng)皿中，轉染后16 h換液，48 h、72 h后收獲上清液，12 000 r·min-1離心5 min，用0.45 μm濾膜過濾，去掉細胞碎片沉渣。為了提高慢病毒的滴度，采用4 ℃超速離心機20 000 r·min-1離心90 min將慢病毒濃縮。采用流式細胞儀法測定病毒滴度，利用載體共表達的綠色熒光蛋白表達(GFP)在流式儀上進行分析，計算表達熒光細胞的比例。病毒滴度的計算公式為：TU/mL=細胞數(以鋪時計，1×105)×熒光表達比例×103/慢病毒的體積(μL)。按照使用量分裝至EP管中置于-80 ℃保存。

1.2.3 重組shRNA慢病毒轉染THP-1細胞接種處于生長對數期的THP-1細胞到12孔細胞培養(yǎng)板，每孔1 mL細胞密度為2×105·mL-1。設對照組和干擾組。根據細胞數量和制備的空載體病毒及干擾載體病毒滴度，以不同感染復數感染THP-1細胞，同時加入8 μg·mL-1的多聚凝胺(polybrene)，同時感染4個復孔。感染24 h后離心換液，將4個復孔的細胞至6孔板內，每孔加入1 mL RPMI1640+10%FBS培養(yǎng)基，置37 ℃5%CO2繼續(xù)培養(yǎng)。感染后72 h，提取總RNA和蛋白。

1.2.4 qRT-PCR采用TRizol法裂解細胞并提取總RNA。按照逆轉錄試劑盒(TaKaRa)說明書將RNA逆轉錄成cDNA，用于熒光定量PCR。相關引物序列見表1。獨立重復試驗3次，每次每個樣本每個基因作3個復孔，采用經典的2-ΔCt計算相對表達量，ΔCt =(Ct目的基因-Ct內參基因)實驗-(Ct目的基因-Ct內參基因)對照。

表1 引物序列

1.2.5 western blot收集對照組(0 h)和各實驗組2、4、8、12、16和24 h的細胞，0 h未感染EV71，實驗組EV71(MOI=5)感染細胞2、4、8、12、16和24 h，離心收集細胞，加入含PMSF的IP細胞裂解液，冰上裂解40 min，12 000 r·min-1，離心5 min，收集上清，采用BCA法測定總蛋白濃度。以每孔40 μg的蛋白量加樣至10% SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白質，再將膠中的蛋白通過電轉移槽轉印至PVDF膜上。經含5%脫脂奶粉的TBST緩沖液室溫封閉2 h，1∶1 000稀釋加入一抗，4 ℃孵育過夜。TBST振蕩洗膜后加入HRP標記的二抗，室溫孵育1 h。TBST洗膜后采用ECL發(fā)光液進行化學發(fā)光反應，暗室曝光，顯影。

2 結果

2.1 EV71激活IFN-β和ISGs的轉錄EV71(MOI=1和MOI=5)感染THP-1細胞后8 h、24 h，細胞內IFN-β mRNA的表達量均上調，與對照組(未感染EV71)相比,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(圖1A和圖1B)。與對照組(未感染EV71)相比，EV71感染8 h時，MXA、OAS1、ISG56這3種ISGs mRNA的相對表達量分別上調了約11.6、11.2和17.3倍，且這種上調具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；EV71感染24 h時，MXA、OAS1、ISG56這3種ISGs的表達量與8 h相比分別下降了4.4、4.6和9倍，具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，而當EV71以MOI=5感染細胞8 h時，ISG15的表達量明顯上調(P<0.05)(圖1C和圖1D)。

圖1 EV71激活IFN-β和ISGs的轉錄

2.2 EV71感染促進STAT1的磷酸化EV71(MOI=5)感染 THP-1細胞，隨著病毒感染時間的延長(2、4、8、12、16和24 h)，STAT1和p-STAT1的表達量呈依次增加趨勢，具有時間依賴性，與未感染EV71組相比，STAT1和p-STAT1的蛋白水平均明顯提高，見圖2。

2.3 特異性靶向STAT1的shRNA對THP-1細胞中STAT1蛋白表達的抑制作用采用特異性靶向STAT1的shRNA包裝慢病毒，感染THP-1細胞，48 h后，提取細胞總蛋白，Western blot印跡檢測STAT1蛋白水平。結果顯示：與對照組相比， shSTAT1-256能顯著抑制STAT1蛋白表達水平，見圖3。因此選取shSTAT1-256用于后續(xù)實驗。

2.4 沉默STAT1基因對ISGs及EV71/VP1表達的影響慢病毒感染THP-1細胞并加入8 μg·mL-1的polybrene，增加干擾效率，得到THP-1-shRNA-STAT1和THP-1-shRNA-CON077細胞系，72 h后，Western blot結果顯示：與對照組相比，shRNA-STAT1感染的THP-1細胞組STAT1蛋白水平明顯降低(圖4A)。慢病毒shRNA-STAT1感染的THP-1細胞，經EV71感染24 h時，與對照組相比，STAT1、p-STAT1和VP1的蛋白表達量下降(圖4B)，MXA、OAS1、ISG56的mRNA表達量均下調(P<0.05)，VP1mRNA的表達量也下調(圖4C)。

圖2 EV71感染激活了STAT1的磷酸化

圖3 2種shRNA對STAT1蛋白干擾效率的影響

A:shRNA-STAT1感染后；B:經EV71感染24 h后；C:EV71感染24 h后mRNA表達。圖4 沉默STAT1基因對ISGs及EV71/VP1表達的影響

3 討論

手足口病感染具有全球性，我國每年均有發(fā)生，發(fā)病率約為37.01/10萬～205.06/10萬，死亡率約為6.46/10萬～51.00/10萬，嚴重危害兒童健康，但是其致病機制仍在進一步研究。在病原微生物感染早期，固有免疫反應通過識別人類清道夫受體和P-選擇素糖蛋白配體-1等，激活一系列信號通路，對病毒的抑制和清除發(fā)揮重要作用[8]。

STAT1是STAT家族中最早發(fā)現的成員，具有廣泛的生物學作用，抑制腫瘤生長、促進腫瘤細胞的凋亡、參與固有免疫反應等。病毒感染機體時，促進STAT1的活化發(fā)揮抗病毒作用，已有報道新城疫病毒的V蛋白、埃博拉病毒的VP24蛋白作用于STAT1磷酸化修飾在干擾素信號通路中發(fā)揮作用[9]，而STAT1乙酰化、泛素化、甲基化等不同修飾影響干擾素抑制乙肝病毒復制的作用[10]。研究發(fā)現戊型肝炎病毒(hepatitis E virus，HEV)的氨基末端區(qū)域可以抑制STAT1的轉錄和磷酸化調控干擾素反應[11]，而有體外實驗表明，STAT1缺乏時細胞不能應答IFN-α和IFN-β的刺激，對病原微生物極其敏感。THP-1細胞是人體的單核巨噬細胞，具有免疫效應，在STAT-1缺乏的THP-1內，對EV71感染的機制還不明確，本研究采用慢病毒介導的shRNA干擾技術，沉默THP-1細胞的STAT1，探討EV71感染沉默STAT1的THP-1細胞，干擾素刺激基因的變化及對病毒復制的影響。

采用EV71(MOI=1和MOI=5)感染THP-1細胞，PCR結果(圖1)顯示ISGs和IFN-β的表達量上調，Western blot結果(圖2)表明STAT1和STAT1磷酸化水平上調，這些結果提示EV71促使THP-1細胞內STAT1入核，激活ISGs和IFN-β的表達，與報道的EV71感染的vero細胞內IFN-β產生被抑制不同，不同的細胞對EV71感染反應不同[2]。由于THP-1細胞是懸浮細胞，傳統(tǒng)的RNAi技術干擾效率低，因此本研究設計shRNA-STAT1，磷酸鈣法包裝慢病毒，經超速離心法濃縮后，流式細胞儀測定慢病毒滴度。慢病毒感染THP-1細胞24 h后，與對照組相比，STAT1表達下調(圖3A)。EV71感染24 h后，STAT1、p-STAT1、VP1和ISGs mRNA表達量下降(圖3B、圖3C)。本研究表明干擾THP-1細胞內STAT1， EV71感染抑制STAT1的入核、轉錄，且STAT1缺乏使EV71復制降低，這與已報道的STAT1缺乏，對EV71的易感性增加不同[12]，猜測原因可能為THP-1細胞是免疫細胞有關，也有可能其他分子、信號通路參與其中，此信號通路并不是抑制EV71感染的最有效通路。研究表明AKT/IRF3信號通路產生的Ⅰ型干擾素及抗病毒基因成為水性口炎病毒、新城疫病毒和單純皰疹病毒等病毒性疾病的潛在治療角色[3]，許多信號通路被報道參與抑制EV71的復制如：RLR信號通路中USP4蛋白的泛素化[13]、p38MA PK信號通路[14]、NF-KB信號通路[15]、TOLL樣受體3等[16]。而JAK/STAT信號通路在EV71感染中的具體詳細分子機制、信號通路有待進一步研究。

EV71病毒基因的變異性使手足口病的防控形勢更加嚴峻，應用RNAi技術阻斷STAT1入核，有望為EV71的治療提供新的途徑。