花椒油樹脂加速貯藏期間麻味物質組成及麻感變化

方正，高海燕，趙鐳，史波林，汪厚銀，張璐璐，劉龍云，鐘葵*

(1.上海大學 生命科學學院，上海 200444；2.中國標準化研究院食品與農(nóng)業(yè)標準化研究所，北京 102200)

花椒(ZanthoxylumbungeanumMaxim.)系蕓香科花椒屬植物，其枝、干、葉均有食用和藥用功效，其中花椒果皮是我國特色香辛料，被譽為“八大調味品之一”，以其獨特的椒麻風味深受人們喜愛[1]。目前紅花椒的主要產(chǎn)地為陜西韓城、山東泰安、四川漢源、茂汶和會陽、甘肅武都、河北涉縣等[2]。

花椒油樹脂是指采用適當溶劑從天然花椒中萃取、具有花椒全部風味特征的油狀制品，既包含了揮發(fā)性花椒精油，又包含了不易揮發(fā)的麻味呈味成分?；ń酚蜆渲ǔ１豢醋魇菓煤脱芯炕ń凤L味成分的優(yōu)質原料[3]，對現(xiàn)代餐飲和食品工業(yè)中方便而高效利用花椒中麻味有效成分具有重要意義[4]。目前，最常見的花椒油樹脂萃取技術是超臨界CO2技術，萃取過程無毒無害，克服了有機溶劑提取弊端的同時最大限度保留了花椒原有的風味成分[5]。

酰胺類物質是花椒中主要麻味呈味的來源，是評價花椒內在麻味品質的主要指標[6]。此外，麻感強弱、感官屬性描述與酰胺類物質的種類及含量有一定相關性，不同產(chǎn)地花椒的麻味物質含量及麻感強度和特征均有較大的差異[7]。有研究表明花椒麻味特征非常不穩(wěn)定，室溫下貯藏1年后其香氣和麻度有明顯降低，麻味品質劣化較為顯著[8]。目前，關于花椒及其制品中麻味物質成分和麻感貯藏期內變化的系統(tǒng)研究較少，研究手段和內容均較為單一，有待進一步完善。本文以花椒油樹脂為研究對象，采用HPLC-MS在分析麻味物質總含量基礎上，對麻味物質的組成及加速貯藏期間的動態(tài)變化進行跟蹤觀測。在此基礎上，采用線性標度法和斯科維爾指數(shù)法分析貯藏前后麻度和麻感屬性的變化，旨在為花椒及其制品貯藏期麻味物質及麻感變化研究提供基礎參考數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

3個不同產(chǎn)地花椒油樹脂樣品由韓城市宏達花椒香料有限公司提供，當季采收花椒樣品后采用超臨界CO2工藝加工制成。其中，PO-GW由甘肅武都產(chǎn)區(qū)紅花椒制成，PO -SY由四川漢源產(chǎn)區(qū)紅花椒制成，PO -SH由陜西韓城產(chǎn)區(qū)紅花椒制成。

羥基-β-山椒素標準品：成都麥德生科技有限公司，純度≥98.0%；無水乙醇：分析純，河南榮騰食品添加劑有限公司；甲醇：色譜純，F(xiàn)isher實驗器材(上海)有限公司；食用酒精：體積分數(shù)為95%，食品級；純凈水：符合GB 17323-1998對飲用純凈水的要求；色譜測試中應用水為超純水。

1.2 主要儀器設備

PL2002型天平 瑞士梅特勒-托利多儀器(中國)有限公司；恒溫恒濕箱系統(tǒng) 巨孚儀器有限公司；SC-3610低速離心機 安徽中科中佳科學儀器有限公司；TSQ Quantum液質聯(lián)用儀 賽默飛世爾科技有限公司；ZORBAX 300 SB-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm×5 μm) 安捷倫科技有限公司。

1.3 樣品加速貯藏期設置

3種不同花椒油樹脂樣品混合均勻后進行分裝，每瓶10 g樣品，采用密封棕色玻璃瓶分裝(基本填滿容器)、加蓋密封后，置于恒溫(37 ℃)恒濕(20%)箱中避光貯藏，每隔30 d取出1瓶進行麻味物質及麻感測定，檢測后樣品棄用。樣品貯藏期設置為4個月，每個時間點設置2個重復。

1.4 麻味物質測定

1.4.1 麻味物質樣品制備

稱取1 g花椒油樹脂樣品(精確到0.01 g)置于100 mL棕色具塞錐形瓶中，加入75 mL乙醇振蕩搖勻，加蓋密封于20 ℃恒溫超聲(頻率40 kHz)提取20 min。將混合溶液全部轉移至離心管中，2000 r/min轉速下離心5 min，收集至100 mL棕色容量瓶中。沉淀用少量乙醇洗滌、渦旋1 min，在2000 r/min轉速下離心5 min，將清液轉移至容量瓶中。重復洗滌沉淀1次，將上清液移入容量瓶中，用乙醇定容，得到麻味物質提取母液。精確稱取100 μL麻味物質提取液，用甲醇稀釋定容于10 mL后用0.45 μm有機系微孔濾膜過濾，轉移至液相進樣小瓶中，即液相供試樣溶液。每個樣品3個平行樣。

1.4.2 HPLC-MS分析條件

色譜條件：ZORBAX 300 SB-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm×5 μm)；流動相為甲醇-水溶液，洗脫梯度見表1，檢測波長268 nm，柱溫30 ℃，流速1.3 mL/min，測試時間56 min，進樣量5 μL。每個樣品測定3次。

表1 流動相洗脫梯度Table 1 Gradient elution of mobile phase

離子源：電噴霧電離源(ESI)；測定模式：全掃描模式，掃描質量范圍：50～600 amu；噴霧電壓：3300 V；氣化溫度：300 ℃；鞘氣(氮氣)壓力：50 psi；輔助氣(氬氣)壓力：20 bar；毛細管溫度：325 ℃。

定性分析：參考文獻[9]的方法，通過對樣品總離子流圖、提取離子流圖及分子量在50～600 amu之間的離子二級碎片信息進行分析，確定其化合物分子量，計算化合物組成等，并結合文獻進一步推斷，對色譜峰進行定性。

定量分析：參考文獻[10]的方法，精確稱取羥基-β-山椒素標準品，用甲醇溶解后配制成不同濃度的標準溶液，進行HPLC檢測。以色譜峰面積為縱坐標，標品濃度為橫坐標，繪制標準曲線。本研究中，采用高、低濃度兩條羥基-β-山椒素標準曲線來使定量結果更可靠。貯藏期間，每次樣品測定前重新配制標品溶液和標曲繪制。

1.5 麻感感官評價

1.5.1 感官評價小組的建立

剔除對麻味食品有強烈嗜好性及排斥感的評價員，根據(jù)GB/T 16291.1-2012《感官分析選拔、培訓與管理評價員一般導則第1部分：優(yōu)選評價員》進行評價員的篩選和培訓，篩選出6～8名評價員組成感官評價小組，使其對麻感具有較高分辨力，達到能開展差異評價的評價員基本要求。

1.5.2 供試樣品的制備

稱取貯藏花椒油樹脂1 g(精確到0.01 g)，用食用酒精溶解配制成10 mg/mL母液，再用純凈水稀釋至0.30 mg/mL制成待試液，備用。

1.5.3 麻度的評價

1.5.3.1 線性標度法[11-13]

采用實驗室前期建立的花椒麻度感官評價的15 cm標記線性標度[14,15]。首先，由經(jīng)驗豐富的感官分析師統(tǒng)一評價小組感覺測量范圍，建立3點麻感標度及其標度值：3 cm-微麻、7.5 cm-麻、10 cm-很麻，并配制對應麻感標度值的麻感參比樣液。開展感官評價員的麻感評價培訓，直至其能熟練掌握標尺濃度所對應的麻感強度，即可開始對樣品麻度進行評價。評價員正式評價前先漱口清潔口腔，供試溶液入口后含15 s，待其充分浸潤口腔后吐出，閉口等待麻感強度達到最大值時于回答表中15 cm標度尺上進行標記。評價完一個樣品后用純凈水漱口、吃蘇打餅干并休息，直至口腔麻感完全消退后再進行下一次評價，每個評價員重復評價3次。

1.5.3.2 麻感屬性強度

結合文獻研究以及感官分析師和感官評價小組的多次試驗與討論[16-18]，篩選并確定出花椒的6個麻感分屬性描述詞：針刺感、振動感、灼熱感、澀感、木感和垂涎感。訓練考察評價員直至熟練掌握分屬性感覺及其強度后開始正式評價。屬性釋義參考實驗室前期研究，建立分屬性強度值及對應描述，見表2。

表2 麻感屬性強度值及描述Table 2 Attributes and description of pungency sensation

1.5.3.3 斯科維爾指數(shù)法[19，20]

采用斯科維爾指數(shù)(SPU)法，將麻味物質提取母液按照一定比例逐級稀釋，被評價員恰好識別出有麻感時的最低濃度樣品稀釋液，再根據(jù)稀釋倍數(shù)再轉化為SPU值得到麻度的不同等級。每個評價員重復評價3次。

1.6 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)采用 Excel 2010 和 Origin 2017 進行分析。

2 結果與討論

2.1 花椒油樹脂樣品中麻味物質含量分析

采用HPLC-MS對3個不同產(chǎn)地的花椒油樹脂各色譜峰進行定性定量分析?；ń酚蜆渲瑯悠稨PLC見圖1，定性方法參考實驗室前期研究基礎，通過樣品總離子流圖、離子二級碎片信息(分子量在500～600之間)進行分析，根據(jù)最大吸收峰和質荷比，結合文獻[21,22]確定主要麻味物質種類。進一步分析所得麻味物質的峰面積，采用標準曲線換算出各物質的羥基-β-山椒素當量，對各麻味物質相對含量進行定量分析，結果見表3。

圖1 不同產(chǎn)地花椒油樹脂樣品的HPLC圖Fig.1 The UPLC chromatograms of pepper oleoresin samples in different producing areas

表3 不同產(chǎn)地花椒油樹脂樣品中麻味物質組成及含量Table 3 Composition and content of pungent components of pepper oleoresin samples in different producing areas mg/g

由圖1和表3可知，花椒油樹脂中麻味物質屬于酰胺類物質，3個不同產(chǎn)地的花椒油樹脂具有相似的HPLC圖譜，麻味物質種類組成差異較小。定性結果表明，3個樣品共確定出11種麻味酰胺類物質，其中共有物質為9種，分別為：羥基-山椒素(α-、β-、γ-和ε-)、羥基-γ-異山椒素、花椒素、異花椒素、γ-山椒素和四氫花椒素。此外，PO -GW還含有二氫花椒素和異二氫花椒素2種物質，而PO -SH樣品不含有二氫花椒素，PO -SY樣品中未檢出異二氫花椒素。

樣品定量結果表明，3個花椒油樹脂樣品麻味物質含量上有顯著差異。來自于四川漢源的PO-SY樣品中總麻味物質含量最高，為501.5 mg/g；其次是甘肅武都的PO-GW樣品，為465.0 mg/g；含量最低的是陜西韓城的PO-SH樣品，為389.0 mg/g。11種麻味酰胺類物質中，羥基-山椒素(α-、β-、γ-和ε-)是含量最高的重要麻味物質，4種物質之和分別占3個樣品中總麻味物質含量的97.07%、95.06%和98.34%。但不同樣品中4種羥基-山椒素組成含量存在差異。PO-SY樣品呈現(xiàn)低羥基-α-山椒素(68.41%)、高羥基-γ-山椒素(18.49%)和低羥基-ε-山椒素(1.52%)的特點。PO-GW和PO-SH樣品均呈現(xiàn)高羥基-α-山椒素(高于76%)的特點，同時PO-SH樣品表現(xiàn)出高羥基-β-山椒素(15.57%)、高羥基-ε-山椒素(4.86%)和低羥基-γ-山椒素(1.69%)的特點。有研究通過對多個產(chǎn)地的花椒樣品麻味物質構成特征進行分析[23]，通過計算比較相對峰面積的相對標準偏差(RSD)，得到不同產(chǎn)地紅花椒之間化學成分含量有一定差異的結論。余曉琴等[24]在研究中發(fā)現(xiàn)，羥基-γ-山椒素的含量可作為區(qū)分紅花椒與青花椒的特征物質。此外，在含量較低的其他麻味物質組分中，3個花椒油樹脂樣品中含量差異較大，PO-SY樣品中花椒素和γ-山椒素含量顯著高于其余2個樣品，與文獻[20]中四川漢源花椒中特征麻味物質結果一致。

2.2 加速貯藏期間花椒油樹脂樣品麻味物質含量測定

酰胺類麻味物質本身不穩(wěn)定，容易發(fā)生一系列異構化、水解以及氧化反應，貯藏期間會發(fā)生麻味物質含量降低的現(xiàn)象，從而影響最終產(chǎn)品的品質[25]。因此，麻味物質含量，包括不同麻味物質組分含量的變化是反映花椒及其制品貯藏性及衡量貯藏效果的重要指標[26]。研究表明影響麻味物質含量穩(wěn)定性的因素很多，時間和溫度是最主要因素，其次還包括光照、氧氣等相關因素。通常，市售的花椒油樹脂產(chǎn)品通常是避光、密封保存，存放溫度為常溫或冷藏，一定程度上能減緩麻味物質損失。為了更好觀察溫度和時間對麻味物質的影響，本研究采用加速實驗(37 ℃)來觀察3種花椒油樹脂樣品的麻味物質含量隨時間的變化，見圖2。

圖2 37 ℃加速貯藏期間3個花椒油樹脂樣品中麻味物質含量變化Fig.2 The changes in the content of pungent components in three pepper oleoresin samples during accelerated storage at 37 ℃

120 d加速貯藏期間，3個樣品中麻味物質總含量發(fā)生了不同程度降低。PO-SY樣品貯藏30 d時總麻味物質含量沒有顯著變化(p>0.05)，但60 d時總含量顯著降低(p<0.05)，之后隨貯藏時間延長進一步下降，貯藏120 d時下降了約15%；其次是PO-SH樣品，90 d貯藏期間含量雖有輕微降低但并未達到顯著水平(p>0.05)，但120 d時總麻味物質含量顯著降低(約10%)。PO-GW樣品在120 d貯藏期間總麻味物質含量雖輕微降低但未達到顯著水平(p>0.05)。

由圖3可知，3個樣品的4種主要麻味物質含量在貯藏過程中，總麻味物質含量降低表明貯藏過程中花椒油樹脂中的麻味物質有損失，但不同麻味物質組分在整個貯藏期間呈現(xiàn)不同的變化趨勢。對4種主要的麻味物質——羥基-山椒素物質(α-、β-、γ-和ε-)在貯藏期間含量的動態(tài)變化進行了分析。羥基-α-山椒素是含量最高(高于總麻味物質含量的2/3)的麻味物質組分，貯藏120 d期間，PO-GW樣品中羥基-α-山椒素含量沒有顯著變化(95.04%)，而PO-SY和PO-SH樣品分別降低了約12%和16%(p<0.05)。PO-SY樣品的羥基-β-山椒素含量在貯藏期間沒有顯著變化(p>0.05)，但PO-GW和PO-SH樣品中的含量分別顯著增加了約13%和8%(p<0.05)。羥基-ε-山椒素在總麻味物質中比例較小，120 d貯藏期間，整體含量變化不顯著(p>0.05)。羥基-γ-山椒素是PO-SY樣品中含量最高的，也是PO-SY樣品中典型的麻味物質之一，120 d貯藏期間其含量顯著降低，在3個樣品中分別降為原含量的80.01%、68.61%和67.93%(p<0.05)。

圖3 4種主要麻味物質含量變化趨勢Fig.3 Change trend in the content of four main pungent components

研究表明羥基-山椒素(α-、β-和ε-)三者的相對分子量均為263，互為同分異構體[27]，在某些調節(jié)下可能會相互轉化。因此，推測貯藏期間3個樣品總麻味物質含量降低和單一麻味組分或增或減的變化與3種同分異構體之間可能發(fā)生的轉化有關。麻味物質的損失和麻味感官貢獻不同的單體之間的相互轉化，最終造成貯藏期內花椒油樹脂的麻味感官品質的變化。

2.3 花椒油樹脂樣品中麻感的感官分析

圖4 花椒油樹脂樣品貯藏期間麻感最大強度測定Fig.4 Detection of the maximum pungent intensity of pepper oleoresin samples during storage

表4 花椒油樹脂樣品貯藏期間麻感強度測定(SPU)Table 4 Detection of pungent intensity of pepper oleoresin samples during storage(SPU)

應用線性標度法和斯科維爾指數(shù)法對3個花椒油樹脂樣品的初始樣的最大麻感強度值及SPU值進行了分析，見圖4和表4。PO-GW和PO-SY樣品的最大麻感強度值較為接近，而PO-SH樣品則比較低，分別為PO-SY(10.4±0.46)、PO-GW(9.53±0.51)、PO-SH(7.87±0.48)，與麻味物質含量成一定正相關，SPU值也呈現(xiàn)類似結果。圖5a列出了花椒油樣品的6種麻感屬性強度值，可知PO-SY樣品振動感、垂涎感較為突出，PO-GW樣品澀感最明顯，PO-SH樣品除木感較強外，其余屬性均中等。結合麻味物質含量的高低及組成差異，表明不同產(chǎn)地來源樣品的麻感感官屬性也呈現(xiàn)出差異。

2.4 加速貯藏期間花椒油樹脂樣品麻感的感官分析

貯藏120 d期間3個花椒油樹脂樣品最大麻感強度的變化見圖4。由圖4可知，隨貯藏時間延長，樣品最大麻感強度均呈現(xiàn)下降趨勢，90 d呈現(xiàn)顯著性變化，貯藏120 d后最大麻感強度分別為PO-SY(8.88±0.18)、PO-GW(8.25±0.35)和PO-SH(7.33±0.14)。SPU值結果見表4，120 d后均顯著下降，與線性標度法結果變化趨勢一致。由圖5b可知，6種麻感屬性中，垂涎感、振動感和灼熱感減弱程度較大。有研究表明[28]，不同的麻味酰胺類物質單體具有不同的特征麻感屬性體現(xiàn)，含量高低與貯藏期間的含量變化導致了麻感感官屬性的差異與變化。

圖5 花椒油樹脂樣品貯藏期間麻感分屬性強度測定Fig.5 Detection of pungent subattribute intensity of pepper oleoresin samples during storage

注：a為貯藏0 d；b為貯藏120 d。

3 結論

本研究采用HPLC-MS、感官分析等技術，對3個不同產(chǎn)地花椒油樹脂樣品在加速貯藏期間麻味物質組成、含量和麻感的感官分析進行了測定，具體結果如下：

不同產(chǎn)地花椒油樹脂中麻味物質共有成分有9種，包括4種羥基-山椒素(α-、β-、γ-和ε-)和5種酰胺類物質(羥基-γ-異山椒素、花椒素、異花椒素、γ-山椒素、四氫花椒素)，其中4種羥基-山椒素含量占總麻味物質含量的95%以上。3個不同來源花椒油樹脂樣品總麻味物質含量及4種羥基-山椒素組成具有顯著差異(p<0.05)，其中，PO-SY麻味物質含量最高。

120 d貯藏期間，PO-GW總麻味物質含量沒有顯著變化，但PO-SY和PO-SH樣品中總麻味物質含量顯著下降(p<0.05)，其中PO-SY下降最多。3個樣品中麻味物質變化趨勢呈現(xiàn)共性，表明存在一定規(guī)律。不同羥基-山椒素成分呈現(xiàn)不同的變化趨勢，整體上羥基-山椒素(α-、γ-)含量呈下降趨勢，羥基-β-山椒素含量呈上升趨勢，羥基-ε-山椒素含量沒有顯著變化，表明貯藏期間麻味物質成分存在相互轉化。

3個花椒油樹脂樣品的最大麻感強度和SPU值均存在顯著差異，其中PO-SY樣品的最大麻感強度值最高。PO-SY樣品振動感、垂涎感較為突出，PO-SH樣品木感較強，而PO-GW樣品澀感較為明顯。120 d貯藏期間，樣品的最大麻感強度和SPU值均有不同程度降低，麻感的感官屬性中垂涎感、振動感和灼熱感減弱程度較大。推測樣品的麻感強度及感官屬性不僅與麻味物質總含量相關，同時與麻感貢獻不同的單一組分麻味物質含量也具有一定的相關性。后期將進一步開展麻味物質組成及含量與麻感強度及感官屬性強度的相關分析。相關研究結果可為花椒及其制品的品質控制提供科學依據(jù)。