食品中的致病微生物沙門氏菌的商業(yè)化檢測(cè)技術(shù)

□ 賀麗麗 拜發(fā)分析系統(tǒng)銷售（北京）有限公司

沙門氏菌是食品中常見的致病菌，也是引起食物中毒的重要病原菌之一，其會(huì)嚴(yán)重危害人們的食品安全與身體健康。據(jù)統(tǒng)計(jì)，在全球記載的細(xì)菌性食物中毒事件中，因沙門氏菌而引起的食物中毒常列榜首。

沙門氏菌疾病是公共衛(wèi)生學(xué)上具有重要意義的人畜共患病之一，其病原菌——沙門氏菌屬腸道細(xì)菌科，包含多種能引起食物中毒及導(dǎo)致胃腸炎、傷寒和副傷寒的細(xì)菌。沙門氏菌在糞便、土壤、食品和水中可存活5個(gè)月至2年之久，除可感染人體外，其還可感染哺乳類、鳥類、爬行類、魚類、兩棲類及昆蟲等動(dòng)物。人/畜感染沙門氏菌后可呈現(xiàn)無癥狀帶菌狀態(tài)，也可表現(xiàn)為有臨床癥狀的致死疾病——加重病態(tài)或提高死亡率，亦或降低動(dòng)物的繁殖能力。

家禽、蛋類和肉類產(chǎn)品是沙門氏菌的主要傳播媒介，而受感染程度主要取決于沙門氏菌的血清類型和食用者的身體狀況，因此，小孩、老年人及免疫缺陷的個(gè)體是較容易受到該菌威脅的群體。根據(jù)國際慣例，要求對(duì)易受沙門氏菌污染的食品進(jìn)行檢測(cè)，并分類管理，以保證消費(fèi)者接觸到的食物不含沙門氏菌，從而有效預(yù)防疾病。我國《食品安全法》規(guī)定，食品中沙門氏菌的限量標(biāo)準(zhǔn)為0，并要求食品在進(jìn)入市場之前一定要檢測(cè)是否含有沙門氏菌。然而，傳統(tǒng)的細(xì)菌學(xué)檢測(cè)方法繁瑣耗時(shí)，不能滿足如今食品安全檢測(cè)快速發(fā)展的需求。本文介紹了德國拜發(fā)集團(tuán)（以下簡稱“拜發(fā)”）在食品中沙門氏菌檢測(cè)方面研發(fā)的3種檢測(cè)方法，以期為相關(guān)人員進(jìn)行日常檢測(cè)提供參考。

1 實(shí)時(shí)熒光PCR方法（RT-PCR）

1.1 應(yīng)用原理

RT-PCR（Real time-PCR）是在傳統(tǒng)PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)的積累實(shí)時(shí)檢測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過軟件分析其積累的熒光信號(hào)，進(jìn)而對(duì)需要檢測(cè)的基因序列進(jìn)行定性或定量分析。

拜發(fā)研制的用于沙門氏菌檢測(cè)的熒光定量檢測(cè)試劑盒SureFast?Salmonella ONE可進(jìn)行100次擴(kuò)增。該試劑盒包括樣品提取和擴(kuò)增兩部分，用戶只需對(duì)所要檢測(cè)的樣品進(jìn)行約20小時(shí)的簡單預(yù)增菌，然后全部使用試劑盒所提供的耗材及試劑進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，最終只需不到2小時(shí)便可得到準(zhǔn)確的定性結(jié)果。

1.2 具體操作流程

實(shí)時(shí)熒光PCR方法（RT-PCR）的樣品提取及檢測(cè)流程如下：

①根據(jù)《說明書》的指示，取500μL預(yù)培養(yǎng)的培養(yǎng)液，加入500μL裂解液，95℃孵育10分鐘后放置于常溫環(huán)境中1分鐘。然后，將其清液作為樣品液進(jìn)行擴(kuò)增。

②進(jìn)行擴(kuò)增緩沖液的配置，加入樣品后放入RT-PCR儀器中進(jìn)行擴(kuò)增，約1小時(shí)就可根據(jù)軟件中的信號(hào)收集分析樣品結(jié)果。該試劑盒的結(jié)果包括陽性質(zhì)控、陰性質(zhì)控、過程質(zhì)控及內(nèi)部抑制質(zhì)控（IAC）等。

1.3 檢測(cè)優(yōu)勢(shì)

由于PCR具有高靈敏性，易因污染或特異性差等原因產(chǎn)生假陽性結(jié)果，而通過陽性質(zhì)控、陰性質(zhì)控、過程質(zhì)控的結(jié)果，檢測(cè)人員可以快速判定試劑盒是否有效，是否出現(xiàn)假陽性結(jié)果。但是，如因樣品自身或環(huán)境中存在抑制劑等情況而造成所有的結(jié)果均為陰性，又應(yīng)如何判定該陰性結(jié)果是因?yàn)樵噭┦В€是環(huán)境因素，亦或樣品因素，從而出現(xiàn)假陰性的判定結(jié)果呢？常見的沙門氏菌抑制劑有EDTA、血紅蛋白、鐵乳蛋白、肝素、膽鹽、蛋白酶類、膽紅素、腐植酸、富里酸等，它們?cè)谘?、糞便、食品和環(huán)境中都會(huì)出現(xiàn)，從而導(dǎo)致整個(gè)實(shí)驗(yàn)失敗。

在熒光定量檢測(cè)試劑盒SureFast? Salmonella ONE 中， 根據(jù)ISO 22174:2005的要求，拜發(fā)在進(jìn)行每個(gè)樣品擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)的同時(shí)，還會(huì)要求用戶做內(nèi)部抑制質(zhì)控（試劑盒內(nèi)包含所用到的全部試劑）。這樣，在判定樣品是否為陰性時(shí)，實(shí)驗(yàn)條件為內(nèi)部抑制質(zhì)控陽性、陰性樣品，過程質(zhì)控陰性、陽性質(zhì)控陽性，只有這4個(gè)條件同時(shí)達(dá)到才能認(rèn)為所檢測(cè)的樣本為陰性。

為了驗(yàn)證熒光定量檢測(cè)試劑盒SureFast? Salmonella ONE 的 準(zhǔn) 確性、靈敏度及穩(wěn)定性等相關(guān)參數(shù)，拜發(fā)團(tuán)隊(duì)使其參與了AOAC-RI及MicroVal（ISO 16140-2）的驗(yàn)證工作，并順利通過。該試劑盒使用過程非常簡單，不需要專業(yè)的微生物檢測(cè)人員進(jìn)行操作，其檢測(cè)目標(biāo)物為沙門氏菌的目標(biāo)DNA，檢測(cè)結(jié)果真實(shí)可信，不需要再次進(jìn)行確證實(shí)驗(yàn)。同其它的沙門氏菌檢測(cè)方法及成熟的商業(yè)化檢測(cè)試劑相比，該方法是較快的確證方法，可以指導(dǎo)工廠篩選原料、清理環(huán)境、降低庫存壓力，從而減少對(duì)專業(yè)技術(shù)人員的依賴，節(jié)省勞動(dòng)力。在沙門氏菌的檢測(cè)中，其不失為一種適用于大型工廠指導(dǎo)生產(chǎn)的有效工具。

2 酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)（ELISA）

2.1 應(yīng)用原理

RIDASCREEN? Salmonella 沙門氏菌檢測(cè)試劑盒R4201可用于經(jīng)隔夜預(yù)增菌后的樣品中運(yùn)動(dòng)性和非運(yùn)動(dòng)性沙門氏菌（包括S.pullorum和S.gallinarum）的檢測(cè)。該檢測(cè)中使用“一步預(yù)增菌法”用以復(fù)蘇和活化受損的沙門氏菌，并令其繼續(xù)繁殖——微孔板上包被的特異性純化沙門氏菌抗體可選擇性地捕獲樣品中的沙門氏菌；被捕獲的沙門氏菌將在添加了試劑盒中所含的增菌培養(yǎng)基微孔板內(nèi)繼續(xù)繁殖；隨后，將孔內(nèi)的增菌培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移到新的微孔中，通過在原微孔板中加入沙門氏菌抗體酶結(jié)合物使夾心酶聯(lián)反應(yīng)法得以繼續(xù)；沒有結(jié)合的酶結(jié)合物被洗去，再向孔內(nèi)加入色原/顯色劑，在酶的作用下將其轉(zhuǎn)化為藍(lán)色產(chǎn)物；加入反應(yīng)終止液，使藍(lán)色的孔內(nèi)反應(yīng)液顏色變黃。若孔內(nèi)反應(yīng)液呈現(xiàn)無色，則表示樣品預(yù)增菌湯，即被檢樣品為沙門氏菌陰性。

2.2 具體操作流程

① RIDASCREEN? Salmonella 預(yù)增菌（隔夜）：將25g（mL）樣品（或取樣菌種）加入到225mL緩沖蛋白水中，在35～37℃條件下孵育16～20小時(shí)。

②檢測(cè)準(zhǔn)備過程：沙門氏菌板內(nèi)增菌培養(yǎng)基在50mL無菌蒸餾水中溶解，于100℃中加熱10分鐘，使用前回溫至35～37℃。洗滌緩沖液在1L無菌蒸餾水中溶解，使用前預(yù)熱至35～37℃。

③捕獲樣品中的沙門氏菌：滴加質(zhì)控和經(jīng)預(yù)增菌后的樣品各100μL放入反應(yīng)微孔板中，于35～37℃下孵育30分鐘（孵育時(shí)請(qǐng)蓋住反應(yīng)微孔板）。

④第一次清洗：重復(fù)清洗7次，每次每個(gè)微孔各對(duì)應(yīng)使用300μL洗滌緩沖液（預(yù)熱至35～37℃）。

⑤受損菌的營養(yǎng)增菌：在各反應(yīng)微孔中滴加250μL沙門氏菌，板內(nèi)增菌培養(yǎng)基于35～37℃下孵育4小時(shí)（孵育時(shí)請(qǐng)蓋住反應(yīng)微孔板）。

⑥樣品轉(zhuǎn)移/預(yù)留被檢樣品：將經(jīng)板內(nèi)增菌的沙門氏菌菌湯全部轉(zhuǎn)移到新的微孔中，保留其用于檢測(cè)陽性結(jié)果的確認(rèn)和鑒定。

⑦加入酶連接物：在各反應(yīng)微孔中滴加入100μL酶連接物，于35～37℃下孵育30分鐘（孵育時(shí)請(qǐng)蓋住反應(yīng)微孔板）。

⑧二次清洗：重復(fù)清洗7次，每次每個(gè)微孔各對(duì)應(yīng)使用300μL洗滌緩沖液（預(yù)熱至35～37℃）。

⑨加入色原/顯色劑，目測(cè)結(jié)果：在各反應(yīng)孔中加入100μL色原/顯色劑，室溫下暗室孵育15分鐘，若孔中反應(yīng)液呈藍(lán)色，則表示被檢樣品為沙門氏菌陽性。

⑩終止反應(yīng)，使用儀器測(cè)量和分析檢測(cè)結(jié)果：在各反應(yīng)孔中加入100μL反應(yīng)終止液，于450/620nm波長下使用合適的儀器進(jìn)行結(jié)果測(cè)量，根據(jù)《說明書》進(jìn)行結(jié)果判定。

2.3 檢測(cè)優(yōu)勢(shì)

作為初篩樣品中是否含有沙門氏菌的檢測(cè)方法，ELISA法具有明顯的檢測(cè)優(yōu)勢(shì)：檢測(cè)總時(shí)長不超過24小時(shí)；樣品處理簡單；不需要大型儀器，利用普通的酶標(biāo)儀即可初步判斷樣品是否為疑似樣品；同樣，其也不需要專業(yè)的技術(shù)人員進(jìn)行操作，且樣品基質(zhì)適應(yīng)范圍廣，可以檢測(cè)食品、飼料、環(huán)境等各種樣品。RIDASCREEN?Salmonella沙門氏菌檢測(cè)試劑盒R4201靈敏度高，25g樣品中只需含有1～5個(gè)沙門氏菌即可檢出；檢測(cè)通量大，經(jīng)過簡單的樣品處理，一次可以檢測(cè)近90個(gè)樣本。該試劑盒通過了法國農(nóng)業(yè)部AFNOR的認(rèn)證（RBP31/01-06/08），其檢測(cè)結(jié)果同相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)方法接近或相似，可信度高。

3 傳統(tǒng)的微生物培養(yǎng)法

3.1 應(yīng)用原理

Compact Dry SL沙門氏菌檢測(cè)板是一種干燥培養(yǎng)基產(chǎn)品，含有顯色底物和新生霉素，其可通過運(yùn)用以下3個(gè)獨(dú)立的測(cè)試原理來檢測(cè)樣品中的沙門氏菌：

①沙門氏菌的賴氨酸脫羧酶使培養(yǎng)基堿性化（培養(yǎng)基顏色將由藍(lán)紫色變?yōu)辄S色）；

②沙門氏菌特有的酶會(huì)使顯色底物裂解，從而形成綠化的菌落（沙門氏菌產(chǎn)生硫化氫會(huì)形成黑色菌落）；

③沙門氏菌的運(yùn)動(dòng)性。

3.2 具體操作流程

①根據(jù)食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)GB 4789.4-2016《食品微生物學(xué)檢驗(yàn)沙門氏菌檢驗(yàn)》5.1的要求或拜發(fā)產(chǎn)品HS9401用法說明對(duì)樣本進(jìn)行約20小時(shí)的預(yù)增菌后，再根據(jù)ISO 6579:2002進(jìn)行約24小時(shí)的增菌，然后根據(jù)HS 9401用法說明中的第三、第四步驟將增菌后的培養(yǎng)基置于Compact的平板上，在42℃環(huán)境下孵育24小時(shí)后判定結(jié)果。

②根據(jù)《說明書》，當(dāng)出現(xiàn)黑色-綠色的菌落時(shí)，意味著此樣品中可能含有沙門氏菌。為確證這一想法，此時(shí)可以移取檢測(cè)板上的黑色-綠色菌落并根據(jù)相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行下一步的沙門氏菌生化鑒定。

3.3 檢測(cè)優(yōu)勢(shì)

該方法共需約3天時(shí)間就可以初步判定結(jié)果；成本低廉，無需制備培養(yǎng)基和壓片；簡單易操作，一般技術(shù)人員都可熟練掌握。此外，檢測(cè)板上的菌落清晰易測(cè)，可將單個(gè)菌落分離出來進(jìn)行鑒定實(shí)驗(yàn)，類似于目前的國標(biāo)方法。

4 總結(jié)

以上3種產(chǎn)品均為拜發(fā)自主研發(fā)并生產(chǎn)，如用戶無時(shí)間方面的壓力，可以選擇同傳統(tǒng)國標(biāo)方法相似的沙門氏菌微生物培養(yǎng)法進(jìn)行檢測(cè)；如果用戶生產(chǎn)時(shí)間緊迫，庫存壓力大，且在儀器方法的操作方面不夠成熟，建議選擇ELISA方法盡快完成對(duì)原料的初篩及對(duì)成品的初步判定，讓完全陰性的原料可以盡快生產(chǎn)或讓完全陰性的成品盡快進(jìn)入市場；如果用戶自身儀器配套設(shè)施較為完備，則建議選擇第三種方法進(jìn)行定性檢測(cè)，其速度快，不需要再次進(jìn)行選擇性培養(yǎng)及血清學(xué)篩查，且節(jié)省勞動(dòng)力，過程簡單，使用的耗材處理簡單、安全，不會(huì)輕易對(duì)環(huán)境及人員造成污染，不失為一種實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)沙門氏菌的優(yōu)選方法。