嗜熱脂肪芽孢桿菌液體發(fā)酵條件的優(yōu)化

□ 陶文靖 胡素麗 北京美正生物科技有限公司

□ 趙婷婷 光明乳業(yè)股份有限公司華東中心工廠

□ 付敏 中農(nóng)孚德檢測(cè)技術(shù)（北京）有限公司

1 嗜熱脂肪芽孢桿菌的介紹

1.1 嗜熱脂肪芽孢桿菌的特性

1917年Smith等在實(shí)驗(yàn)室分離出嗜熱脂肪芽孢桿菌，1920年Donk將其歸類(lèi)于芽孢桿菌屬（Bacillus）并以嗜熱脂肪芽孢桿菌（Bacillus stearothermophilus） 來(lái) 命 名[1]。2001 年，Nazina等將包括嗜熱脂肪芽孢桿菌在內(nèi)的6種菌株從芽孢桿菌屬分離出來(lái)，并歸類(lèi)為芽孢桿菌屬（Geobacillus），目前該屬已經(jīng)被國(guó)際所公認(rèn)[2]。ATCC、DSMZ，以及國(guó)際權(quán)威標(biāo)準(zhǔn)和藥典等已經(jīng)將嗜熱脂肪芽孢桿菌（Bacillus stearothermophilus）更名為嗜熱脂肪土芽孢桿菌（Geobacillus stearothermophilus）， 但中國(guó)依然習(xí)慣稱(chēng)其為嗜熱脂肪芽孢桿菌（Bacillus stearothermophilus）。

嗜熱脂肪芽孢桿菌是革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，該菌營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞呈長(zhǎng)桿、圓端狀，多數(shù)為單菌落，少數(shù)會(huì)成對(duì)或呈鏈狀排列[3]。嗜熱脂肪芽孢桿菌的最佳生長(zhǎng)溫度為5 6～6 0℃，最高生長(zhǎng)溫度為6 5～7 5℃，最低生長(zhǎng)溫度為3 5～4 5℃。此外，該菌是需氧或兼性厭氧菌，消耗葡萄糖產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，其最適p H值為 6.8～7.2，當(dāng) p H值接近 5時(shí)該菌就不能生長(zhǎng)[4]。培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)成分對(duì)芽孢生成率有明顯的影響——在培養(yǎng)基中加入無(wú)機(jī)離子可提高芽孢產(chǎn)率和芽孢熱抗力，如鈣離子濃度增加可使芽孢的熱抗力增強(qiáng)[1]。

1.2 嗜熱脂肪芽孢桿菌的應(yīng)用

嗜熱脂肪芽孢桿菌可以作為生物指示劑，由于其產(chǎn)生的孢子具有非致病性、無(wú)熱原、無(wú)毒等特性，并且耐高溫和高壓，因此被歐洲藥典、美國(guó)藥典和日本藥典用作熱滅菌生物指示劑。我國(guó)也將該菌株列入《消毒與滅菌效果的評(píng)價(jià)方法與標(biāo)準(zhǔn)》（GB 5981-1995）和《消毒技術(shù)規(guī)范》（2002版）[5]。此外，該菌還被廣泛應(yīng)用于牛奶中抗生素的檢測(cè)[6]，乳品中抗生素試劑盒應(yīng)用的檢測(cè)方法就是依據(jù)嗜熱脂肪芽胞桿菌生長(zhǎng)、萌發(fā)產(chǎn)酸使培養(yǎng)基的顏色發(fā)生改變的原理，將其作為檢測(cè)指標(biāo)。

2 儀器與材料

2.1 實(shí)驗(yàn)儀器

超凈工作臺(tái)：江蘇蘇凈安泰有限公司；pH測(cè)試計(jì)：ALALIS安萊立思；恒溫?fù)u床：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；電子天平：梅特勒-托利多國(guó)際貿(mào)易(上海)有限公司；滅菌鍋：上海三申醫(yī)療器械有限公司；磁力攪拌器：IKA儀科；恒溫振蕩器：常州國(guó)華電器有限公司；顯微鏡：奧林巴斯（北京）銷(xiāo)售服務(wù)有限公司。

2.2 實(shí)驗(yàn)材料和試劑

蛋白胨：北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司；酵母粉：北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司；NaCl、CaCl2等：北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司；NaOH：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

3 實(shí)驗(yàn)方法

3.1 菌株的活化培養(yǎng)

在無(wú)菌條件下用接種環(huán)取一環(huán)誘變后的HY嗜熱脂肪芽孢桿菌，接入含有50mL配有培養(yǎng)基的150mL三角瓶里，置于60℃、140rpm/min的條件下在水浴搖床培養(yǎng)18h，制備種子液。

3.2 芽孢鏡檢及產(chǎn)率計(jì)算

①玻片制備：取一片干凈的載玻片，于中央處滴加1滴無(wú)菌水，在超凈工作臺(tái)內(nèi)用接種針取菌膜涂于水滴內(nèi)并混勻。載玻片用酒精燈的外焰過(guò)火加熱直至菌膜干涸。

②染色：滴加7.6%的孔雀石綠染液于菌膜上，待看到染液上方發(fā)煙后開(kāi)始計(jì)時(shí)，并不停補(bǔ)色，5min后用細(xì)水流沖洗玻片一端，然后用洗耳球吹干水分。滴沙黃復(fù)染液，染色5min，沖洗玻片后吹干。

③觀察：打開(kāi)顯微鏡，用100倍油鏡觀察。在視野中可看到菌體被染成紅色，芽孢被染成綠色。觀察結(jié)束后，用蘸有乙醚酒精液的擦鏡紙擦拭鏡頭。

芽孢產(chǎn)率計(jì)算公式如下：

該式中，Z為芽孢產(chǎn)率；M1為芽孢數(shù)；M2為細(xì)菌數(shù)。

3.3 產(chǎn)孢培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)成分的優(yōu)化

設(shè)定基礎(chǔ)培養(yǎng)基成分配比及產(chǎn)孢條件：0.5%蛋白胨、0.6%酵母粉、0.3%NaCl、pH7.0、接種量0.1%、裝液量100mL、培養(yǎng)時(shí)間24h、培養(yǎng)溫度60℃。通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)對(duì)基礎(chǔ)培養(yǎng)基成分進(jìn)行實(shí)驗(yàn)優(yōu)化，分別設(shè)置實(shí)驗(yàn)條件因素如下：

①蛋白胨濃度分別為0.5%、0.8%、1.0 %、1.2%、1.5%、1.8%；

②酵母膏濃度分別為0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%；

③NaCl濃度分別為0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%；

④添加MnSO4濃度分別為0、0.1、0.3、0.5、0.7、0.9、1.1、1.3mmol/L；

⑤ 添 加 CaCl2濃 度 分 別 為 0、2.5、5、7.5、10、12.5、15mmol/L；

⑥添加FeSO4·7H2O濃度分別為0、1、2.5、5、7.5、10mmol/L；

⑦pH分別選擇至6.0、6.2、6.4、6.6、6.8、7.0、7.2、7.4。

分別取100mL培養(yǎng)基裝入250mL的錐形瓶中，將活化后的嗜熱脂肪芽孢桿菌種子液以0.1%的接種量接種到培養(yǎng)基中，置于培養(yǎng)箱中，將溫度調(diào)至60℃培養(yǎng)24h，通過(guò)芽孢染色和顯微鏡鏡檢的方法估算芽孢產(chǎn)率，以芽孢產(chǎn)率為指標(biāo)，重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)，確定培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)成分配比。

3.4 產(chǎn)孢培養(yǎng)條件的優(yōu)化

以3.3中得到的最優(yōu)培養(yǎng)基組分為基礎(chǔ)，進(jìn)行發(fā)酵條件（溫度、時(shí)間、接種量）優(yōu)化。通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)對(duì)產(chǎn)孢條件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)優(yōu)化，分別設(shè)置實(shí)驗(yàn)條件因素如下：

①培養(yǎng)溫度分別設(shè)置為55、60、65、70、75℃；

②培養(yǎng)時(shí)間分別設(shè)置為16、20、24、32、36、40h；

③接種量分別設(shè)置為0.03%、0.06%、0.1%、0.2%、0.4%。

通過(guò)芽孢染色和顯微鏡鏡檢的方法估算芽孢產(chǎn)率，以芽孢產(chǎn)率為指標(biāo)，重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)，確定最佳產(chǎn)孢條件。

3.5 優(yōu)化后條件的驗(yàn)證

對(duì)經(jīng)過(guò)3.3和3.4實(shí)驗(yàn)優(yōu)化所得到的最優(yōu)條件進(jìn)行組合，進(jìn)行5次芽孢發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，對(duì)芽孢產(chǎn)率進(jìn)行驗(yàn)證。

4 結(jié)果與分析

4.1 培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)成分的確定

4.1.1 蛋白胨濃度的確定

依照3.3的實(shí)驗(yàn)方案，以最初培養(yǎng)基組成比例為基礎(chǔ)，更改蛋白胨的含量分別為0.5%、0.8%、1.0%、1.2%、1.5%、1.8%，結(jié)果如圖1所示。

圖1 蛋白胨濃度對(duì)芽孢產(chǎn)率的影響

由圖1結(jié)果顯示，在一定范圍內(nèi)，隨著蛋白胨濃度的加大，芽孢產(chǎn)率隨之升高。當(dāng)?shù)鞍纂藵舛葹?.8%時(shí)，芽孢產(chǎn)率達(dá)到最高，為37.1%；當(dāng)?shù)鞍纂藵舛却笥?.0%時(shí)，芽孢產(chǎn)率隨之呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。所以，確定以0.8%蛋白胨濃度作為以下產(chǎn)孢培養(yǎng)基的成分。

4.1.2 酵母膏濃度的確定

依照3.3的實(shí)驗(yàn)方案，以前述實(shí)驗(yàn)確定的參數(shù)為前提，更改酵母膏的濃度分別為0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%，結(jié)果如圖2所示。

由圖2結(jié)果顯示，在一定范圍內(nèi)，伴隨酵母膏濃度的加大，芽孢產(chǎn)率隨之提高。當(dāng)酵母膏濃度在0.3%時(shí)，芽孢產(chǎn)率達(dá)到最高，為34.2%；當(dāng)酵母膏濃度大于0.3%時(shí)，芽孢產(chǎn)率隨之呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。通過(guò)此實(shí)驗(yàn)，確定以0.3%酵母膏濃度作為以下產(chǎn)孢培養(yǎng)基的成分。

圖2 酵母膏濃度對(duì)芽孢產(chǎn)率的影響

4.1.3 NaCl濃度的確定

依照3.3的實(shí)驗(yàn)方案，以前述實(shí)驗(yàn)確定的參數(shù)為前提，更改NaCl的濃度分別為0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%，結(jié)果如圖3所示。

圖3 NaCl濃度對(duì)芽孢產(chǎn)率的影響

由圖3結(jié)果顯示，在一定范圍內(nèi)，伴隨NaCl濃度的加大，芽孢產(chǎn)率隨之提高。當(dāng)NaCl濃度在0.3%時(shí)，芽孢產(chǎn)率達(dá)到最高，為34.7%；當(dāng)NaCl濃度大于0.3%時(shí)，芽孢產(chǎn)率隨之呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。通過(guò)此實(shí)驗(yàn)，確定以0.3%NaCl濃度作為以下產(chǎn)孢培養(yǎng)基的成分。

4.1.4 Mn2+濃度的確定

圖4 Mn2+對(duì)芽孢產(chǎn)率的影響

依照3.3的實(shí)驗(yàn)方案，以前述實(shí)驗(yàn)確定的參數(shù)為前提，更改MnSO4濃度分別為0、0.1、0.3、0.5、0.7、0.9、1.1、1.3mmol/L，結(jié)果如圖4所示。

由圖4結(jié)果顯示，在一定范圍內(nèi)，伴隨Mn2+濃度的加大，芽孢產(chǎn)率隨之提高。當(dāng)Mn2+濃度為0.9mmol/L時(shí)，芽孢產(chǎn)率達(dá)到最高，為42.6%；當(dāng)Mn2+濃度大于0.9mmol/L時(shí)，芽孢產(chǎn)率隨之呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。因此，確定產(chǎn)孢培養(yǎng)基中Mn2+的添加量為0.9mmol/L。

4.1.5 Ca2+濃度的確定

依照3.3的實(shí)驗(yàn)方案，以前述實(shí)驗(yàn)確定的參數(shù)為前提，增加 CaCl2分別為 0、2.5、5、7.5、10、12.5、15mmol/L，結(jié)果如圖5所示。

圖5 Ca2+對(duì)芽孢產(chǎn)率的影響

由圖5結(jié)果顯示，在一定范圍內(nèi)，伴隨Ca2+濃度的加大，芽孢產(chǎn)率隨之提高。當(dāng)Ca2+濃度為10mmol/L時(shí)，芽孢產(chǎn)率達(dá)到最高，為47.2%；當(dāng)Ca2+濃度大于10mmol/L時(shí)，芽孢產(chǎn)率隨之呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。通過(guò)此實(shí)驗(yàn)，確定產(chǎn)孢培養(yǎng)基中Ca2+的添加量為10mmol/L。

4.1.6 Fe2+濃度

依照3.3的實(shí)驗(yàn)方案，以前述實(shí)驗(yàn)確定的參數(shù)為前提，增 加 FeSO4·7H2O 濃 度 分 別 為 0、1、2.5、5、7.5、10、12.5mmol/L，結(jié)果如圖6所示。

由圖6結(jié)果顯示，在一定范圍內(nèi)，伴隨Fe2+濃度的加大，芽孢產(chǎn)率并沒(méi)有顯著提高，反而對(duì)芽孢生長(zhǎng)有輕微抑制，所以放棄添加Fe2+。

圖6 Fe2+對(duì)芽孢產(chǎn)率的影響

4.1.7 pH值的確定

依照3.3的實(shí)驗(yàn)方案，在以上述確定的參數(shù)為前提下，調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH值分別為6.0、6.2、6.4、6.6、6.8、7.0、7.2、7.4，結(jié)果如圖7所示。

圖7 pH對(duì)芽孢產(chǎn)率的影響

由圖7結(jié)果顯示，當(dāng)pH偏酸性時(shí)，芽孢的形成受到抑制。當(dāng)pH為7.0時(shí)芽孢產(chǎn)率最高，為47.2%；當(dāng)pH高于7.0時(shí)，芽孢產(chǎn)率逐漸降低，因此產(chǎn)孢最佳pH為7.0。

通過(guò)3.3的實(shí)驗(yàn)，確定培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)成分的基本配比為：蛋白胨濃度0.8%、酵母膏濃度0.3%、NaCl濃度0.3%、Mn2+濃度為0.9mmol/L、Ca2+濃度為10mmol/L、pH為7.0，以此作為接下來(lái)產(chǎn)孢培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)的培養(yǎng)基成分，繼續(xù)優(yōu)化產(chǎn)孢培養(yǎng)條件。

4.2 產(chǎn)孢培養(yǎng)條件的確定

4.2.1 產(chǎn)孢培養(yǎng)溫度的確定

根據(jù)3.4的實(shí)驗(yàn)方案，進(jìn)行培養(yǎng)溫度對(duì)芽孢產(chǎn)率的實(shí)驗(yàn)，培養(yǎng)溫度分別設(shè)置為55、60、65、70、75℃，結(jié)果如圖8所示。

由圖8結(jié)果顯示，在菌株適應(yīng)生長(zhǎng)范圍內(nèi)，隨著溫度的提升，芽孢產(chǎn)率有一定的提高，當(dāng)溫度在65℃時(shí)芽孢產(chǎn)率最高，為49.7%；當(dāng)溫度高于65℃時(shí)，芽孢產(chǎn)率逐漸降低，因此產(chǎn)孢最佳培養(yǎng)溫度為65℃。

4.2.2 產(chǎn)孢培養(yǎng)時(shí)間的確定

根據(jù)3.4的實(shí)驗(yàn)方案，進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)間對(duì)芽孢產(chǎn)率影響的實(shí)驗(yàn)，培養(yǎng)時(shí)間設(shè)為16、24、32、36、40h，每隔2～4h進(jìn)行測(cè)試，結(jié)果如圖9所示。

圖8 培養(yǎng)溫度對(duì)芽孢產(chǎn)率的影響

圖9 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)芽孢產(chǎn)率的影響

由圖9結(jié)果顯示，當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間為24～28h時(shí)，芽孢產(chǎn)率達(dá)到48%以上；當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間超過(guò)32h時(shí)，芽孢產(chǎn)率出現(xiàn)降低趨勢(shì)。分析出現(xiàn)這種趨勢(shì)的原因可知，隨著時(shí)間的變化，其培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)成分已經(jīng)不足以維持菌體的生長(zhǎng)繁殖，且菌體逐漸走向衰亡期，活的菌體變少了，所轉(zhuǎn)化的芽孢便會(huì)減少。因此，產(chǎn)孢培養(yǎng)的最佳時(shí)間為24～28h。

4.2.3 接種量條件的確定

根據(jù)3.4的實(shí)驗(yàn)方案，進(jìn)行接種量對(duì)芽孢產(chǎn)率的實(shí)驗(yàn)，接種量分別為0.03%、0.06%、0.1%、0.2%、0.4%，結(jié)果如圖10所示。

由圖10結(jié)果顯示，在一定范圍內(nèi)，隨著接種量的增加，芽孢產(chǎn)率也隨之增加，當(dāng)接種量為0.1%時(shí)，芽孢產(chǎn)率最高，為49.7%。當(dāng)接種量超過(guò)0.1%時(shí)，芽孢產(chǎn)率降低，這可能是因?yàn)榕囵B(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)是一定的，當(dāng)菌體數(shù)量太多時(shí)，培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)無(wú)法滿足菌體的生長(zhǎng)需求，會(huì)嚴(yán)重影響嗜熱芽孢桿菌轉(zhuǎn)化成芽孢的能力，因此最佳接種量為0.1%。

圖10 接種量對(duì)芽孢產(chǎn)率的影響

4.3 芽孢產(chǎn)率的確定

根據(jù)3.5的實(shí)驗(yàn)方案，進(jìn)行芽孢發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，進(jìn)行5次平行實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖11顯示，經(jīng)過(guò)條件優(yōu)化后，芽孢產(chǎn)率平均可以達(dá)到47.8%。

圖11 5次實(shí)驗(yàn)芽孢產(chǎn)率的結(jié)果

5 結(jié)果與討論

通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)對(duì)嗜熱芽孢桿菌產(chǎn)孢培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，研究了產(chǎn)孢培養(yǎng)基組成成分（蛋白胨、酵母粉、NaCl、Mn2+、Ca2+、Fe2+、pH）以及產(chǎn)孢培養(yǎng)條件（溫度、時(shí)間、接種量），以提高嗜熱芽孢桿菌產(chǎn)孢率。

本文確定了嗜熱芽孢桿菌產(chǎn)孢培養(yǎng)基最佳配比：蛋白胨為0.8%、酵母粉為0.3%、NaCl為0.3%、Mn2+為0.9mmol/L、Ca2+為10 mmol/L、pH7.0、接種量為0.1%、裝液量為100mL、培養(yǎng)時(shí)間為24 h、溫度為65℃。Fe2+的添加對(duì)芽孢產(chǎn)率無(wú)促進(jìn)作用。隨后通過(guò)組合條件的驗(yàn)證，最終液體發(fā)酵產(chǎn)孢率可穩(wěn)定在47.8%左右，較優(yōu)化之前提高10 %以上。液體發(fā)酵雖然產(chǎn)孢率不如固體發(fā)酵高，但操作簡(jiǎn)單，一次可得到的芽孢量遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于固體發(fā)酵。該方法能夠提高試劑盒生產(chǎn)企業(yè)的工作效率并降低原材料成本。但目前產(chǎn)孢率仍然偏低，還需要進(jìn)一步優(yōu)化。