氣相色譜-質(zhì)譜法測(cè)定食品中3-乙酰基-2,5-二甲基噻吩的含量

□ 簡(jiǎn)德威 熊含鴻 鄭悅珊 洪澤淳 陳科（通訊作者） 廣東省食品檢驗(yàn)所

1 引言

3-乙 酰 基-2,5-二 甲 基 噻 吩（3-acetyl-2,5-dimethylthiophene，ADP）是一種可以作為咸味香精的食品添加劑，其于2002年開始被用作食品用香料，常用于肉類食品加工中以賦予食品烤堅(jiān)果味[1]。2013年，歐洲食品安全管理局（EFSA）對(duì)ADP進(jìn)行安全評(píng)估，發(fā)現(xiàn)該物質(zhì)在體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)均表現(xiàn)出基因毒性，會(huì)破壞DNA及細(xì)胞中的遺傳物質(zhì)，可能損害人體健康，作為食品用香料使用存在安全隱患[2]，長(zhǎng)期使用該物質(zhì)存在食品安全問題和隱患，易導(dǎo)致食品安全事件（事故）發(fā)生。因此，EFSA將ADP從許可香料中剔除，并嚴(yán)禁ADP作為食用香料投放市場(chǎng)或用于食品[3，4]。同年6月14日，歐盟委員會(huì)也通過(guò)法規(guī)Regulation(EC)No 545/2013，禁止將ADP作為食品用香料使用。目前，我國(guó)仍允許ADP作為食品用合成香料使用，并收錄于國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 2760-2014[5]中。但是，中國(guó)香精香料化妝品工業(yè)協(xié)會(huì)于2013年8月14日發(fā)布自律文件(香化協(xié)字[2013]62號(hào))，要求香料生產(chǎn)企業(yè)不得生產(chǎn)用作食品用香料的3-乙?；?2,5-二甲基噻吩，食用香精中不得使用該物質(zhì)[6]。

目前，國(guó)內(nèi)對(duì)3-乙?；?2,5-二甲基噻吩的檢測(cè)沒有相應(yīng)的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。查找相關(guān)文獻(xiàn)可發(fā)現(xiàn)，對(duì)ADP的檢測(cè)方法有液相色譜法[7]、氣相色譜-質(zhì)譜法[8，9]及氣相色譜三重四級(jí)桿質(zhì)譜法[10]等。液相色譜法的優(yōu)點(diǎn)是分離效率高、檢測(cè)靈敏度高、應(yīng)用范圍廣，缺點(diǎn)是定性效果差，容易受到雜質(zhì)、基質(zhì)等因素的干擾；氣相色譜-質(zhì)譜法的優(yōu)點(diǎn)是前處理簡(jiǎn)單、操作方便、定性效果較好，但在復(fù)雜的基質(zhì)樣品中，背景響應(yīng)較高，致使檢測(cè)靈敏度降低；氣相色譜三重四級(jí)桿質(zhì)譜法的優(yōu)點(diǎn)是定性更準(zhǔn)確、抗干擾能力強(qiáng)、樣品基質(zhì)背景的響應(yīng)較低、靈敏度也高于單級(jí)質(zhì)譜，更適用于復(fù)雜基質(zhì)中微量、痕量物質(zhì)的檢測(cè)[11-13]，但氣相色譜三重四級(jí)桿質(zhì)譜法操作較復(fù)雜，儀器較昂貴，技術(shù)難度較高。

考慮到食品基質(zhì)復(fù)雜和檢測(cè)技術(shù)的難度，采用氣相色譜-質(zhì)譜法測(cè)定3-乙?；?2,5-二甲基噻吩可以一定程度地避免受到雜質(zhì)和基質(zhì)的干擾，且定性效果好、定量準(zhǔn)確、操作簡(jiǎn)便、技術(shù)難度較低，因此本研究選擇氣相色譜-質(zhì)譜法作為檢測(cè)方法。

表1 3-乙酰基-2,5-二甲基噻吩參考保留時(shí)間及定性、定量離子

2 材料與方法

2.1 儀器與試劑

2.1.1 儀器設(shè)備

GCMS-QP2010Ultra氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀[配電子轟擊（EI）電離源]，日本島津公司；AB204-S電子天平，瑞士梅特勒-托利多公司；Multifuge X3R離心機(jī)，美國(guó)賽默飛世爾公司；KQ-500DE超聲清洗器，中國(guó)科橋公司；Vortex Genius 3渦旋混合器，德國(guó)IKA公司。

2.1.2 材料與試劑

正庚烷（色譜純），康科德科技有限公司；正己烷（色譜純），康科德科技有限公司；乙醇（色譜純），康科德科技有限公司；0.45μm有機(jī)濾膜，美國(guó)PALL公司；3-乙?；?2,5-二甲基噻吩標(biāo)準(zhǔn)品（純度99%），上海Aladdin公司。

2.2 實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

2.2.1.1 3-乙酰基-2,5-二甲基噻吩標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液的配制

準(zhǔn)確稱取3-乙?；?2,5-二甲基噻吩標(biāo)準(zhǔn)品20mg（精確至0.0001g），用正庚烷溶解并定容至10mL，此溶液濃度為2mg/mL。

2.2.1.2 3-乙?；?2,5-二甲基噻吩標(biāo)準(zhǔn)中間溶液的配制

將3-乙?；?2,5-二甲基噻吩標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液(2.2.1.1)用正庚烷稀釋成濃度為20mg/L的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

2.2.1.3 3-乙?；?2,5-二甲基噻吩標(biāo)準(zhǔn)系列工作液的配制

用正庚烷將標(biāo)準(zhǔn)中間溶液(2.2.1.2)稀釋成最終濃度為0.1、0.2、0.5、1.0、2.0mg/L的標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液。

2.2.2 前處理方法

稱取1.0g均勻樣品（精確至0.0001g）置于50mL離心管中，加入5mL正庚烷，超聲提取15min，5000r/min離心5min。然后將提取液轉(zhuǎn)至10mL容量瓶，殘?jiān)?mL正庚烷重復(fù)提取一次，合并所有提取液至10mL容量瓶，用正庚烷定容至10mL，過(guò)0.45μm有機(jī)濾膜，供氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀分析。

2.3 儀器條件

2.3.1 色譜條件

CP-wax：50m×0.25mm（內(nèi)徑）×0.25μm（膜厚）極性毛細(xì)管色譜柱；載氣：He，純度99.999%，流速1.5mL/min；進(jìn)樣口溫度：220℃；進(jìn)樣方式：不分流進(jìn)樣；進(jìn)樣量：1μL；升溫程序：初始溫度50℃保持1min，以20℃/min升溫至200℃保持3 min，再以10℃/min升溫至220℃保持5min。

2.3.2 質(zhì)譜條件

電子轟擊電離源（EI）；電離能量：70eV；接口溫度：225℃；離子源溫度：230℃；溶劑延遲時(shí)間：5min；測(cè)定方式：選擇離子監(jiān)控（SIM）。3-乙?；?2,5-二甲基噻吩參考保留時(shí)間及定性、定量離子見表1，3-乙?；?2,5-二甲基噻吩的質(zhì)譜圖及色譜圖見圖1、圖2。

圖1 3-乙?；?2,5-二甲基噻吩質(zhì)譜圖

3 結(jié)果與分析

3.1 前處理?xiàng)l件的研究

3.1.1 萃取溶劑的研究

圖2 3-乙酰基-2,5-二甲基噻吩色譜圖

表2 正己烷、正庚烷、乙醇作為萃取溶劑時(shí)的樣品回收率

日常檢驗(yàn)檢測(cè)中，實(shí)驗(yàn)室大多數(shù)使用的低毒萃取溶劑為正己烷、正庚烷、乙醇、異辛烷、二氯甲烷等。本方法選擇常用的正己烷、正庚烷、乙醇作為萃取溶劑，以超聲萃取方式測(cè)試不同基質(zhì)加標(biāo)樣品的回收率，考察3種溶劑的萃取效率，選擇效率最高的溶劑作為萃取試劑，結(jié)果見表2。

從表2的檢驗(yàn)結(jié)果可以看出，使用正庚烷的萃取效率最高，回收率在88.5%～93.5%；其次是乙醇，回收率在79.3%～5.6%；正己烷的回收率最低，只有58.2%～60.5%?？紤]到乙醇和水互溶，而帶入的水分可能會(huì)影響質(zhì)譜性能，因此選擇正庚烷作為萃取溶劑。

3.1.2 萃取方法的研究

常用的萃取方法有超聲萃取、渦旋提取、索氏提取等，本方法采用超聲萃取、渦旋提取，使用正庚烷為萃取試劑，測(cè)試不同基質(zhì)加標(biāo)樣品的回收率，選取回收率最高的萃取方法作為本方法的最終萃取方法，結(jié)果見表3。

圖3 不同萃取時(shí)間段樣品的回收率

從表3的檢測(cè)結(jié)果可以看出，不同基質(zhì)通過(guò)超聲萃取的回收率在90.8%～95.3%，均高于渦旋提取的回收率（85.2%～89.9%），因此選擇超聲萃取作為本方法的萃取方法。

3.1.3 萃取時(shí)間的研究

以正庚烷為萃取試劑，通過(guò)超聲萃取法，研究萃取1、5、10、15、20、30分鐘后不同基質(zhì)加標(biāo)樣品的回收率，結(jié)果見圖3。

從圖3可以看出，隨著萃取時(shí)間的增加，回收率結(jié)果呈現(xiàn)遞增趨勢(shì)，但萃取時(shí)間超過(guò)15分鐘后回收率無(wú)明顯變化，考慮到檢測(cè)方法的效率，故選取15分鐘作為本方法的萃取時(shí)間。

圖4 標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

3.2 方法學(xué)驗(yàn)證

3.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制與測(cè)定，得出本方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線，見圖4。

以3-乙?；?2,5-二甲基噻吩的濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，3-乙?；?2,5-二甲基噻吩在0.1～2.0mg/L內(nèi)呈線性關(guān)系，線性回歸方程為Y=495019.8X-18840.62，相關(guān)系數(shù)R2＝0.997。

表3 超聲萃取、渦旋提取作為萃取方法時(shí)的樣品回收率

表4 不同基質(zhì)計(jì)算出的檢出限和定量限結(jié)果表

表5 不同基質(zhì)樣品加標(biāo)6次重復(fù)測(cè)定結(jié)果表

3.2.2 方法檢出限與定量限

方法的檢出限以3倍信噪比（S/N）計(jì)算，定量限以3倍檢出限計(jì)算。通過(guò)測(cè)定不同基質(zhì)的低加標(biāo)含量，可計(jì)算出本方法的檢出限和定量限，結(jié)果見表4。

從表4結(jié)果可以看出，計(jì)算得到不同基質(zhì)的檢出限分別為0.046、0.048、0.050mg/kg，因此將本方法的檢出限定為0.05mg/kg，定量限為0.15mg/kg。

3.2.3 準(zhǔn)確性

通過(guò)對(duì)不同基質(zhì)加標(biāo)量為0.5mg/kg的含量測(cè)定，研究本方法的準(zhǔn)確性，結(jié)果見表5。

從表5可以看出，加標(biāo)量為0.5mg/kg的固體基質(zhì)樣品，重復(fù)測(cè)定6次的平均值為0.47mg/kg，回收率為94.0%；加標(biāo)量為0.5mg/kg的半固體基質(zhì)樣品，重復(fù)測(cè)定6次的平均值為0.47mg/kg，回收率為94.0%；加標(biāo)量為0.5mg/kg的液體基質(zhì)樣品，重復(fù)測(cè)定6次的平均值為0.49mg/kg，回收率為98.0%，均符合GB/T 27404-2008《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測(cè)》的要求[14]，說(shuō)明本方法可準(zhǔn)確定量樣品中3-乙?；?2,5-二甲基噻吩的含量。

3.2.4 重復(fù)性

通過(guò)對(duì)3種不同基質(zhì)的不同濃度加標(biāo)含量的測(cè)定，計(jì)算其回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），研究本方法的重復(fù)性，結(jié)果見表6。

表6 不同基質(zhì)樣品3種加標(biāo)含量回收率結(jié)果表

從表6的結(jié)果中可以看出，固體基質(zhì)低加標(biāo)（0.3mg/kg）6次重復(fù)測(cè)定的回收率在83.6%～89.3%之間，RSD為2.45%；中加標(biāo)（0.6mg/kg）6次重復(fù)測(cè)定的回收率在85.2%～91.7%之間，RSD為2.78%；高加標(biāo)（1.0mg/kg）6次重復(fù)測(cè)定的回收率在87.1%～93.3%之間，RSD為2.87%。

半固體基質(zhì)低加標(biāo)（0.3mg/kg）6次重復(fù)測(cè)定的回收率在82.4%～90.2%，RSD為3.90%；中加標(biāo)（0.6mg/kg）6次重復(fù)測(cè)定的回收率在86.1%～91.3%，RSD為2.20%；高加標(biāo)（1.0mg/kg）6次重復(fù)測(cè)定的回收率在90.9%～100.8%，RSD為3.57%。

液體基質(zhì)低加標(biāo)（0.3mg/kg）6次重復(fù)測(cè)定的回收率在86.2%～94.8%之間，RSD為3.46%；中加標(biāo)（0.6mg/kg）6次重復(fù)測(cè)定的回收率在86.7%～91.2%之間，RSD為1.74%；高加標(biāo)（1.0mg/kg）6次重復(fù)測(cè)定的回收率在92.1%～101.3%之間，RSD為3.23%。

通過(guò)不同基質(zhì)的不同濃度加標(biāo)回收率及RSD可以看出，本方法滿足GB/T 27404-2008《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測(cè)》的要求[14]。

4 結(jié)論

本研究建立了一種氣相色譜-質(zhì)譜法測(cè)定食品中3-乙酰基-2,5-二甲基噻吩含量的檢測(cè)方法。通過(guò)對(duì)萃取溶劑、萃取方法、萃取時(shí)間的研究，確定了較優(yōu)且操作簡(jiǎn)便的前處理?xiàng)l件，并對(duì)檢測(cè)方法的線性、檢出限、定量限、準(zhǔn)確性、重復(fù)性進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證，確保本方法的結(jié)果準(zhǔn)確可靠。本研究建立的氣相色譜-質(zhì)譜法測(cè)定食品中3-乙?；?2,5-二甲基噻吩含量的檢測(cè)方法，定性效果好、定量準(zhǔn)確，且前處理操作簡(jiǎn)便，技術(shù)難度較低，是對(duì)目前相對(duì)較少的3-乙酰基-2,5-二甲基噻吩的檢測(cè)方法的補(bǔ)充，為建立3-乙酰基-2,5-二甲基噻吩檢測(cè)的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)或方法提供參考依據(jù)，同時(shí)對(duì)執(zhí)法部門進(jìn)行食品加工和銷售過(guò)程中違規(guī)、違法添加化學(xué)原料行為的監(jiān)管提供技術(shù)支持，避免食品安全事件發(fā)生，從而保障食品行業(yè)健康發(fā)展和人民舌尖上的安全。