智能厭氧培養(yǎng)系統(tǒng)在食用益生菌領(lǐng)域的應(yīng)用展望

□ 趙德錕 杭州大微生物技術(shù)有限公司

本文介紹了一種創(chuàng)新的智能厭氧培養(yǎng)系統(tǒng)——以數(shù)字化精確控制厭氧培養(yǎng)氣體環(huán)境的生成，并且具備對(duì)多種創(chuàng)新的培養(yǎng)環(huán)境進(jìn)行平行研究（同時(shí)生成：多種氣體、多種濃度、多種溫度可選）的能力。此外，還展望了該系統(tǒng)在食用益生菌相關(guān)研究領(lǐng)域包括益生菌制品活菌計(jì)數(shù)、耐氧益生菌菌株馴化、益生菌生產(chǎn)工藝質(zhì)控、微生物培養(yǎng)組學(xué)（culturomics）、中藥類保健食品成分的腸內(nèi)生物轉(zhuǎn)化、腸道微生物體外模型這6大細(xì)分領(lǐng)域的應(yīng)用前景。

目前，智能厭氧培養(yǎng)系統(tǒng)廣泛應(yīng)用于臨床致病厭氧菌檢測(cè)、益生菌和腸道菌群（多數(shù)為厭氧菌）研究，以及食品安全厭氧污染菌檢測(cè)等領(lǐng)域。

DW-100A-K智能厭氧微生物培養(yǎng)系統(tǒng)是業(yè)內(nèi)率先實(shí)現(xiàn)數(shù)字化精確控制厭氧培養(yǎng)氣體環(huán)境（0～15%氧氣濃度可調(diào)）生成，并且可實(shí)現(xiàn)多個(gè)獨(dú)立培養(yǎng)罐體中同時(shí)進(jìn)行多種培養(yǎng)環(huán)境（多種氣體、多種濃度、多種溫度可選）平行研究的厭氧菌培養(yǎng)研究平臺(tái)。目前，該系統(tǒng)廣泛應(yīng)用于臨床致病厭氧菌檢測(cè)、益生菌和腸道菌群（多數(shù)為厭氧菌）研究，以及食品安全厭氧污染菌檢測(cè)等領(lǐng)域。在此，筆者展望了智能厭氧培養(yǎng)系統(tǒng)在益生菌相關(guān)研究中的應(yīng)用前景。

1 酸乳等益生菌制品中的活菌計(jì)數(shù)

益生菌酸奶是目前市面上較為常見的活性益生菌制品之一，它是在常規(guī)發(fā)酵乳的基礎(chǔ)上添加了一種或幾種乳酸菌類（如嗜酸乳桿菌、雙歧桿菌、鼠李糖乳桿菌、干酪乳桿菌）的酸乳，具有平衡和改善胃腸道功能、增強(qiáng)人體自身免疫能力等特點(diǎn)。然而，此類酸乳的特殊營(yíng)養(yǎng)作用和保健功能取決于其成品中是否含有足夠數(shù)量級(jí)的活性益生菌，因此統(tǒng)計(jì)各種益生菌制品的活菌總數(shù)成為判斷益生菌酸奶品質(zhì)好壞和功能活性高低的重要手段。

GB 6321-2003《乳酸菌飲料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》和GB 9302-2010《發(fā)酵乳》中均對(duì)產(chǎn)品中乳酸菌數(shù)量有所要求，即≥1×106cfu/mL。目前，我國(guó)關(guān)于活性益生菌產(chǎn)品中的活菌計(jì)數(shù)主要參考GB 4789系列食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物檢驗(yàn)方法中有關(guān)乳酸菌和雙歧桿菌的標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行。在此方法中，穩(wěn)定可靠的厭氧培養(yǎng)環(huán)境是保證活菌計(jì)數(shù)結(jié)果準(zhǔn)確的基礎(chǔ)，也是產(chǎn)品品質(zhì)保障的關(guān)鍵。

DW-100A-K智能厭氧培養(yǎng)系統(tǒng)的工作原理是通過(guò)內(nèi)置精密無(wú)油真空泵、毫巴級(jí)壓力傳感器和軟件控制系統(tǒng)來(lái)自動(dòng)控制氣體的抽排與置換，從而保證所連接的培養(yǎng)罐內(nèi)數(shù)分鐘即達(dá)到厭氧、微需氧或特定氧濃度設(shè)定的氣體培養(yǎng)環(huán)境。然后，將設(shè)定好的氣體環(huán)境培養(yǎng)罐與主機(jī)分離，再置于任意溫度的恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。智能厭氧培養(yǎng)系統(tǒng)在益生菌制品的活菌計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中提供了穩(wěn)定、專業(yè)的厭氧培養(yǎng)條件，提高了計(jì)數(shù)結(jié)果的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性，為益生菌制品企業(yè)的品控提供了技術(shù)支撐。同時(shí)，該系統(tǒng)也可應(yīng)用于市場(chǎng)監(jiān)管部門的監(jiān)督檢驗(yàn)活動(dòng)中。

圖1 耐氧優(yōu)良益生菌株的耐氧馴化實(shí)驗(yàn)示意圖

2 耐氧優(yōu)良益生菌菌株的馴化選育

益生菌種類繁多，其中雙歧桿菌無(wú)疑是最具發(fā)展?jié)摿Φ囊活愐嫔?。雙歧桿菌可用于調(diào)節(jié)人體的腸道微生物，且具有治療腹瀉、緩解乳糖不耐癥和降低血清、膽固醇等作用。然而，由于雙歧桿菌為嚴(yán)格厭氧菌，且缺少有效的活性氧清除機(jī)制，故一些活性氧成分會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞的死亡。因此，篩選出具有優(yōu)良耐氧性的雙歧桿菌，將極大地促進(jìn)其在益生菌制品中的應(yīng)用。

耐氧型雙歧桿菌的獲取一般需通過(guò)3步完成——分離、鑒定和馴化。首先是對(duì)各類樣品進(jìn)行處理，即在厭氧條件下培養(yǎng)、分離；然后通過(guò)鑒定手段以確定獲取的菌株是否為雙歧桿菌；最后使雙歧桿菌菌株在厭氧環(huán)境和微需氧環(huán)境下交替培養(yǎng)，多次傳代后即可獲得耐氧型雙歧桿菌。在此過(guò)程中，厭氧環(huán)境的形成和逐級(jí)氧氣濃度梯度馴化（見圖1）對(duì)耐氧型菌株的獲取有非常重要的影響。DW-100A-K智能厭氧培養(yǎng)系統(tǒng)可精確、高效地實(shí)現(xiàn)氧氣濃度從0～15%的梯度控制，并實(shí)現(xiàn)厭氧與微需氧環(huán)境的轉(zhuǎn)化，從而增加耐氧型菌株陽(yáng)性率。

3 益生菌制劑的生產(chǎn)工藝優(yōu)化和工藝質(zhì)控

在微生態(tài)理論指導(dǎo)下，采用已知的有益微生物，經(jīng)培養(yǎng)、發(fā)酵、干燥等特殊工藝制成的生物制劑或活菌制劑被稱為益生菌制劑。優(yōu)質(zhì)的微生態(tài)制劑應(yīng)具備如下標(biāo)準(zhǔn)：

①活菌量應(yīng)達(dá)到107～1010個(gè)/g；

②菌株應(yīng)穩(wěn)定、安全、可靠；

③菌株能在腸道內(nèi)存活、繁殖，且具有抗環(huán)境變化的能力；

④制劑應(yīng)能長(zhǎng)期儲(chǔ)存，且在有效期內(nèi)不低于標(biāo)示的活菌數(shù)。

以益生菌產(chǎn)品生產(chǎn)為例，生產(chǎn)過(guò)程主要由種子培養(yǎng)、投料接種、大罐發(fā)酵、菌液處理與凍干、益生菌產(chǎn)品的穩(wěn)定性評(píng)價(jià)五大基本步驟組成。在此過(guò)程中，接種量、氧氣濃度、培養(yǎng)溫度是保證益生菌產(chǎn)品品質(zhì)的重要影響因素，因此采用智能厭氧培養(yǎng)系統(tǒng)可精準(zhǔn)實(shí)現(xiàn)各種微生物的生長(zhǎng)環(huán)境，更好地確定加工流程與加工條件，確定產(chǎn)品加工過(guò)程中的質(zhì)控點(diǎn)與要求，以保證產(chǎn)品品質(zhì)。同時(shí)，該系統(tǒng)可同步實(shí)現(xiàn)在相同環(huán)境條件下的不同溫度加速試驗(yàn)，從而更準(zhǔn)確地對(duì)產(chǎn)品進(jìn)行穩(wěn)定性評(píng)價(jià)。

圖2 多種培養(yǎng)環(huán)境平行研究實(shí)驗(yàn)示意圖

4 微生物培養(yǎng)組學(xué)（culturomics）研究領(lǐng)域

近年來(lái)，隨著宏基因組技術(shù)的發(fā)展，人們對(duì)腸道菌群的菌群結(jié)構(gòu)和功能的認(rèn)識(shí)不斷加深，但是對(duì)原核生物的純培養(yǎng)卻逐漸被忽視，而純培養(yǎng)對(duì)于闡明這些微生物的功能和分離潛在益生菌而言是不可或缺的。因此，通過(guò)培養(yǎng)組學(xué)（culturomics）技術(shù)培養(yǎng)人體腸道菌群中從前無(wú)法培養(yǎng)的細(xì)菌受到科學(xué)界的廣泛關(guān)注。培養(yǎng)組學(xué)使用多種培養(yǎng)條件促進(jìn)較難培養(yǎng)的菌株生長(zhǎng)，結(jié)合MALDI-TOF質(zhì)譜和16S rRNA測(cè)序等技術(shù)，以鑒定細(xì)菌等微生物；通過(guò)利用培養(yǎng)組學(xué)，至少被分離一次的腸道物種增加了一倍。近年來(lái)，培養(yǎng)組學(xué)的應(yīng)用不僅使可培養(yǎng)的人體細(xì)菌增加了幾百種，其還能用于分離潛在的益生菌，是研究細(xì)菌療法的基礎(chǔ)。利用DW-100A-K智能厭氧培養(yǎng)系統(tǒng)的多種培養(yǎng)環(huán)境平行研究（同時(shí)生成：多種氣體、多種濃度、多種溫度可選；靈活：多種罐體，獨(dú)立培養(yǎng)，避免交叉污染）的能力（如圖2），并結(jié)合多種培養(yǎng)基組合，將有助于提升培養(yǎng)組學(xué)技術(shù)平臺(tái)的多重培養(yǎng)分離能力。

5 中藥類保健食品成分的腸內(nèi)生物轉(zhuǎn)化研究領(lǐng)域

生物轉(zhuǎn)化技術(shù)是指通過(guò)應(yīng)用植物細(xì)胞、微生物或酶等生物體系對(duì)天然活性化合物進(jìn)行合成與結(jié)構(gòu)修飾的過(guò)程，進(jìn)而起到增效減毒、產(chǎn)生活性成分等作用。該技術(shù)是開發(fā)中藥及中藥類保健食品的有效途徑。

研究表明，在人和動(dòng)物腸內(nèi)菌叢中約99%是厭氧性細(xì)菌，利用微生物智能厭氧系統(tǒng)可模擬人腸內(nèi)厭氧條件和菌叢組成，大量培養(yǎng)人體腸內(nèi)厭氧性細(xì)菌，并將酶與保健食品中的中藥類成分在37℃厭氧條件下共溫培養(yǎng)，可實(shí)現(xiàn)生物轉(zhuǎn)化過(guò)程。與此同時(shí)，通過(guò)建立相應(yīng)的轉(zhuǎn)化模型和標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程，并結(jié)合轉(zhuǎn)化產(chǎn)物與原形化合物的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，還可推斷轉(zhuǎn)化機(jī)制，有利于尋找、合成有活性的天然產(chǎn)物及其衍生物，以對(duì)其進(jìn)行深入的研究。

6 腸道微生物體外模型研究領(lǐng)域

在目前的研究過(guò)程中，建立合理且易操作的腸道微生物體外模型對(duì)推動(dòng)腸道微生態(tài)學(xué)、人體和動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)的發(fā)展意義非凡。采用DW-100A-K智能厭氧培養(yǎng)系統(tǒng)，可根據(jù)胃、小腸、升結(jié)腸、橫結(jié)腸等腸道部位的溫度、氧氣濃度、pH值等條件特點(diǎn)，在不同的獨(dú)立培養(yǎng)罐中分別構(gòu)建腸道微生物體外研究模型，因而更好地模擬腸道和研究外界因素（如益生菌、益生元等）對(duì)腸道微生物菌群的影響。同時(shí)，由于該系統(tǒng)提供精準(zhǔn)的平行研究平臺(tái)，最大程度保證了條件的一致性，通過(guò)連續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)，將各模型進(jìn)行整合，可幫助尋找出最佳的培養(yǎng)篩選條件，以實(shí)現(xiàn)對(duì)不同腸道段中微生物的靶向培養(yǎng)分離。