表面外胚層敲除Mfn2基因?qū)π∈笱垡暰W(wǎng)膜發(fā)育的影響

張帆，張嬌，李函容，嚴肖嘯，趙江月

（中國醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院眼科，中國醫(yī)科大學(xué)眼科醫(yī)院，遼寧省晶狀體學(xué)重點實驗室，沈陽 110005）

線粒體融合蛋白2（mitofusin 2，Mfn2）是介導(dǎo)線粒體融合的蛋白質(zhì)之一，是調(diào)節(jié)線粒體運動、呼吸活動等生理活動的關(guān)鍵分子。Mfn2基因的缺失有可能會引發(fā)mtDNA功能障礙，從而導(dǎo)致線粒體氧化磷酸化功能受到間接影響，從而中斷呼吸鏈，促進更多細胞內(nèi)活性氧出現(xiàn)，細胞凋亡由此發(fā)生。研究［1］發(fā)現(xiàn)，表面外胚層Mfn2功能的條件性喪失導(dǎo)致一系列先天性眼缺陷，包括眼球及晶狀體體積減小，晶狀體渾濁和角膜增厚。而眼組織的發(fā)育源于神經(jīng)外胚葉、表皮外胚葉和中胚葉，發(fā)育過程復(fù)雜，存在各組織間的相互作用，如晶狀體對視網(wǎng)膜發(fā)育的誘導(dǎo)［2］。由于這種誘導(dǎo)關(guān)系的存在，筆者猜測Mfn2基因?qū)σ暰W(wǎng)膜的發(fā)育同樣存在影響。

各種原因引起的視網(wǎng)膜細胞凋亡是視網(wǎng)膜疾病中視覺喪失的根本原因［3］，如視網(wǎng)膜色素變性、年齡相關(guān)性黃斑變性、糖尿病性視網(wǎng)膜病變和視網(wǎng)膜脫離等。視網(wǎng)膜中色素上皮層以及光感受器細胞層具有高代謝活性，而氧化損傷引起的視網(wǎng)膜代謝功能障礙是導(dǎo)致年齡相關(guān)性視網(wǎng)膜疾病中視覺衰退甚至喪失的主要原因［4］。已有研究表明參與線粒體融合和分裂的蛋白也廣泛參與細胞過程，如線粒體代謝、氧化還原信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，維持mtDNA完整性和細胞死亡。因此，對視網(wǎng)膜發(fā)育過程中線粒體相關(guān)的調(diào)控機制進行研究具有重要意義和價值。

本研究觀察了Mfn2基因在小鼠視網(wǎng)膜中的表達情況以及Mfn2對小鼠晶狀體視網(wǎng)膜發(fā)育間相互誘導(dǎo)的影響，為今后研究線粒體與視網(wǎng)膜變性疾病的關(guān)系提供了新的思路。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

所有動物實驗均經(jīng)中國醫(yī)科大學(xué)倫理委員會（16005M）批準，動物實驗按照《動物使用與護理指南》進行。Le-Cre轉(zhuǎn)基因小鼠和Mfn2等位基因小鼠由中國醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供。所有動物均飼養(yǎng)于SPF環(huán)境中，12 h光/暗周期和溫度控制。在Pax6啟動子的控制下表達Le-Cre重組酶的轉(zhuǎn)基因小鼠與Mfn2轉(zhuǎn)基因小鼠進行交配，并再次對攜帶Le-Cre+/-；Mfn2fl/fl基因的雄鼠與Mfn2fl/fl的雌鼠交配，將子代中Le-Cre+/-；Mfn2fl/fl（Mfn2CKO）和Mfn2fl/fl（Mfn2WT）鼠分別設(shè)為實驗組與對照組。

1.2 實驗動物基因型的測定

剪取同窩實驗組及對照組小鼠鼠尾，放入裂解液中裂解并提取DNA，行PCR 擴增，擴增條件為94℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，退火30 s，72 ℃延伸45 s，經(jīng)歷30個循環(huán)，72 ℃后延伸10 min，4 ℃保存。配制濃度為1.5%瓊脂糖凝膠，電泳時間20 min，電壓140 V，待電泳結(jié)束后使用凝膠呈像分析系統(tǒng)照相。

1.3 HE染色實驗檢測小鼠眼部形態(tài)發(fā)育

分別在4 ℃下用4%多聚甲醛固定2組小鼠的胚胎頭或出生后眼，分別用50%、75%、85%、95%和100%乙醇梯度脫水2 h。石蠟包埋，組織切片機4 mm切片。經(jīng)HE染色后，中性樹脂封片，光學(xué)顯微鏡采集圖像。

1.4 免疫熒光方法觀察Mfn2在小鼠視網(wǎng)膜中的定位

將石蠟切片依次置于50 ℃二甲苯（2 次，5 min/次）、無水乙醇5 min、95%乙醇5 min、85%乙醇5 min、75%乙醇5 min以及50%乙醇5 min；PBS清洗3次（5 min/次）；將切片置入加熱至沸騰的pH6.0、0.1 mol/L枸櫞酸抗原修復(fù)液中，用微波爐使枸櫞酸液沸騰維持10 min，待其冷卻至室溫；BSA室溫封閉l h；加入兔抗鼠Mfn2一抗（1∶200稀釋），4 ℃孵育過夜；PBS清洗3次（5 min/次）；滴加山羊抗兔熒光二抗（1∶500 稀釋），室溫下避光孵育l h；PBS清洗3次（5 min/次）；DAPI（1 ∶1 000稀釋）復(fù)染l min；PBS清洗3次（5 min/次）；防淬滅封片劑封片，熒光顯微鏡照相。

1.5 免疫熒光方法觀察Mfn2基因條件敲除小鼠角膜BrdU標(biāo)記變化

取E14.5、E17.5、E18.5胎齡小鼠行BrdU腹腔注射（100 mg/kg），1 h后處死，制備石蠟切片。依次置于50 ℃二甲苯（2次，5 min/次）、無水乙醇5 min、95%乙醇5 min、85%乙醇5 min、75%乙醇5 min以及50%乙醇5 min；PBS清洗3次（5 min/次）；加入稀鹽酸37℃孵育30 min；加入0.1 mol/L四硼酸鈉，37 ℃下孵育10 min；PBS清洗3次（5 min/次）；BSA 室溫封閉l h；加入兔抗鼠 Mfn2一抗（1∶200稀釋），4 ℃孵育過夜；37 ℃輕搖后，轉(zhuǎn)入4 ℃過夜；37 ℃復(fù)溫1 h；PBS清洗3次（5 min/次）；滴加山羊抗兔熒光二抗（1∶500 稀釋），室溫下避光孵育l h；PBS清洗3次（5 min/次）；DAPI復(fù)染l min；PBS清洗3次（5 min/次）；防淬滅封片劑封片，熒光顯微鏡照相。

1.6 TUNEL法檢測小鼠角膜在胚胎期及生后的凋亡情況

將制備好的石蠟切片在60 ℃烤片機上烤片1 h，然后脫蠟水化：依次置于50 ℃二甲苯（2次，5 min/次）、無水乙醇5 min、95%乙醇5 min、85%乙醇5 min、75%乙醇5 min以及50%乙醇5 min；蛋白酶K 37℃消化20 min；1×PBS清洗3次（5 min/次）；5 μL TdT酶+45 μL熒光標(biāo)記液的混合液中避光孵育l h；PBS清洗3次（5 min/次）；DAPI復(fù)染l min；PBS清洗3次（5 min/次）；防淬滅封片劑封片，熒光顯微鏡照相。

2 結(jié)果

2.1 Mfn2基因在視網(wǎng)膜中的表達位置

視網(wǎng)膜在小鼠出生后20 d左右發(fā)育成熟。為了探究Mfn2基因在視網(wǎng)膜中的表達位置，本研究選取P20的野生型小鼠進行免疫熒光檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Mfn2基因在成熟視網(wǎng)膜中定位于視網(wǎng)膜光感受器外節(jié)。見圖1。

2.2 表面外胚層Mfn2基因條件性敲除導(dǎo)致眼球結(jié)構(gòu)發(fā)育異常

取同窩的實驗組與對照組小鼠進行HE染色，結(jié)果顯示，在E15.5至E17.5期間，實驗組小鼠的眼球體積較對照組小，視網(wǎng)膜厚度不均勻，局部有增厚現(xiàn)象。至生后18 d時，實驗組小鼠眼球體積較小，視網(wǎng)膜較對照組厚度增加。見圖2。

圖1 Mfn2基因在小鼠成熟視網(wǎng)膜中的表達 ×200Fig.1 Expression of Mfn2 gene in mature retina of mice ×200

2.3 Mfn2 CKO鼠與Mfn2 WT鼠視網(wǎng)膜細胞增殖差異

為了研究Mfn2基因條件性敲除后對視網(wǎng)膜細胞增殖的影響，本研究選取胚胎時期E14.5、E17.5及E18.5的實驗組及對照組鼠進行BrdU實驗。結(jié)果顯示，E14.5時，實驗組及對照組小鼠視網(wǎng)膜均有明顯細胞增殖且無顯著差異；E17.5時，實驗組視網(wǎng)膜細胞增殖數(shù)較對照組視網(wǎng)膜細胞增殖數(shù)明顯減少；E18.5時，2組視網(wǎng)膜細胞增殖數(shù)均明顯減少。見圖3。

2.4 Mfn2 CKO鼠與Mfn2 WT鼠視網(wǎng)膜細胞凋亡差異

圖2 Mfn2 CKO小鼠視網(wǎng)膜發(fā)育異常 HE染色Fig.2 Abnormal retinal development in Mfn2 CKO mice HE staining

圖3 Mfn2 CKO小鼠視網(wǎng)膜細胞增殖情況變化 ×100Fig.3 Proliferation changes of retinal cells in Mfn2 CKO mice ×100

為了探究實驗組與對照組小鼠視網(wǎng)膜細胞凋亡情況的變化，本研究分別選取E17.5、P5及P20的小鼠進行TUNEL檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，E17.5時實驗組與對照組小鼠視網(wǎng)膜細胞凋亡數(shù)（7±1.57，4±1.61）均較少，但P5及P20時，2組小鼠視網(wǎng)膜凋亡細胞數(shù)均明顯增加，且實驗組凋亡數(shù)多于對照組（P5：實驗組98±2.97，對照組74±2.86；P20：實驗組33±1.57，對照組14±1.81）。見圖4。

圖4 Mfn2 CKO小鼠視網(wǎng)膜細胞凋亡情況變化Fig.4 Apoptosis changes of retinal cells in Mfn2 CKO mice

3 討論

視網(wǎng)膜的發(fā)育受多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑及細胞因子的影響，如Notch信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，hedgehog信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，以及表皮生長因子（epidermal growth factors，EGFs）、成纖維細胞生長因子（fibroblast growth factors，F(xiàn)GFs）、神經(jīng)生長因子（nerve growth factors，NGF）等。它們在特定的時空條件下，通過復(fù)雜的細胞間相互作用，激活細胞內(nèi)信號級聯(lián)反應(yīng)，最終引起相關(guān)基因（如Pax6，Ras，BMP，Eya，Prox1，Vax，Nogo等）表達，從而影響視網(wǎng)膜的發(fā)育、分化和增殖。而影響視網(wǎng)膜發(fā)育的某些基因，如Pax6、BMP，也同樣存在于眼部其他組織［5］。

Mfn2是含757個氨基酸、具有三磷酸鳥苷（guanosine triphosphate，GTP）酶活性的線粒體外膜蛋白，它與Mfn1共同參與線粒體外膜融合［6］。研究［7］表明，線粒體融合和裂變對于細胞存活和凋亡具有重要意義。其中關(guān)于細胞凋亡的研究表明，Bcl-2家族成員（Bax，Bak，Bcl-2 和 Bcl-xL）和線粒體形態(tài)發(fā)生相關(guān)蛋白（Mfn1，Mfn2，Drp1和Fis1）有直接關(guān)系。本研究采用基于Cre/LoxP系統(tǒng)的條件性基因打靶技術(shù)構(gòu)建表面外胚層Mfn2基因條件性敲除小鼠，通過將特異啟動子控制表達位置的Cre重組酶的轉(zhuǎn)基因小鼠Le-Cre與Mfn2條件性基因打靶小鼠（Mfn2flox/flox）交配，將子代中Le-Cre+/-；Mfn2fl/fl（Mfn2CKO）和Mfn2fl/fl（Mfn2 WT）小鼠分別作為實驗組與對照組進行研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Mfn2表面外胚層條件性基因敲除小鼠不僅在晶狀體發(fā)育中存在嚴重缺陷，且在胚胎期發(fā)育中，視網(wǎng)膜各層厚度不均，細胞增殖數(shù)減少，細胞凋亡增加。

本研究在表面外胚層條件性敲除Mfn2基因，導(dǎo)致視網(wǎng)膜發(fā)育受到影響，其原因涉及眼胚胎發(fā)育過程中存在胚胎誘導(dǎo)，即胚胎發(fā)育中2種胚胎組織通過相互作用對其中1種或2種組織的形態(tài)發(fā)生產(chǎn)生影響［8］。Mfn2缺失和線粒體動力學(xué)其他組分的潛在下降不僅阻礙線粒體形成，也能造成代謝和氧化還原穩(wěn)態(tài)的惡化，增加應(yīng)激誘導(dǎo)的突變和凋亡，使視網(wǎng)膜細胞的增殖與凋亡發(fā)生改變，同時猜測Mfn2基因的缺失會間接影響與眼發(fā)育相關(guān)的其他基因的表達，這些基因同時表達于表面外胚層和神經(jīng)外胚層，通過晶狀體視網(wǎng)膜間的胚胎誘導(dǎo)作用，導(dǎo)致視網(wǎng)膜的發(fā)育異常和視網(wǎng)膜細胞的增殖凋亡改變。而視網(wǎng)膜變性疾病是一組由于視網(wǎng)膜感光細胞變性凋亡所導(dǎo)致的嚴重致盲性眼病，動物視網(wǎng)膜變性的發(fā)病機制與人類的視網(wǎng)膜變性疾病有某些同源性。研究者普遍認為，視網(wǎng)膜老化及視網(wǎng)膜變性（年齡相關(guān)性）的基本因素為氧化應(yīng)激和視網(wǎng)膜老化［9］。因此，對Mfn2的研究為視網(wǎng)膜的發(fā)育以及視網(wǎng)膜變性疾病提供了新的研究靶點。本研究是利用表面外胚層條件性基因敲除小鼠進行視網(wǎng)膜發(fā)育的表型觀察，未來將利用神經(jīng)外胚層條件基因敲除小鼠進一步觀察Mfn2對視網(wǎng)膜發(fā)育的直接影響。