載脂蛋白E基因多態(tài)性和腦淀粉樣血管病相關腦出血的臨床相關性研究

李樹志 周軍 趙月明 岳修臣 孫許林 趙鵬 劉杰 張鵬

自發(fā)性顱內(nèi)出血（非創(chuàng)傷性腦出血和蛛網(wǎng)膜下腔出血），是一種嚴重的腦卒中，常常會導致超過50%的病例死亡或嚴重殘疾，出血的主要形式包括高血壓引起的腦出血（hypertensive intracranial hemorrhage HICH）、腦淀粉樣血管?。╟erebral amyloid angiopathy，CAA）相關腦出血（CAA-related hemorrhage，CAAH）[1]。

已有研究表明載脂蛋白E（apolipoprotein E，APOE）的基因多態(tài)性與CAAH的發(fā)生有關，但迄今的研究結果并不一致，仍存在爭論。Greenberg等[2]發(fā)現(xiàn)，CAAH患者的ε4等位基因頻率明顯高于深部腦出血患者或正常非癡呆人群。然而，另外一些學者發(fā)現(xiàn)，ε2等位基因在CAAH患者中頻率較高[3]。2014年發(fā)表的一項 Meta分析顯示，ε4等位基因與CAAH發(fā)病有明顯關聯(lián)性，而ε2等位基因經(jīng)統(tǒng)計學分析無明顯相關性[4]。本研究通過比較分析137例患者APOE等位基因的頻率，以進一步明確APOE等位基因和CAAH的相關性，現(xiàn)報道如下。

資料與方法

一、一般資料

選取高密市人民醫(yī)院神經(jīng)外科自2015年3月至2018年1月收治的87例腦出血患者為研究對象，其中術后病理支持的、可能與CAA相關的腦出血患者36例（CAAH組），同期原發(fā)性HICH患者51例（HICH組）。選取同期門診非心腦血管疾病健康體檢者50例為對照組。分組情況：（1）CAAH組：符合Greenberg等[2]制定的CAAH診斷標準。其中男性13例，女性 23例，年齡范圍 56～97歲，年齡（72.3±5.9）歲；（2）HICH 組：符合 1995 年中國腦出血診治指南[5]。其中男性20例，女性31例，年齡范圍36～80歲，年齡（61.1±4.9）歲；（3）對照組：男性 19 例，女性31 例，年齡范圍 35～78 歲，年齡（55.0±6.2）歲。3 組患者的性別、年齡比較差異無統(tǒng)計學意義（P＜0.05），具有可比性。所有研究對象均由患者或家屬簽署知情同意書。排除標準：外傷、腫瘤、藥物、血液病所致的腦出血者；自發(fā)性蛛網(wǎng)膜下腔出血；靜脈竇血栓、動靜脈畸形；合并有肝腎、造血系統(tǒng)和內(nèi)分泌系統(tǒng)等嚴重原發(fā)性疾??；合并阿爾茨海默病者。

二、方法

用低滲紅細胞裂解法、白細胞沉降法、洗滌劑和蛋白酶K法從全血中提取基因組DNA[6]。通過PCR擴增已知引物序列的227 bp區(qū)（上游：5’TCCAAGG AGCTGGGCGGCG3’； 下游：5’ACGAATTCCCGCCG CCTGGGTACACTGCC3’），以鑒定APOE等位異構體。該區(qū)域位于該基因的第4外顯子，其中包括密碼子 112（核苷酸 3745）和 158（核苷酸 3883），并具有此多態(tài)性[7]。采用限制性內(nèi)切酶CFOI切割擴增ε，聚丙烯酰胺凝膠電泳分析，以鑒定APOEε3（Cys-112，Arg-158）、APOEε4 （Arg-112，Arg-158） 和APOEε2（Cys-112，Cys-158）。

等位基因頻率采用平衡法：ε2=APOEε2/2+1/2（APOEε2/3+APOEε2/4）；ε3=APOEε3/3+1/2（APOEε2/3+APOEε3/4）；ε4=APOEε4/4+1/2（APOEε3/4+APOEε2/2）。

三、統(tǒng)計學分析

計算各組基因型頻率及等位基因頻率，符合Hardy-Weinberg遺傳平衡法則，應用SPSS17.0軟件進行統(tǒng)計學處理，各研究組之間APOE等位基因的類型和頻率以率（%）表示，采用χ2檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

各組之間的基因型頻率見表1。3組研究結果顯示，APOEε3/ε3 基因頻率最高， 分別為 39%、45%、52%；含 ε3 的雜合子（APOEε3/ε4 和APOEε2/ε3）居中 ；APOEε2/ε2、APOEε4/ε4 和APOEε2/ε4 基 因 型頻率最低。CAAH組患者ε2頻率高于HICH組和對照組，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；3 組的 ε3、ε4等位基因差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）（表 2）。在CAAH組中，有11例患者為多發(fā)腦葉出血，其ε2頻率高于單發(fā)腦葉的患者，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）（表 3）。

表1 載脂蛋白E基因型和等位基因在不同顱內(nèi)出血組和對照組中的分布[例（%）]

表2 不同組別之間等位基因對比分析

表3 等位基因在單發(fā)和多發(fā)腦淀粉樣血管病相關腦出血患者中的分布

討 論

CAA的特點是淀粉樣蛋白（最常見的是β樣淀粉蛋白）沉積在腦內(nèi)和軟腦膜血管中，很長一段時間內(nèi)，人們并不確定其臨床意義。1909年，Oppenheim[8]首次說明阿爾茨海默病的病理改變與中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的血管淀粉樣沉積有關。隨后，Okazaki等[9]于1954年和1979年分別描述了CAA的臨床和組織學特征，明確了CAA與腦出血存在密切關聯(lián)。同時一些學者發(fā)現(xiàn)，隨著年齡的增長，CAAH的風險不斷增大，65～74歲為 2.3%，75～84歲為 8.0%，85歲以上者為12.1%[10]。

在病理學研究中，淀粉樣蛋白在血管壁的沉積是CAA的顯著特征。這種蛋白沉積可導致進行性血管病變，最常見的臨床表現(xiàn)為CAAH，這也是CAA導致死亡的最常見原因[11]。CAA相關腦血管破裂的機制尚不清楚，但可能涉及血管壁的順應性降低、破裂和弱化，導致局灶性壁碎裂和內(nèi)膜損傷。這些過程可能導致微量血液外溢，導致亞臨床點狀出血（腦微出血），或有臨床癥狀的腦葉出血[12]。

APOE是一種含有299個氨基酸的單鏈多態(tài)糖蛋白，是血漿脂蛋白的重要組成部分，參與其轉運和代謝過程。APOE基因呈多態(tài)性改變，以ε2、ε3和ε4等位基因形式存在，可存在 6 種基因型（ε2/ε2、ε2/ε3、ε2/ε4、ε3/ε3、ε3/ε4 和 ε4/ε4），ε3 在人類群體中的基因頻率最高，出現(xiàn)在1/2～2/3的人群中，因此ε2和ε4被稱為突變型[13]。

流行病學研究表明，APOE基因是CAAH的主要危險遺傳因素[14]。APOE基因多態(tài)性不僅對腦出血的發(fā)生風險有重要的預測作用，而且還與腦出血的嚴重程度有關。Biffi等[15]研究發(fā)現(xiàn)ε2可能與血管改變有關，在影響腦葉出血的嚴重程度和臨床進程中起著重要作用，可增加患者預后不良和死亡的幾率，但與深部腦出血之間沒有明確關聯(lián)。O’Donnell等[16]研究發(fā)現(xiàn)APOE等位基因型為腦葉出血復發(fā)的危險因素。一些學者研究CAAH的數(shù)據(jù)顯示，ε4等位基因頻率與健康體檢組及其他出血組之間差異無統(tǒng)計學意義[17]。

本研究結果表明APOEε2等位基因與CAAH有密切聯(lián)系，而HICH組和對照組的APOEε2等位基因頻率差異無統(tǒng)計學意義。目前還不清楚ε2參與CAAH的具體原理機制，可能與APOE和A肽相互作用并影響其聚集和清除能力有關，有學者曾指出，CAAH患者與CAA無出血患者之間的主要區(qū)別是出血患者中存在特定的 “CAA相關的血管病變”[18,19]。擁有ε2可能會導致淀粉樣血管病變的發(fā)生，CAAH組和HICH組患者進行了APOE等位基因型的檢測，結果顯示，與ε4相比，ε2等位基因的存在使腦葉出血患者的血腫體積增大，增加血腫擴大的風險。在臨床治療中，含有ε2基因型的患者腦出血的復發(fā)性和死亡率均較高。

CAAH常常發(fā)生在年齡較大的群體中，ε2等位基因頻率最高的群體（CAAH患者）也是年齡最大的群體（平均年齡72.3歲）[20]。這一觀點與本研究結論相同。Cauley等[21]調查顯示，在870例年齡為65～90歲的婦女中，ε2頻率為8.4%，而473例42～50歲的婦女為5.9%，同時發(fā)現(xiàn)，在年齡較大的患者中ε4頻率較低。

綜上所述，APOE等位基因與CAAH有著強烈而特異的聯(lián)系，這一關聯(lián)可能揭示了淀粉樣血管破裂的病理生理機制。CAAH的臨床診斷仍然是一個挑戰(zhàn)，尤其在神經(jīng)影像學顯示沒有微出血的情況下，雖然目前APOE基因型的檢測在CAA診斷中尚沒有明確的作用，但其與CAAH的關系有許多潛在的臨床意義，值得臨床工作者重視。