β-TrCP1和HAUSP影響膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖和侵襲并調(diào)控UHRF1蛋白水平

李玉輝 趙喜慶 陸麗娟 劉艷坤 劉巖 胡萬寧 李玉鳳

神經(jīng)膠質(zhì)瘤是常見的顱內(nèi)原發(fā)腫瘤，膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（glioblastoma，GBM）是惡性度最高的膠質(zhì)瘤。由于GBM細(xì)胞增殖快且多呈侵襲性生長，手術(shù)很難將腫瘤組織全部切除，這是GBM容易復(fù)發(fā)的主要原因。進(jìn)一步闡明GBM細(xì)胞增殖和侵襲性生長的分子機(jī)制可為臨床治療提供新思路。有研究發(fā)現(xiàn)β-轉(zhuǎn)導(dǎo)重復(fù)相容蛋白（beta-transducin repeat-containing proteins，β-TrCP1）在正常腦組織中呈高表達(dá)，而在膠質(zhì)瘤中呈低表達(dá)，在惡性度較高的GBM中的表達(dá)水平低于惡性度較低的膠質(zhì)瘤[1]。提示β-TrCP1在膠質(zhì)瘤中可能起抑癌作用，但其對(duì)GBM細(xì)胞增殖和遷移能力的影響及機(jī)制尚不明。皰疹病毒相關(guān)性泛素特異性蛋白酶 （herpes associated ubiquitin specific proteas，HAUSP）在正常腦組織中不表達(dá)，隨著膠質(zhì)瘤惡性度的升高，其表達(dá)增加[2]。但UAHSP對(duì)GBM增殖和遷移能力的影響及機(jī)制尚不明。本研究通過在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤U87細(xì)胞系中分別過表達(dá)β-TrCP1和敲低HAUSP，分析了對(duì)細(xì)胞增殖、侵襲能力的影響，并分析了二者表達(dá)改變對(duì)表觀遺傳調(diào)控因子UHRF1（ubiquitin-like containing PHD ring finger）表達(dá)的影響，以期為GBM的發(fā)病機(jī)制提供表觀遺傳學(xué)依據(jù)，為GBM的臨床治療探索新的方向。

材料與方法

一、材料與試劑

膠質(zhì)母細(xì)胞瘤U87細(xì)胞購自北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院細(xì)胞資源中心。TRIzol總RNA提取試劑和逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國Invitrogen公司，SYBR Premix Ex Taq染料法熒光定量試劑盒購自日本TaKaRa公司，BCA蛋白濃度測定試劑盒購自美國Invitrogen公司，ECL顯影液購自河北博海生物工程開發(fā)有限公司。β-TrCP1小鼠抗人單克隆抗體購自美國RD公司（MAB7675），UHRF1兔抗人多克隆抗體購自SAB公司 （32666），HAUSP兔抗人多克隆抗體（ab4080）和GAPDH小鼠抗人單克隆抗體（ab9484）購自美國Abcam公司。

二、細(xì)胞培養(yǎng)

U87細(xì)胞培養(yǎng)于含有15%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基中，呈貼壁生長，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。

三、β-TrCP1質(zhì)粒與siRNA的設(shè)計(jì)、合成及轉(zhuǎn)染

委托北京吉瑪公司構(gòu)建N1-β-TrCP1過表達(dá)質(zhì)粒，將對(duì)數(shù)生長期的U87細(xì)胞接種于6孔板中，待細(xì)胞融合達(dá)到70%～80%時(shí)以Lipofectamine 2000為載體按照說明書分別將N1空質(zhì)粒及N1-β-TrCP1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至U87細(xì)胞。委托北京吉瑪公司體外化學(xué)合成靶向 HAUSP mRNA的小干擾 RNA（siRNA），siRNA的轉(zhuǎn)染步驟同β-TrCP1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染。

四、研究對(duì)象及分組

將轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤U87細(xì)胞分為N1空質(zhì)粒對(duì)照組（NC）及 N1-β-TrCP1質(zhì)粒組（β-TrCP1）；將轉(zhuǎn)染siRNA的U87細(xì)胞分為轉(zhuǎn)染無意義序列siRNA的對(duì)照組（si-NC）、轉(zhuǎn)染靶向HAUSPmRNA 的 siRNA-1 組（si-HAUSP-1）、si-HAUSP-2 組及si-HAUSP-3組。

五、實(shí)時(shí)熒光定量PCR

NC組、β-TrCP1組、si-NC 組和 si-HAUSP-1組、si-HAUSP-2組及si-HAUSP-3組U87細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染24 h后，采用TRIzol裂解液分別提取各組細(xì)胞總RNA，Thermo超微量紫外分光光度計(jì)測定RNA濃度和質(zhì)量。取2 μg RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，具體步驟參照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒。實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-qPCR）反應(yīng)在Thermo RT-qPCR儀上進(jìn)行。引物由北京吉瑪公司合成。 β-TrCP1、HAUSP、UHRF1、β-actin的引物序列見表1。β-actin為內(nèi)參，每個(gè)反應(yīng)設(shè)3個(gè)復(fù)孔，各個(gè)基因的反應(yīng)程序均為：94℃ 3 min，94℃30 s，58℃ 30 s，72℃ 30 s，40 個(gè)循環(huán)。 實(shí)驗(yàn)重復(fù) 3次，以2-△△Ct計(jì)算各基因mRNA相對(duì)表達(dá)水平。因si-HAUSP-2組中HAUSP mRNA下降最為顯著，后續(xù)實(shí)驗(yàn)均采用si-HAUSP-2（si-HAUSP組）。

表1 β-TrCP1、HAUSP、UHRF1、β-actin 的引物序列

六、Western blot檢測

NC組、β-TrCP1組、si-NC組和 si-HAUSP組U87細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染48 h后，分別消化并收集各組細(xì)胞，用磷酸鹽緩沖液清洗后，加入裂解液（150 mmol/L NaCl，2 mmol/L EDTA,50 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5，0.5%NP-40，含混合蛋白酶抑制劑）置于冰上，水平搖床裂解20 min。之后于4℃、12 000 r/min離心10 min（離心半徑5.5 cm），吸取蛋白上清置新的EP管中，用BCA試劑盒測定各組蛋白濃度。取40 μg蛋白樣品于100℃變性10 min，分別和各自對(duì)照組（NC組和 β-TrCP1組）、（si-NC 組和 si-HAUSP組）經(jīng)10%SDS-PAGE電泳將蛋白分離后轉(zhuǎn)移至PVDF膜，用5%脫脂牛奶室溫封閉1.5 h。NC組和β-TrCP1組蛋白印跡膜分別加入β-TrCP1抗體 （1∶500稀釋）、UHRF1 抗體（1∶500 稀釋）及 GAPDH 抗體（1∶1000稀釋）；si-NC組和si-HAUSP組蛋白印跡膜分別加入 HAUSP 抗體（1∶500 稀釋）、UHRF1 抗體（1∶500 稀釋）及 GAPDH 抗體 (1∶1000 稀釋)，4℃過夜孵育。 TBST緩沖液（50 mmol/L Tris-HCl、150 mmol/L NaCl、0.1%Tween 20，pH 7.4）洗膜 3 次，通用型二抗 37℃濕盒中孵育 45 min，TBST洗膜 3次，ECL顯影，Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)采集圖像進(jìn)行灰度值分析，以GAPDH為內(nèi)參。每組實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

七、CCK8法測定細(xì)胞增殖活性

U87細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h后消化計(jì)數(shù)，種入96孔板，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)，至第1、2、3、4和5天，每孔中加入CCK8溶液（10 μL/100 μL 培養(yǎng)基），繼續(xù)入培養(yǎng)箱培養(yǎng) 2 h。酶標(biāo)儀于450 nm波長處測定OD值。

八、基質(zhì)膠-transwell法測定細(xì)胞侵襲能力

U87細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后消化計(jì)數(shù)，將細(xì)胞離心棄上清，用opti-MEM培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，按每個(gè)transwell小室加入3×104個(gè)細(xì)胞將細(xì)胞懸液加入到鋪有基質(zhì)膠（matrigel）的transwell小室的上室，在下室中加入600 μL 20%DMEM培養(yǎng)基。置于37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h后分別用1∶3的冰乙酸,甲醇溶液固定，結(jié)晶紫染色，清水清洗并拍照。每孔隨機(jī)選擇上下左右及中間5個(gè)高倍視野。用Image J計(jì)數(shù)穿過膜的細(xì)胞數(shù)，以反應(yīng)細(xì)胞的侵襲能力。

九、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用 SPSS17.0軟件分析，RT-qPCR、Western blot及CCK-8和基質(zhì)膠-transwell的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。顯著性檢驗(yàn)水準(zhǔn)取雙側(cè)α=0.05。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、過表達(dá)β-TrCP1抑制U87細(xì)胞的增殖和侵襲能力

RT-qPCR法檢測結(jié)果顯示，β-TrCP1組細(xì)胞中β-TrCP1的mRNA水平顯著高于空質(zhì)粒NC組 （P＜0.01，圖 1A）。Western blot檢測結(jié)果顯示 β-TrCP1組細(xì)胞中β-TrCP1的蛋白水平顯著高于NC組 （P＜0.01，圖 1B）。

CCK8法檢測結(jié)果顯示，β-TrCP1組U87細(xì)胞在第4、5天的增殖能力顯著低于同時(shí)期的NC組細(xì)胞（均P＜0.05，圖 1C）。 基質(zhì)膠-transwell侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染第4天，β-TrCP1組U87細(xì)胞穿過鋪有基質(zhì)膠的基底膜的細(xì)胞數(shù)低于NC組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖 1D）。

二、敲低HAUSP抑制U87細(xì)胞的增殖和侵襲能力

RT-qPCR法檢測結(jié)果顯示，si-HAUSP-1組和si-HAUSP-2組U87細(xì)胞中HAUSPmRNA相對(duì)表達(dá)水平均顯著低于無意義序列對(duì)照（si-NC）組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），si-HAUSP-3 組 U87 細(xì)胞中HAUSPmRNA相對(duì)表達(dá)水平與si-NC組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（圖 2A）。后續(xù)實(shí)驗(yàn)均采用作用效果最明顯的 si-HAUSP-2（si-HAUSP組）。Western blot結(jié)果顯示，si-HAUSP組細(xì)胞中HAUSP蛋白水平顯著低于si-NC組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖 2B）。

圖1 過表達(dá)β-TrCP1對(duì)U87細(xì)胞增殖和侵襲能力影響

圖2 敲低HAUSP對(duì)U87細(xì)胞增殖和侵襲能力影響

CCK8法檢測結(jié)果顯示，si-HAUSP組細(xì)胞在第4天和第5天的增殖能力顯著低于同時(shí)期si-NC組細(xì)胞（均P＜0.05，圖 2C）。 基質(zhì)膠-transwell侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染第4天，si-HAUSP組細(xì)胞穿過鋪有基質(zhì)膠的基底膜的細(xì)胞數(shù)顯著低于si-NC組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖 2D）。

三、過表達(dá)β-TrCP1和敲低HAUSP均降低U87細(xì)胞中UHRF1的蛋白水平

RT-qPCR法檢測結(jié)果顯示，β-TrCP1組和NC組UHRF1mRNA水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，圖3A）。轉(zhuǎn)染48 h后Western blot結(jié)果顯示，β-TrCP1組細(xì)胞中UHRF1蛋白相對(duì)表達(dá)水平顯著低于NC組（P＜0.05，圖 3B）。 此外，RT-qPCR 法檢測結(jié)果顯示，si-HAUSP組和siNC組細(xì)胞中UHRF1mRNA相對(duì)表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，圖3C）。Western blot結(jié)果顯示，si-HAUSP組細(xì)胞中UHRF1蛋白相對(duì)表達(dá)水平顯著低于siNC組（P＜0.05，圖3D）。

討 論

泛素介導(dǎo)的蛋白酶體途徑是一個(gè)受到嚴(yán)格調(diào)控的特異性蛋白質(zhì)降解途徑。靶蛋白通過泛素激活酶E1、泛素偶聯(lián)酶E2和泛素連接酶E3的一系列作用與多個(gè)泛素共價(jià)結(jié)合后，被蛋白酶復(fù)合體識(shí)別并降解。泛素化/去泛素化的異?？蓪?dǎo)致細(xì)胞中高表達(dá)的癌基因蛋白不能及時(shí)從細(xì)胞中被降解清除，從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。

β-TrCP1作為一種E3泛素連接酶，可以識(shí)別并泛素化降解磷 酸化的 IκB、NF-κB、β-catenin、E-mil和Snail等蛋白發(fā)揮多種生物學(xué)功能[3,4]。本研究發(fā)現(xiàn)在U87細(xì)胞系中過表達(dá)β-TrCP1可以抑制細(xì)胞的增殖和侵襲能力，說明β-TrCP1在GBM中發(fā)揮抑癌作用。與Liang等[1]的報(bào)道一致，即β-TrCP1在膠質(zhì)瘤中表達(dá)水平越低，患者預(yù)后越差，在GBM中的表達(dá)最低。但在結(jié)直腸癌、胃癌、胰腺癌和乳腺癌中的研究發(fā)現(xiàn)β-TRCP1起促癌作用，與膠質(zhì)瘤中的作用相反[5-10]。這些結(jié)果說明β-TrCP1的表達(dá)和作用呈組織異質(zhì)性。

另一方面，HAUSP是泛素特異性修飾酶家族（ubiquitin specific processing enzymes，USP）成員之一，又稱USP7。HAUSP能催化水解泛素C-末端與靶蛋白間的肽鏈連接，使靶蛋白去泛素化，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、凋亡、DNA修復(fù)與腫瘤的發(fā)生發(fā)展[11]。本研究發(fā)現(xiàn)敲低去泛素化酶HAUSP也抑制GBM細(xì)胞的增殖和侵襲能力，說明HAUSP在GBM中起促癌作用。這可以從細(xì)胞學(xué)水平支持以往臨床組織中的報(bào)道，即HAUSP在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)高于正常腦組織，且在Ⅰ～Ⅳ級(jí)膠質(zhì)瘤中的表達(dá)逐漸增高[12,13]。GBM細(xì)胞中高表達(dá)的HAUSP蛋白穩(wěn)定E3泛素連接酶MDM2，后者泛素化腫瘤抑制因子視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤相關(guān)蛋白（retinoblastoma-associated protein，Rb）導(dǎo)致Rb蛋白降解，是導(dǎo)致GBM細(xì)胞高度惡性的原因之一[13]。結(jié)合本研究結(jié)果，可以推測GBM細(xì)胞中高表達(dá)的HAUSP可以直接或間接靶向多種腫瘤抑制因子發(fā)揮促癌作用。有研究表明HAUSP在前列腺癌、肝癌及乳腺癌組織中呈高表達(dá)，且其表達(dá)水平與惡性進(jìn)展呈正相關(guān)[14-17]。這些結(jié)果說明HAUSP在這些組織腫瘤中均起促癌作用。

圖3 過表達(dá)β-TrCP1或敲低HAUSP對(duì)U87細(xì)胞中UHRF1表達(dá)的影響

近年來的研究發(fā)現(xiàn)表觀遺傳調(diào)控因子UHRF1在包括膠質(zhì)瘤在內(nèi)的多種惡性腫瘤中呈高表達(dá)且與腫瘤的分級(jí)和預(yù)后相關(guān)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲[18,19]。蛋白水平的研究發(fā)現(xiàn)，β-TrCP1可與UHRF1的第1-282氨基酸位點(diǎn)結(jié)合，并使UHRF1的663賴氨酸位點(diǎn)發(fā)生泛素化而降解[20,21]。本研究發(fā)現(xiàn)過表達(dá)β-TrCP1和敲低HAUSP不影響UHRF1的mRNA水平，但可降低其蛋白水平。因此推測GBM細(xì)胞中UHRF1蛋白水平受泛素介導(dǎo)的蛋白酶體途徑調(diào)控，GBM中低表達(dá)的β-TrCP1及高表達(dá)的HAUSP導(dǎo)致UHRF1的蛋白水平升高，影響UHRF1下游參與調(diào)控細(xì)胞增殖和侵襲相關(guān)因子的表達(dá)，從而影響膠質(zhì)母細(xì)胞瘤增殖和遷移能力。

綜上所述，泛素化酶β-TrCP1負(fù)向調(diào)控膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的增殖和遷移能力，泛素化酶HAUSP正向調(diào)控膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的增殖和遷移能力，UHRF1蛋白穩(wěn)定性改變可能是原因之一。GBM中低表達(dá)的β-TrCP1以及高表達(dá)的HAUSP可導(dǎo)致UHRF1蛋白水平增高，繼而引起腫瘤抑制因子表觀遺傳修飾的改變而使之沉默，這是導(dǎo)致膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的增殖和侵襲能力增強(qiáng)的重要因素。過表達(dá)β-TrCP1和敲低HAUSP為抑制膠質(zhì)母細(xì)胞瘤增殖和侵襲提供了新思路。