循環(huán)腫瘤細胞數(shù)量的變化情況對HER 2陽性早期乳腺癌患者治療效果及預后的影響

呂勉，潘小明，王慧玲，黃永鴻，杜賢

廣西醫(yī)科大學第三附屬醫(yī)院/南寧市第二人民醫(yī)院1乳腺甲狀腺外科，2檢驗科，南寧530021

乳腺癌是一種較為常見的女性惡性腫瘤。手術(shù)是治療早期乳腺癌的常用手段，目前，仍有部分患者選擇采取此方案進行治療，但是，近年來，隨著對乳腺癌生物學特性認識的逐漸深入，制訂適合早期乳腺癌患者的個性化治療方案越來越受到重視。生長因子、激素受體、原癌基因及抑癌基因的產(chǎn)物是常見的腫瘤標志物，對腫瘤的治療具有輔助作用，且能夠預測腫瘤患者的預后情況。原癌基因——人表皮生長因子受體2（human epidermal growth factor receptor 2，HER2）的表達情況是影響乳腺癌患者預后的重要因素[1]。腫瘤轉(zhuǎn)移亦是影響腫瘤患者預后的主要因素。多項關(guān)于循環(huán)腫瘤細胞（circulating tumor cell，CTC）對腫瘤患者預后預測作用的研究得到了一致的結(jié)論，即檢測CTC對于監(jiān)測腫瘤細胞是否發(fā)生轉(zhuǎn)移具有重要的意義[2-4]。有研究認為，CTC可作為轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者預后的預測指標[5]。另外，CTC可作為早期乳腺癌患者化療療效的判斷指標，但臨床中多關(guān)注的是CTC對可行手術(shù)的乳腺癌患者的檢出率及相關(guān)特征，而對于乳腺癌患者治療前后CTC的變化情況并未進行進一步的觀察。因此，本研究選取166例HER2陽性早期乳腺癌患者作為研究對象，觀察接受化療聯(lián)合手術(shù)治療與接受化療聯(lián)合曲妥株單抗治療后患者外周血中CTC的檢出情況、細胞角蛋白19（cytokeratin-19，CK19）的表達水平，旨在為臨床診療HER-2陽性早期乳腺癌提供參考依據(jù)，現(xiàn)報道如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選取2015年1月至2018年1月廣西醫(yī)科大學第三附屬醫(yī)院/南寧市第二人民醫(yī)院收治的166例HER2陽性早期乳腺癌患者作為研究對象。納入標準：①經(jīng)術(shù)前穿刺病理學檢查診斷為乳腺癌；②穿刺組織免疫組織化學染色結(jié)果顯示HER2陽性；③TNM 分期為 T2～3N0～2M0期，且具有手術(shù)適應證；④無化療史。排除標準：①孕期或哺乳期婦女；②炎性乳腺癌；③依從性差；④中途退出研究。根據(jù)患者的病情和意愿選擇治療方案，根據(jù)治療方案的不同將患者分為手術(shù)組（n=68）和曲妥株單抗組（n=98）。手術(shù)組患者的年齡為33～59歲，平均年齡為（46.0±12.1）歲；病程為1.8～3.5年，平均病程為（2.4±0.5）年；患者均存在乳腺腫塊，其中，伴有皮膚改變者34例，伴有乳頭、乳暈異常者29例，伴有腋窩淋巴結(jié)腫大者47例；TNM分期：I期27例，Ⅱ期41例。曲妥珠單抗組患者的年齡為33～58歲，平均年齡為（46.0±11.9）歲；病程為1.8～2.7年，平均病程為（2.3±0.2）年；患者均存在乳腺腫塊，其中，伴有皮膚改變者49例，伴有乳頭、乳暈異常者45例，伴有腋窩淋巴結(jié)腫大者73例；TNM分期：I期45例，Ⅱ期53例。兩組患者的年齡、病程等基線特征比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），具有可比性?；颊呒凹覍倬鶎Ρ狙芯恐椴⒆栽负炇鹬橥鈺狙芯拷?jīng)過醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會審核批準。

1.2 方法

1.2.1 治療方法 兩組患者于進行曲妥珠單抗治療前或手術(shù)治療前均先進行化療。具體化療方案：多西他賽75 mg/m2，靜脈滴注，第1天；表柔比星90 mg/m2，靜脈滴注，第1天。兩組患者均以21天為1個化療周期，共連續(xù)化療6個周期。曲妥株單抗組患者于化療結(jié)束后1個月接受曲妥珠單抗治療，劑量為每周110 mg，靜脈注射，1周為一個治療周期，共連續(xù)治療52周。手術(shù)組患者于化療結(jié)束后1個月接受早期乳腺癌保乳手術(shù)治療。

1.2.2 主要試劑與儀器 血清RNA提取試劑盒購于Promega公司，ABI7500型實時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）儀購于上海巴玖實業(yè)有限公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒購于美國ABI公司。CK19引物由生工生物工程（上海）股份有限公司設(shè)計并合成。CK19的上游引物為5'-ATGCGAAGCCAATATGAGGT-3'，下游引 物 為5'-UAGTAACCTCGGACCTGCTCA-3'。內(nèi)參β-actin的上游引物為 5-'CCTRCCTGGGTATGGAATCCT-3'，下游引物為5'-GGAGCAATGATCTTGATCTY-3'。

1.2.3 CK19蛋白和CK19 mRNA檢測 分別于化療前、化療結(jié)束后1個月（未予以曲妥株單抗治療前）、手術(shù)或曲妥株單抗治療3個月后提取血清總RNA，將mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說明書進行操作。PCR總反應體系為25 μl，包括反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物 0.5 μl，SYBR Green PCR Master mix 12.5 μl，10 mmol/L的上下游引物混合物各0.5 μl，無菌焦碳酸二乙酯（diethyl pyrocarbonate，DEPC）水補至 25 μl。反應條件：50℃ 2 min，95℃10 min，94℃ 0.5 min，66℃ 1 min，共循環(huán)40次。加樣操作按照ABI7500 RT-PCR儀說明書進行操作。根據(jù)RT-PCR儀顯示的△CT值計算CK19mRNA的相對表達量。采用酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）法檢測兩組患者的外周血CK19水平。

1.2.4 CTC檢測 分別于化療前、化療結(jié)束后1個月、手術(shù)或曲妥株單抗治療3個月后抽取患者外周血7.5 ml，保存于CellSave管后于室溫條件下移送至實驗室進行血樣分析，此過程需在4天內(nèi)完成。具體操作步驟：將血樣移入錐形管（樣本量15 nl）中，并添加6.5 ml緩沖液與血樣混合均勻后離心10 min，離心速度為3000 r/min，離心半徑為15 cm，獲得離心后的樣本溶液待測（獲得樣本的1 h內(nèi)取液）。檢測使用Cell Search試劑盒（購于武漢默沙克生物科技公司）。將制備好的樣本應用Cell Tracks Auto prep系統(tǒng)進行處理，應用Cell Tracks AnalyzerⅡ分析儀對腫瘤細胞進行識別并計數(shù)，采用免疫熒光染色法對CTC進行檢測。標記物質(zhì)分別為細胞角蛋白抗體CK18、CK19，抗CD45抗體以及抗核抗體。對CTC檢測結(jié)果以及CK18、CK19陽性結(jié)果的確認和審查由兩位獨立的研究人員分別進行。

1.3 觀察指標

檢測兩組患者治療前后CTC數(shù)目的變化情況和相關(guān)腫瘤標志物CK19蛋白和CK19mRNA的表達水平，從而評價其對兩組患者治療效果和預后的影響。

1.4 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 19.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，組別比較采用t檢驗或重復測量方差分析；計數(shù)資料以例數(shù)和率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 CTC檢出率的比較

化療前，兩組患者的CTC檢出率均為100%?；熃Y(jié)束后1個月，兩組患者的CTC檢出率比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。治療3個月后，兩組患者的CTC的檢出率明顯低于本組化療結(jié)束后1個月，且手術(shù)組患者的CTC檢出率明顯低于曲妥珠單抗組患者，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。（表1）

表1 兩組患者不同時間點CTC檢出率的比較[ n（%）]

2.2 CTC檢出數(shù)目的比較

化療前和化療結(jié)束后1個月，兩組患者的CTC檢出數(shù)目比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。治療3個月后，兩組患者的CTC的檢出數(shù)目均明顯減少。治療3個月后，手術(shù)組患者的CTC檢出數(shù)目少于曲妥珠單抗組患者，差異有統(tǒng)計學意義（t=13.196，P＜0.05）。兩組患者的CTC檢出數(shù)目組間比較，差異有統(tǒng)計學意義（F組間=283.232，P組間＜0.01）；兩組患者不同時間點的CTC檢出數(shù)目比較，差異有統(tǒng)計學意義（F時間=189.256，P時間＜0.01）；兩組患者的CTC檢出數(shù)目在組間和時間方面存在交互作用（F時間×組間=78.199，P時間×組間＜0.01）。（表2）

2.3 CK19陽性檢出率的比較

治療3個月后，兩組患者的CK19陽性檢出率分別低于本組化療前，差異均有統(tǒng)計學意義（χ2=5.207、6.289，P＜0.05）?；熐?、化療結(jié)束后1個月和治療3個月后，兩組患者的CK19陽性檢出率比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。（表3）

表2 兩組患者不同時間點的CTC 檢出數(shù)目（±s）

表2 兩組患者不同時間點的CTC 檢出數(shù)目（±s）

組別曲妥珠單抗組（n=98）手術(shù)組（n=68）化療前81.66±48.65 79.29±39.85化療接受后1個月70.35±28.89 68.9±30.09治療3個月后23.35±8.17 11.19±3.38

表3 兩組患者不同時間點CK19陽性檢出率的比較[ n（%）]

2.4 CK19 mRNA表達水平的比較

治療3個月后，兩組患者的CK19mRNA表達水平明顯低于本組化療前，差異均有統(tǒng)計學意義（t=7.307、6.374，P＜0.01）?；熐?、化療結(jié)束后1個月和治療3個月后，兩組患者的CK19mRNA表達水平比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。兩組患者CK19mRNA的表達水平組間比較，差異無統(tǒng)計學意義（F組間=0.313，P組間＞0.05）；兩組患者不同時間點CK19mRNA的表達水平比較，差異無統(tǒng)計學意義（F時間=0.339，P時間＞0.05）；兩組患者的CK19mRNA的表達水平在組間和時間方面存在交互作用（F時間×組間=0.607，P時間×組間＞0.05）。（表4）

表4 兩組患者不同時間點的CK19 mRNA表達水平（± s）

表4 兩組患者不同時間點的CK19 mRNA表達水平（± s）

注：*與本組化療前比較，P＜0.05

化療前80.51±60.39 77.25±61.43化療結(jié)束后1個月53.60±40.77 51.55±41.98治療3個月后24.70±19.34*22.86±19.13*組別曲妥珠單抗組（n=98）手術(shù)組（n=68）

3 討論

研究表明，腫瘤直徑、HER2基因的表達情況、雄激素受體的狀態(tài)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況等多種因素均對乳腺癌患者的預后具有一定的影響[7]。施勇等[8]收集了167例腋窩淋巴結(jié)陰性≤1.0 cm乳腺癌患者的臨床資料，單因素分析結(jié)果顯示，發(fā)病年齡、HER2陽性率、腫瘤直徑、組織學分級、腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、雌激素受體表達水平、孕激素受體表達水平是影響乳腺癌患者5年生存率的因素。其中，無腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者的5年生存率為96.0%，HER2表達是乳腺癌患者5年生存率的主要影響因素。李凡周等[9]對218例T1期HER2陽性乳腺癌患者的預后情況進行分析，結(jié)果顯示，發(fā)生腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是T1期HER2陽性乳腺癌患者預后的獨立危險因素，抗HER2靶向治療可提高有脈管浸潤或存在腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者的3年無病生存率。

CK19表達于單層上皮的上皮細胞中，在組織或細胞中具有高度特異性分布的特點[10]，是檢測乳腺癌的重要標志物，是最常見的角蛋白之一，在腫瘤細胞中含量豐富。但是，在多數(shù)惡性腫瘤中，CK19在腫瘤早期有血行播散的現(xiàn)象[11]。因此，腫瘤患者外周血中是否存在CTC微轉(zhuǎn)移可以通過檢測CK19進行判斷。王蒙等[12]檢測了44例初治原發(fā)性女性乳腺癌患者和15例正常女性志愿者外周血中的CK19細胞，結(jié)果顯示，在正常女性健康志愿者中未檢測到CK19+細胞的表達，在33例原發(fā)性乳腺癌患者中可檢測到CK19+細胞的表達；循環(huán)腫瘤細胞的陽性率與臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)，即乳腺癌患者的臨床分期越晚，CTC的陽性率就越高；I期乳腺癌患者的外周血中亦檢測到了CK19+細胞，表明乳腺癌發(fā)病初期即已存在CTC。

CTC是從腫瘤原發(fā)灶或是腫瘤轉(zhuǎn)移灶脫落的一類腫瘤細胞，能夠通過生物學行為（上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化）遷移入血。CTC發(fā)生微轉(zhuǎn)移是腫瘤患者術(shù)后復發(fā)和轉(zhuǎn)移的重要影響因素[13-15]。研究發(fā)現(xiàn)，治療前，CTC在其他腫瘤患者外周血中的表達水平越高，患者的總生存率越低；治療后，腫瘤患者外周血中的CTC明顯減少，患者的預后較好[16-17]。吳君心等[16]檢測了67例鼻咽癌首診患者外周血中CTC的表達水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CTC在鼻咽癌患者外周血中的陽性率為59.7%，而健康志愿者的外周血中未檢測到CTC，并發(fā)現(xiàn)鼻咽癌患者外周血中CTC的表達水平與腫瘤N分期有關(guān)；而與外周血CTC陰性患者比較，外周血CTC陽性患者的N分期更晚，無進展生存期更短，提示外周血CTC陽性鼻咽癌患者的預后不良。

CTC可作為分析腫瘤患者腫瘤生物學特征的實時樣本，及時發(fā)現(xiàn)腫瘤患者的生物學變化，臨床醫(yī)師可根據(jù)其檢測結(jié)果及時調(diào)整治療方案，從而實現(xiàn)對患者的個體化治療。因此，CTC可作為預測化療或手術(shù)對腫瘤患者的治療效果的重要指標[18]，在為患者制訂個體化治療方案方面發(fā)揮著重要的作用。龔麗[19]對乳腺癌患者新輔助化療前后的外周血CTC進行了檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TNM分期為Ⅱ～Ⅲ期浸潤性乳腺癌患者外周血CK19的表達水平明顯高于健康志愿者和乳腺良性病變者，聯(lián)合檢測CK19和乳腺小黏蛋白（small breast epithelial mucin，SBEM）可明顯提高CTC的陽性檢出率（64.3%），而新輔助化療的總體有效率為62.5%，化療有效的患者外周血中CK19和SBEM的表達水平明顯降低，表明聯(lián)合檢測CK19和SBEM在乳腺癌患者外周血中的表達有助于提高對CTC的陽性檢出率；新輔助化療后，CTC的陽性表達率明顯降低，提示臨床可動態(tài)監(jiān)測CTC的表達以評價新輔助化療對外周血微轉(zhuǎn)移的腫瘤細胞的殺傷效果。另外，CTC的數(shù)目可作為轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者預后情況的觀察指標[19-21]。

對于轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者的預后情況，可采用CTC進行檢測并預測，與傳統(tǒng)的組織學檢測方法相比，其具有敏感度高、無創(chuàng)、動態(tài)監(jiān)測等多方面的優(yōu)勢。臨床中，在治療乳腺癌的過程中，傳統(tǒng)的影像學檢查在病變療效評價方面的價值依然得到一定的認可，但在不可進行測量的病變中卻無法對療效進行準確的判斷。此時，CTC檢測結(jié)果能夠提示患者的治療反應和預后情況，對療效具有更好的預測價值，進而取代傳統(tǒng)的影像學評價方法。CTC檢測還有望為研發(fā)轉(zhuǎn)移性乳腺癌新的治療靶點提供思路。王麗娟[21]為尋找乳腺癌早期診斷的敏感靶點，從基因分子生物學水平對CTC進行了研究，分析浸潤性乳腺癌患者外周血中CTC的計數(shù)情況與乳腺癌分子生物學特征的相關(guān)性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)移性或復發(fā)浸潤性乳腺癌患者的外周血CTC具有極高的特異性；CTC計數(shù)與乳腺癌的TNM分期有關(guān)，當CTC數(shù)量≥5時，乳腺癌發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移的可能性明顯增高，表明CTC計數(shù)可用于獨立評價乳腺癌的腫瘤分期、患者病情及其預后。因此，監(jiān)測CTC是對轉(zhuǎn)移性乳腺癌療效和預后評價的有效手段。張聚良等[22]對HER2陽性早期乳腺癌患者外周血CTC進行了檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，術(shù)前，HER2陽性的早期乳腺癌患者外周血CK19的表達均為陽性，而化療后，患者外周血CK19的陽性表達率明顯下降，表明早期乳腺癌患者的外周血CTC與HER2陽性表達密切相關(guān)。因此，CTC數(shù)目可作為療效的早期預測指標[23-25]。李世超[26]研究發(fā)現(xiàn)，可行手術(shù)的女性早期乳癌患者于手術(shù)前均可檢出存在CTC的表達，其中，部分患者提示存在發(fā)生血行轉(zhuǎn)移的風險；而行常規(guī)開放手術(shù)的患者發(fā)生血行轉(zhuǎn)移的風險較行腔鏡手術(shù)的患者高（P＜0.05；OR=2.79，95%CI：1.05～7.42）；外周血 CTC檢測結(jié)果為陰性的乳腺癌患者經(jīng)乳腺癌輔助治療后可以獲得更好的近期療效。

本研究中，在早期可行手術(shù)的HER2乳腺癌患者的外周血中均檢測到CTC的表達。治療后，兩組患者的CTC檢出率和檢出數(shù)目均降低，且手術(shù)組患者的治療效果優(yōu)于曲妥株單抗組患者（P＜0.05），本研究結(jié)果與相關(guān)文獻報道一致[27]。提示對CTC的深入研究有利于進一步掌握轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者的治療效果，并對其預后情況做出更加準確的預測，從而更好地指導臨床治療實踐，進一步提高腫瘤治療策略的有效性。

綜上所述，HER2陽性早期乳腺癌患者治療前后CTC的檢測數(shù)目會發(fā)生明顯變化，CTC可作為HER2陽性早期乳腺癌患者治療效果和預后情況的預測性指標。另外，手術(shù)能夠作為乳腺癌患者化療后的首選治療手段，但是僅限于HER2陽性早期乳腺癌患者，CTC的檢測對于不同腫瘤分期的HER2陽性早期乳腺癌患者是否適用，仍需進一步深入研究。