lncRNA UCA 1通過抑制miRNA-203 a對(duì)乳腺癌細(xì)胞化療耐藥作用的影響

張丹，李萬軍，李曾#

陜西省西安交通大學(xué)附屬三二〇一醫(yī)院1腫瘤內(nèi)科，2病理科，陜西 漢中723000

乳腺癌是世界范圍內(nèi)導(dǎo)致女性腫瘤患者死亡的第二大原因，其發(fā)病率和病死率均較高，2012年約有167.1萬女性被確診為乳腺癌[1]。近年來，乳腺癌的發(fā)病機(jī)制越來越受到相關(guān)學(xué)者重視。長鏈非編碼RNA（long noncoding RNA，lncRNA）是一類新發(fā)現(xiàn)的非編碼RNA分子，研究顯示，乳腺癌晚期患者lncRNA尿路上皮癌相關(guān)1（urothelial cancer associated 1，UCA1）基因的表達(dá)水平升高，并且ln-cRNA UCA的表達(dá)水平與乳腺癌患者的病死率呈正相關(guān)[2]。微小 RNA-203（micro RNA-203，miRNA-203）是一種干性抑制性miRNA，其在膀胱癌、卵巢癌等多種人類腫瘤中異常表達(dá)，并且miRNA-203表達(dá)上調(diào)還與腫瘤患者的抗腫瘤藥物耐受有關(guān)[3-4]。相關(guān)研究表明，lncRNA可與miRNA相互調(diào)控，從而影響腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[5]。還有研究發(fā)現(xiàn)，lncRNAUCA1可以增加膀胱癌的化療耐藥性[6]。本研究對(duì)lncRNAUCA1通過抑制miRNA-203a對(duì)乳腺癌細(xì)胞化療耐藥性的影響進(jìn)行探討，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞

人乳腺癌細(xì)胞系MCF7購自美國模式培養(yǎng)物集存庫（American Type Culture Collection，ATCC），人乳腺癌耐5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil，5-FU）細(xì)胞系MCF7/5-FU為本實(shí)驗(yàn)室根據(jù)5-FU濃度梯度蹄選法，以MCF7細(xì)胞系為母本蹄選而成。

1.2 主要試劑及儀器

胎牛血清購自以色列Biological Industries公司，細(xì)胞裂解液購自美國Thermo Scientific公司，TRIzol購自北京天根生物有限公司，DMEM及opti-MEM培養(yǎng)基均購自美國Gibco公司；酶標(biāo)儀購自美國Sigma公司，移液器及配套移液槍頭和EP管均購自美國Axygen公司，恒溫培養(yǎng)箱購自日本Panasonic公司，ABI7500 Fast PCR儀購自上海閃晶生物科技公司。轉(zhuǎn)染試劑盒購自生工生物工程（上海）有限公司。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染

將MCF7、MCF7/5-FU細(xì)胞接種于含胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，置于37℃5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，待細(xì)胞長滿培養(yǎng)基后進(jìn)行傳代培養(yǎng)。取處于對(duì)數(shù)生長期的MCF7、MCF7/5-FU細(xì)胞接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，將MCF7細(xì)胞分為兩組：MCF7干擾組，轉(zhuǎn)染UCA1siRNA；MCF7未干擾組，常規(guī)培養(yǎng)不做轉(zhuǎn)染處理。將MCF7/5-FU細(xì)胞分為兩組：MCF7/5-FU干擾組，轉(zhuǎn)染UCA1siRNA；MCF7/5-FU未干擾組，常規(guī)培養(yǎng)不做轉(zhuǎn)染處理。具體轉(zhuǎn)染方法：采用opti-MEM培養(yǎng)基（不含胎牛血清）對(duì)UCA1siRNA儲(chǔ)存液進(jìn)行稀釋，混勻后于室溫孵育5 min；將稀釋后的UCA1siRNA與Upo2000輕輕混勻，于室溫下解育20 min。隨后將500 μl脂質(zhì)體-核酸混合液分別加入4組細(xì)胞中，更換新鮮的不含胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，輕輕混勻，于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4～6 h后換用完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24～96 h，轉(zhuǎn)染過程嚴(yán)格按照操作說明書進(jìn)行。

1.4 RT-PCR檢測(cè)lncRNA UCA 1表達(dá)水平

取處于對(duì)數(shù)生長期的MCF7、MCF7/5-FU細(xì)胞，細(xì)胞裂解液處理后，收集細(xì)胞總RNA，加入40 μl無RNA酶的水溶解細(xì)胞總RNA，置于-80℃冰箱中保存待用[7]。采用實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)（realtime quantitative polymerase chain reaction，RT-PCR）對(duì)逆轉(zhuǎn)錄所得lncRNAUCA1的cDNA進(jìn)行稀釋后，取cDNA、上下游引物、預(yù)混液和超純水混合成20 μl反應(yīng)體系，于ABI7500 FAST PCR儀上對(duì)lncRNAUCA1的表達(dá)情況進(jìn)行定量分析，最后對(duì)熒光信號(hào)進(jìn)行收集分析[8]。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 噻唑藍(lán)（methylthiazolyl tetrazolium，MTT）法檢測(cè)細(xì)胞活力

采用5、10、50、100 μg/ml的奧沙利鉑對(duì)MCF7干擾組和MCF7未干擾組MCF7細(xì)胞進(jìn)行處理，觀察奧沙利鉑處理72 h后兩組細(xì)胞的存活情況，選擇兩組細(xì)胞存活率差別最大的奧沙利鉑濃度（10 μg/ml）對(duì)MCF7干擾組、MCF7未干擾組、MCF7/5-FU干擾組、MCF7/5-FU未干擾組細(xì)胞的存活情況進(jìn)行分析。采用含10%胎牛血清和1%雙抗的DMEM培養(yǎng)液將上述4組細(xì)胞稀釋成單個(gè)細(xì)胞懸液，并以每孔7500個(gè)細(xì)胞接種到96孔板中，每孔的體積為200 μl，每個(gè)濃度均設(shè)置3個(gè)復(fù)孔；細(xì)胞于接種24 h后，棄去原有培養(yǎng)基，更換為由DMEM培養(yǎng)基稀釋好的AC溶液，置于37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)；接著每孔加20 μl MTT溶液繼續(xù)孵育2 h；最后進(jìn)行比色：選擇490 nm波長，在酶標(biāo)儀上測(cè)出各孔吸光度，記錄結(jié)果，并以時(shí)間為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)繪制細(xì)胞的生長曲線或根據(jù)吸光度值計(jì)算細(xì)胞存活率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 RT-PCR檢測(cè)miRNA-203 a的表達(dá)水平

采用RT-PCR法對(duì)MCF7干擾組、MCF7未干擾組、MCF7/5-FU干擾組、MCF7/5-FU未干擾組細(xì)胞中miRNA-203a的表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)，具體檢測(cè)方法同1.4。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以例數(shù)表示。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 lncRNA UCA 1表達(dá)水平的比較

MCF7/5-FU細(xì)胞中l(wèi)ncRNAUCA1的相對(duì)表達(dá)量為（0.96±0.13），明顯高于MCF7細(xì)胞的（0.17±0.09），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=12.239，P＜0.01）。

2.2 干擾lncRNA UCA 1表達(dá)對(duì)乳腺癌細(xì)胞活力的影響

10、50 μg/ml奧沙利鉑處理后，MCF7干擾組MCF7細(xì)胞的存活率均明顯低于MCF7未干擾組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；10 μg/ml奧沙利鉑處理后MCF7干擾組與MCF7未干擾組MCF7細(xì)胞的存活率相差最大，因此本研究選擇濃度為10 μg/ml的奧沙利鉑進(jìn)行耐藥性研究（表1）。

表1 不同濃度奧沙利鉑處理后MCF 7未干擾組和MCF 7干擾組MCF 7細(xì)胞存活率的比較（%，± s）

表1 不同濃度奧沙利鉑處理后MCF 7未干擾組和MCF 7干擾組MCF 7細(xì)胞存活率的比較（%，± s）

注：*與MCF7未干擾組比較，P＜0.01

奧沙利鉑濃度（μg/ml）5 10 50 100 MCF7未干擾組91.23±7.91 92.15±5.73 78.35±7.24 24.14±5.27 MCF7干擾組92.18±6.58 64.36±5.76*54.29±6.69*21.17±6.38

采用10 μg/ml奧沙利鉑處理干擾lncRNA UCA1表達(dá)后MCF7、MCF7/5FU細(xì)胞的生存情況，結(jié)果顯示：與MCF7未干擾組比較，MCF7干擾組MCF7細(xì)胞的存活率明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；與MCF7/5-FU未干擾組比較，MCF7/5-FU干擾組MCF7/5-FU細(xì)胞的存活率明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。（表2）

表2 干擾lncRNA UCA 1表達(dá)后MCF 7、MCF 7/ 5-FU細(xì)胞存活率的比較（%，± s）

表2 干擾lncRNA UCA 1表達(dá)后MCF 7、MCF 7/ 5-FU細(xì)胞存活率的比較（%，± s）

注：a與MCF7未干擾組比較，P＜0.01；b與MCF-7/5-FU未干擾組比較，P＜0.01

細(xì)胞存活率57.31±4.78 40.26±3.95a 78.61±3.44 59.52±4.13b組別MCF7未干擾組MCF7干擾組MCF7/5-FU未干擾組MCF7/5-FU干擾組

2.3 干擾lncRNA UCA 1表達(dá)對(duì)乳腺癌細(xì)胞中miRNA-203 a表達(dá)的影響

MCF7干擾組MCF7細(xì)胞中miRNA-203a的相對(duì)表達(dá)量明顯高于MCF7未干擾組，MCF7/5-FU干擾組MCF7/5-FU細(xì)胞中miRNA-203a的相對(duì)表達(dá)量明顯高于MCF7/5-FU未干擾組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。（表3）

3 討論

乳腺癌患者化療過程中易出現(xiàn)化療耐藥，而耐藥的原因?yàn)槟[瘤細(xì)胞本身發(fā)生了改變，導(dǎo)致其對(duì)化療藥物的敏感性降低，從而影響患者的治療效果[9]。因此，改善乳腺癌化療耐受，提高乳腺癌細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性具有重要意義。目前，腫瘤化療過程中發(fā)生耐藥的機(jī)制尚未明確，前期的研究僅顯示腫瘤耐藥與ABC家族等藥泵蛋白的表達(dá)及腫瘤細(xì)胞抗調(diào)亡能力的增強(qiáng)等因素有關(guān)[10-11]。本研究通過分析lncRNAUCA1抑制miRNA-203a對(duì)乳腺癌細(xì)胞化療耐藥性的影響，探討了乳腺癌患者化療過程中出現(xiàn)化療耐藥的機(jī)制。UCA1是參與調(diào)節(jié)多種腫瘤藥物敏感性的lncRNA[3]。相關(guān)研究顯示，UCA1可以通過WNT6依賴性方式激活WNT信號(hào)通路，從而影響腫瘤的化療耐藥性[12-13]。lncRNAUCA1可以通過調(diào)節(jié)雌激素受體水平參與惡性腫瘤的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，研究表明，失調(diào)的lncRNA可以通過多種機(jī)制參與乳腺癌藥物敏感性的調(diào)節(jié)[14]。本研究結(jié)果顯示，MCF7/5-FU細(xì)胞中l(wèi)ncRNAUCA1的相對(duì)表達(dá)量明顯高于MCF7細(xì)胞，提示lncRNAUCA1與乳腺癌細(xì)胞的耐藥性有關(guān)，lncRNAUCA1的表達(dá)上調(diào)增強(qiáng)了乳腺癌細(xì)胞的化療耐藥性。已有研究表明，miRNA-203已被證明可以抑制腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲和骨轉(zhuǎn)移，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡[15-16]。本研究結(jié)果顯示，MCF7干擾組MCF7細(xì)胞中miRNA-203a的相對(duì)表達(dá)量明顯高于MCF7未干擾組，MCF7/5-FU干擾組MCF7/5-FU細(xì)胞中miRNA-203a的相對(duì)表達(dá)量明顯高于MCF7/5-FU未干擾組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），表明lncRNAUCA1可以通過下調(diào)miRNA-203a表達(dá)，促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的化療耐藥。綜上所述，lncRNAUCA1通過抑制miRNA-203a表達(dá)，增強(qiáng)乳腺癌的化療耐藥性及增加乳腺癌細(xì)胞的活力，lncRNAUCA1可能為乳腺癌提供潛在的治療靶點(diǎn)。

表3 干擾lncRNAUCA 1表達(dá)后MCF 7、MCF- 7/ 5-FU細(xì)胞中miRNA-203 a相對(duì)表達(dá)量的比較（± s）

表3 干擾lncRNAUCA 1表達(dá)后MCF 7、MCF- 7/ 5-FU細(xì)胞中miRNA-203 a相對(duì)表達(dá)量的比較（± s）

注：a與MCF7未干擾組比較，P＜0.01；b與MCF-7/5-FU未干擾組比較，P＜0.01

miRNA-203a相對(duì)表達(dá)量0.66±0.08 0.79±0.11a 0.54±0.14 4.29±0.12b組別MCF7未干擾組MCF7干擾組MCF-7/5-FU未干擾組MCF-7/5-FU干擾組