五子衍宗方對豚鼠形覺剝奪性近視眼鞏膜形態(tài)學(xué)變化的影響

趙慶一, 楊蕓蕓, 張新月, 范明峰

(江蘇省張家港市中醫(yī)醫(yī)院 眼科, 江蘇 張家港, 215600)

近視作為一種復(fù)雜的多因素疾病，正困擾著全世界近一半的年輕人，而對其發(fā)病機(jī)制及防治方法的探討是目前的研究熱點(diǎn)[1]。近視屈光度在-6.0 D以上的被稱為高度近視，是目前導(dǎo)致視力下降和失明的主要眼病，球后部鞏膜呈進(jìn)行性異常擴(kuò)張且逐漸變薄，鞏膜細(xì)胞外基質(zhì)改變是高度近視不斷發(fā)展的根本原因。近年來，中醫(yī)治療高度近視眼病多有報(bào)道，主要采用一些補(bǔ)腎益精類的中藥進(jìn)行治療，并取得了一定的臨床療效。本實(shí)驗(yàn)通過遮蓋法，人為干擾豚鼠正常的視覺反饋，從而誘導(dǎo)出形覺剝奪性近視模型[2-3], 并利用電鏡檢測，從組織形態(tài)角度觀察五子衍宗方對模型動物鞏膜結(jié)構(gòu)的影響，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物及分組: 選擇100只2周齡普通級三色健康豚鼠，記錄體質(zhì)量在180～200 g并標(biāo)記，飼養(yǎng)條件為20～22 ℃室內(nèi)飼養(yǎng)，光線改變按自然晝夜周期，造模前先喂養(yǎng)1周。豚鼠雙眼屈光度檢查采用暗室內(nèi)帶狀檢影鏡檢影驗(yàn)光的方法，記錄造模前豚鼠雙眼屈光度，為減少誤差，由同一位熟練操作者操作。半透明塑料眼罩遮蓋右眼，以誘導(dǎo)形覺剝奪性近視模型的建立，左眼為自身對照眼，不做處理。正常飼養(yǎng)42 d后，再次進(jìn)行帶狀檢影鏡檢影驗(yàn)光，隨機(jī)處死1只豚鼠，摘出眼球，游標(biāo)卡尺測量眼軸長度及赤道徑，確定造模成功。剔除死亡實(shí)驗(yàn)鼠，將剩余60只實(shí)驗(yàn)鼠隨機(jī)分為對照組及治療組，每組30只。對照組不進(jìn)行干預(yù)，治療組以五子衍宗方灌胃給藥30 d后，測定相應(yīng)指標(biāo)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)用藥及制備: 實(shí)驗(yàn)中使用的五子衍宗方具體組成為炙黃芪20 g、生地12 g、菟絲子12 g、枸杞子12 g、覆盆子12 g、車前子10 g、五味子10 g、當(dāng)歸10 g、川芎10 g、白芍10 g、石斛10 g。上述藥物均一次性購于本院門診藥房，使用清潔涼水浸泡藥物30 min后，分別加10倍水、8倍水煎煮60、40 min, 2次煎煮所得藥液經(jīng)混合過濾，濃煎至4 g/mL。根據(jù)動物體表面積折合法計(jì)算治療組豚鼠生物給藥量為16 g/kg。

1.1.3 主要實(shí)驗(yàn)設(shè)備: SW-2100眼科A/B型超聲診斷儀(天津市索維電子科技有限公司), BX51顯微鏡(OLYMPUS), LEICA255鋪片機(jī), BM450A包埋機(jī)(派斯杰醫(yī)療)，帶狀檢影鏡(蘇州六六視覺科技股份有限公司), 4%多聚甲醛固定液(北京華越洋生物科技有限公司)，二甲苯(濟(jì)南匯豐達(dá)化工公司), 0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS)(北京華越洋生物科技有限公司), LEICA300自動脫水機(jī)，乙醇(濟(jì)南匯豐達(dá)化工公司)。

1.2 方法

1.2.1 檢測雙眼屈光度和眼軸長度: 每5 min使用1%復(fù)方托吡卡胺點(diǎn)雙眼，共3次，以作散瞳準(zhǔn)備, 30 min后于暗室內(nèi)檢影驗(yàn)光，散光度數(shù)(D)記作等效球鏡的一半(檢影驗(yàn)光由同一位專業(yè)人員操作完成)。鹽酸奧布卡因滴眼液點(diǎn)雙眼表面麻醉后, A/B型超聲診斷儀手動測量眼軸長度，記錄雙眼結(jié)果，剔除明顯異常數(shù)據(jù)后取平均值。造模后重復(fù)檢查1次。

1.2.2 電鏡觀察: 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，氯胺酮麻醉豚鼠以便操作，標(biāo)記后立即摘除雙側(cè)眼球，小心剔除多余組織，取眼球后部顳側(cè)眼球壁鞏膜組織切成，用無齒鑷剝離大小約1 mm×1 mm鞏膜組織塊，置于25 g/L戊二醛溶液中固定, 10 g/L鋨酸固定，乙醇梯度脫水、浸透包埋、固化、切片，枸櫞酸鉛染色, JEM-120OEX透射電鏡觀察、拍片。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)分析軟件，采用配對t檢驗(yàn)方法檢驗(yàn)豚鼠造模前后屈光度結(jié)果和眼軸結(jié)果，同樣采用配對t檢驗(yàn)方法檢驗(yàn)豚鼠造模后左、右眼屈光度結(jié)果和眼軸結(jié)果，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 雙眼屈光度及眼軸

100只豚鼠經(jīng)正常喂養(yǎng)1周后，檢測右眼的屈光度、眼軸和左眼的屈光度、眼軸。造模前所有實(shí)驗(yàn)對象雙眼屈光度與眼軸相匹配，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。遮蓋右眼42 d以誘導(dǎo)形覺剝奪性近視，再次檢測模型眼(右眼)的屈光度、眼軸及對照眼(左眼)的屈光度、眼軸。對比自身對照眼，模型眼誘導(dǎo)了約(-8.24±1.04) D的相對近視，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。3周齡豚鼠的左、右眼眼軸長度無顯著差異。形覺剝奪42 d后，模型眼的眼軸顯著增長，較實(shí)驗(yàn)前結(jié)果差異顯著(P<0.05)。自然成長42 d后，對照眼的眼軸也隨之增長，較實(shí)驗(yàn)前結(jié)果差異顯著(P<0.05)。模型眼的眼軸變化平均幅度大于對照眼。見表1。

表1 豚鼠造模前后屈光度和眼軸的變化

與右眼比較, *P<0.05; 與造模前比較, #P<0.05。

2.2 鞏膜電鏡下超微結(jié)構(gòu)變化

經(jīng)透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，治療組模型眼和對照組模型眼后部顳側(cè)鞏膜厚度相較于自身對照眼均有不同程度降低，對照組對照眼鞏膜膠原纖維間隙較小，排列緊致，纖維走向規(guī)則，其中均勻分布鞏膜成纖維細(xì)胞且形態(tài)均一，未見典型凋亡細(xì)胞。對照組模型眼鞏膜膠原纖維走行紊亂，排列間隙增寬擴(kuò)大，纖維束疏松，斷裂明顯，其間成纖維細(xì)胞分布不均勻，呈柳葉狀改變，細(xì)胞內(nèi)線粒體腫脹，染色質(zhì)固縮周邊化，同時(shí)可見空泡及典型凋亡小體，細(xì)胞外基質(zhì)減少。治療組模型眼鞏膜膠原纖維走行欠規(guī)則，排列可見間隙，可見少量斷裂纖維束，其間分布成纖維細(xì)胞部分出現(xiàn)皺縮，細(xì)胞內(nèi)有空泡形成，線粒體腫脹，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張與細(xì)胞膜融合，細(xì)胞形態(tài)改變。見圖1。

A、B、C、D為對照組模型眼, E、F、G、H為治療組模型眼; A、C、D、G放大倍數(shù)6 000倍, B、E、F、H放大倍數(shù)2 500倍。圖1 2組豚鼠后部顳側(cè)鞏膜組織電鏡檢查圖

3 討 論

動物模型的應(yīng)用可讓實(shí)驗(yàn)更加直觀，為研究近視疾病的病因及進(jìn)展提供了極有價(jià)值的數(shù)據(jù)。豚鼠具有生長快、成熟周期短、易飼養(yǎng)、易檢查等特點(diǎn)[4], 目前被大量用為實(shí)驗(yàn)性近視的模型動物。本實(shí)驗(yàn)?zāi)M先天性屈光介質(zhì)混濁或后天性上瞼下垂誘發(fā)高度近視，通過遮蓋干擾小周齡豚鼠的正常視覺反饋，從而誘導(dǎo)出形覺剝奪性近視模型。對近視動物模型的形態(tài)學(xué)研究[5-6]發(fā)現(xiàn)，高度近視眼鞏膜纖維層變薄，尤其是后極部，鞏膜膠原、蛋白多糖等含量明顯減少，膠原纖維結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。隨著眼球發(fā)育及近視度數(shù)的加深，眼軸的進(jìn)一步延長，為匹配增大的眼球，后極部鞏膜組織主動重塑、拉伸以協(xié)調(diào)生長，造成膠原纖維梯度排列變化、纖維直徑分布紊亂、組織結(jié)構(gòu)重塑，最終導(dǎo)致眼球前后徑異常伸長[7-9]。本實(shí)驗(yàn)通過電鏡觀察到治療組模型眼及對照組模型眼鞏膜組織均有不同程度的結(jié)構(gòu)改變，鞏膜膠原纖維走行欠規(guī)則，排列間隙增寬擴(kuò)大，纖維束疏松，斷裂明顯，其間成纖維細(xì)胞分布不均勻，細(xì)胞內(nèi)可見空泡，線粒體腫脹，染色質(zhì)固縮周邊化，呈鐮刀狀改變，并可見典型凋亡小體，細(xì)胞外基質(zhì)減少。這一結(jié)果與研究[10]報(bào)道的高度近視豚鼠鞏膜超微結(jié)構(gòu)變化一致。Annexin V/PI流式細(xì)胞分析法[11-12]也證實(shí)了高度近視眼鞏膜組織存在細(xì)胞凋亡。

中醫(yī)認(rèn)為“目得血而能視”“五臟六腑之精氣皆上注于目而為之精”，說明眼睛之所以能有視覺功能，必須依賴于五臟六腑精氣及血液的滋養(yǎng)。腎、脾互為先后天之本，是人體氣血生化之源。脾腎兩虛者，生化乏源，又則肝開竅于目，肝血虛者，目不能養(yǎng)，故發(fā)為高度近視。五子衍宗方是由補(bǔ)腎名方五子衍宗丸加減得來，全方補(bǔ)腎益精，健脾益氣，養(yǎng)肝明目，生津活血，使得氣血運(yùn)行通暢，精氣充足滋養(yǎng)于目。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，相較于對照組模型眼，治療組模型眼的近視進(jìn)程及眼軸增長相對較為緩慢，其鞏膜組織超微結(jié)構(gòu)變化也相對較小，這說明治療組模型眼近視進(jìn)程得到了抑制。有實(shí)驗(yàn)[13-15]證實(shí)，五子衍宗丸的活性成分可通過促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞分化而起到神經(jīng)保護(hù)和改善神經(jīng)病理損傷的作用。推測五子衍宗方可能通過某種途徑改善鞏膜膠原纖維結(jié)構(gòu)異常改變，延緩眼軸增長，但其具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。