芳香烴受體信號(hào)通路相關(guān)基因多態(tài)性及mRNA在子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)病中的相互作用

劉 娟, 陳燦明, 徐 楊, 張 偉, 張 磊

(江蘇省揚(yáng)州市婦幼保健院 婦產(chǎn)科, 江蘇 揚(yáng)州, 225000)

子宮內(nèi)膜異位癥(EMT)簡(jiǎn)稱內(nèi)異癥，是育齡女性的常見病和多發(fā)病，嚴(yán)重影響女性的生活和健康[1-3]。研究[4-7]發(fā)現(xiàn)EMT可能與二噁英暴露有關(guān)，但其具體機(jī)制不明，對(duì)其進(jìn)行分子學(xué)研究[8-10]發(fā)現(xiàn)，二噁英促內(nèi)異癥發(fā)展可能是通過改變芳香烴受體(AhR)介導(dǎo)的信號(hào)通路中相關(guān)基因的表達(dá)。EMT疾病的復(fù)雜性需要考慮到基因-基因交互關(guān)系在疾病中的作用。本研究探討AhR信號(hào)通路相關(guān)基因[AHR、AhR核異位蛋白(ARNT)、細(xì)胞色素P450 1A1(CYP1A1)、AhR 阻遏蛋白(AhRR)、谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶1(GSTP1)、白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)]的基因多態(tài)性，基因的mRNA以及基因-基因交互作用與EMT發(fā)病的關(guān)系，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

采用病例-對(duì)照研究，病例組為2016年12月—2019年1月?lián)P州市婦幼保健院經(jīng)手術(shù)病理確診的卵巢EMT患者25例，平均年齡(38.46±8.74)歲。對(duì)照組為同期因盆腔包塊在揚(yáng)州市婦幼保健院經(jīng)手術(shù)病理確診非EMT患者25例，平均年齡(39.96±18.68)歲。病例組納入標(biāo)準(zhǔn): ① 手術(shù)病理確診EMT; ② 臨床病例資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn): ① 存在交流溝通障礙或精神疾病患者; ② 哺乳期; ③ 拒絕參加臨床調(diào)查者; ④ 存在血緣或親屬關(guān)系。根據(jù)1997年美國(guó)生育學(xué)會(huì)(AFS)提出的“修正子宮內(nèi)膜異位癥分期法”對(duì)EMT進(jìn)行分期。2組年齡、職業(yè)、生育史等一般資料比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05), 具有可比性。所有患者均告知研究目的并簽署知情同意書。研究方案經(jīng)院倫理委員會(huì)審查并通過。

1.2 研究方法

1.2.1 實(shí)時(shí)定量PCR法檢測(cè)mRNA表達(dá): 采集靜脈血1 mL加1 mL Trizol后室溫放置5 min, 放入-80 ℃冰箱，按照百泰克《血液(液體樣本)總RNA快速提取試劑盒使用手冊(cè)》完成總RNA提取，提取RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)檢測(cè)AHR、ARNT、CYP1A1、GADPH、GSTP1和IL-1β共6個(gè)基因的mRNA表達(dá)水平，引物由上海啟因生物科技有限公司設(shè)計(jì)合成，看家基因選擇GAPDH。實(shí)驗(yàn)操作嚴(yán)格按照產(chǎn)品說明書進(jìn)行。引物序列見表1。

表1 引物序列及PCR產(chǎn)物大小

1.2.2 AHR、ARNT、CYP1A1、GSTP1、IL-1β基因多態(tài)性檢測(cè): 抽取2組靜脈血2 mL, 置于含有乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)抗凝的5 mL試管，用鹽析法提取DNA，采用定量PCR為基礎(chǔ)的高分辨率熔解曲線(PCR-HRM)法檢測(cè)AHR、ARNT、CYP1A1、GSTP1、IL-1β基因單核苷酸位點(diǎn)，包括AHRG 1661A: rs2066853, ARNT G522C: rs2228099, AHRR C565G: rs2292596, CYP1A1 T6235C: rs4646903, GSTP1 A313G: rs1695, IL-B C3953T: rs1143634。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示, 2組間計(jì)量資料用t檢驗(yàn)進(jìn)行分析。病例組和對(duì)照組基因多態(tài)位點(diǎn)基因型頻率分別行Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn),P>0.05表明所選樣本已達(dá)遺傳平衡。計(jì)數(shù)資料用率表示，用卡方檢驗(yàn)或Fisher確切概率法分析組間各基因型頻率分布的差異，計(jì)算優(yōu)勢(shì)比(OR)及95%可信區(qū)間(95%CI)。用單純病例研究方法，采用非條件Logistic多元回歸模型中交互作用的相乘模型分析基因-基因之間的交互作用,P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

所有患者中近半數(shù)人員職業(yè)為職員(48.00%), 其他職業(yè)還包括教師、農(nóng)民、服務(wù)人員、醫(yī)護(hù)人員、個(gè)體、學(xué)生、退休和無業(yè)。病例組與對(duì)照組在年齡、職業(yè)、生育和規(guī)律月經(jīng)方面差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。病例組中大部分患者為中重型，內(nèi)異癥分期Ⅲ～Ⅳ期(19/25，76.00%)。

2.1 病例組與對(duì)照組mRNA的表達(dá)水平

與對(duì)照組比較，病例組中AHR mRNA、GSTP1 mRNA和IL-1β mRNA水平顯著增高(P<0.01)。病例組中ARNT mRNA水平顯著高于對(duì)照組(P<0.05), 見表2。

表2 病例組與對(duì)照組6個(gè)基因mRNA的表達(dá)水平

與對(duì)照組比較, *P<0.05, **P<0.01。

2.2 病例組與對(duì)照組各基因位點(diǎn)頻率分布的比較

6個(gè)基因多態(tài)性位點(diǎn)的基因頻率分布在病例組和對(duì)照組中均符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律，納入樣本符合人群代表性。病例組與對(duì)照組中AHR 1661 G/A以GA基因型最常見; AA基因型最少見，ARNT 522 G/C以CG基因型最常見，GG基因型少見; AHRR 565 C/G以CG基因型最常見，GG基因型最少見; GSTP1313 A/G以基因型AA最常見，GG最少見。IL-1β 3953 C/T全部為野生型基因CC型，未見基因突變。CYP1A1 6235 T/C以TC基因型最常見，然而攜帶突變基因型CC患者EMT的危險(xiǎn)度是純合野生型的7.5倍(95%CI為1.29～43.69)。其他基因型的分布無顯著差異(P>0.05)，見表3。

表3 AHR、ARNT、AHRR、CYP1A1、GSTP1、IL-1β基因多態(tài)性在病例組與對(duì)照組中分布[n(%)]

2.3 各基因型在EMT發(fā)病中的交互作用

CYP1A1 6235 T/C突變型與ARNT 522 G/C(OR=9.33, 95%CI: 1.47～59.48)、GSTP1313 A/G突變型(OR=13.50, 95%CI: 1.34～135.98)存在協(xié)同作用。AHR 1661 G/A突變型與AHRR 565 C/G突變型存在協(xié)同作用(OR=13.50, 95%CI: 1.34～159.98), 其他基因位點(diǎn)未見交互作用。見表4。

表4 基因-基因在EMT發(fā)病中的交互作用

3 討 論

二噁英對(duì)人體的毒害作用主要是由AhR介導(dǎo)。AhR與二噁英具有高度親和力，未與二噁英結(jié)合的AhR位于細(xì)胞漿，處于一種非活化狀態(tài)，與二噁英結(jié)合的AhR轉(zhuǎn)入細(xì)胞核與ARNT相互作用而形成轉(zhuǎn)錄激活因子，結(jié)合到靶基因的DNA基序生物異源物質(zhì)效應(yīng)元件(XRE), 啟動(dòng)靶基因轉(zhuǎn)錄，研究較多的靶基因包括細(xì)胞色素P450基因組、谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶(GSTP)、炎性細(xì)胞因子如白介素1等。另外, AhR阻遏蛋白(AhRR)也會(huì)被AhR激活，競(jìng)爭(zhēng)性地與ARNT結(jié)合，作用于靶基因，遏制AhR-ANRT對(duì)基因的轉(zhuǎn)錄[12]。二噁英和EMT的發(fā)病的關(guān)系可能與這些解毒代謝途徑相關(guān)基因的多態(tài)性有關(guān)。

3.1 單個(gè)基因多態(tài)性與EMT的關(guān)系

本研究檢測(cè)了AhR介導(dǎo)的信號(hào)通路中6個(gè)基因6個(gè)位點(diǎn)的單核苷酸多態(tài)性的基因型分型。就單個(gè)基因而言，只有1個(gè)基因的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)與EMT發(fā)病有關(guān)聯(lián)，即攜帶CYP1A1-6235 T/C突變型CC基因型患EMT的風(fēng)險(xiǎn)增加(OR=7.50, 95%CI: 1.29～43.69)。CYP1A1屬于細(xì)胞色素P450酶系(CYP450s), 是二噁英重要的I相代謝酶，其功能是激活無活性的前致癌物為致癌物。因機(jī)體的細(xì)胞在復(fù)制過程中會(huì)發(fā)生基因突變，所以可能導(dǎo)致細(xì)胞色素CYP1A1表現(xiàn)出多態(tài)性，對(duì)環(huán)境毒素的催化特性不同，在機(jī)體表現(xiàn)為發(fā)生疾病的不同易感性。研究[13]發(fā)現(xiàn)和攜帶CYP1A1 MspI基因型(-/-)的女性相比，攜帶CYP1A1 MspI(+/-)和(+/+)的女性有40%的風(fēng)險(xiǎn)發(fā)生EMT。此外，國(guó)內(nèi)學(xué)者[14]報(bào)道吉林市漢族婦女中CYP1A1Exon7的Ile/Val、Val/Val基因型與EMT的易感性有關(guān)。但也有文獻(xiàn)[15-17]報(bào)道了不一樣的結(jié)果，否認(rèn)二者之間存在關(guān)聯(lián)性。研究結(jié)果的不一致可能與研究人群、基因型、遺傳背景、種族差異、樣本量以及環(huán)境污染暴露程度不同等多個(gè)因素有關(guān)。本研究人群中未發(fā)現(xiàn)其他的單個(gè)基因多態(tài)性和內(nèi)異癥之間的關(guān)系，與部分文獻(xiàn)[15, 18]結(jié)果一致。

3.2 聯(lián)合基因多態(tài)性和EMT的關(guān)系

本研究發(fā)現(xiàn)CTP1A1 6235 T/C與ARNT 522G/C，CTP1A1 6235 T/C與GSTP1 313 A/G基因突變型之間的協(xié)同作用增加EMT的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)(OR=9.33, 95%CI: 1.47～59.48;OR=13.50, 95%CI: 1.34～135.98), 比CTP1A1 6235 T/C單個(gè)基因多態(tài)性增加內(nèi)異癥的風(fēng)險(xiǎn)更大(OR=7.50, 95%CI: 1.29～43.69)。國(guó)內(nèi)學(xué)者[19]報(bào)道吉林市漢族婦女CYP1A1 Exon7的Ile/Val、Val/Val基因型及GSTM1空白基因型二者的協(xié)同作用與EMT的易感性有關(guān)。另有學(xué)者[20]報(bào)道CYP1A1基因MspI多態(tài)性本身可能與維吾爾族及漢族內(nèi)異癥發(fā)病無關(guān)，而CYP1A1/MspI合并GSTM1(-/-)基因型可能與維吾爾族內(nèi)異癥發(fā)病有關(guān)。近期的1篇Meta分析[21]也得出類似結(jié)論。CYP1A1和GSTP1同屬于解毒代謝酶，根據(jù)功能分為Ⅰ相代謝酶和Ⅱ相代謝酶。CYP1A1屬于Ⅰ相代謝酶，其主要功能是激活活化環(huán)境毒物并結(jié)合形成親電子中間產(chǎn)物，呈現(xiàn)毒性。GSTP1屬于Ⅱ相代謝酶，其主要功能是將Ⅰ相代謝酶活化的毒物解毒，轉(zhuǎn)化為無毒物質(zhì)排出。因此如果編碼Ⅰ和Ⅱ相代謝酶的某個(gè)基因位點(diǎn)多態(tài)性，可能會(huì)造成酶活性的改變，使得毒性物質(zhì)提前被激活或解毒能力降低，不能轉(zhuǎn)變成無毒物質(zhì)排出體外，從而使機(jī)體對(duì)疾病的易感性增加。另外，本研究發(fā)現(xiàn)AHR1661 G/A與AHRR565 C/G基因突變型間的協(xié)同作用與EMT的易感性有關(guān)。AHRR的主要作用是拮抗AhR介導(dǎo)的信號(hào)途徑，但基因位點(diǎn)上多態(tài)性改變，可能會(huì)引起功能異常。在臺(tái)灣的漢族人群中調(diào)查也發(fā)現(xiàn)野生型AhR和突變型的AHRR間協(xié)同作用增加近3倍的內(nèi)異癥發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)[22]。

3.3 基因多態(tài)性和基因mRNA表達(dá)

炎性細(xì)胞因子白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)與EMT的發(fā)病有關(guān)[23]。本研究發(fā)現(xiàn)EMT患者血液中IL-1β mRNA的含量明顯增高。但I(xiàn)L-1β基因3953位點(diǎn)CC基因型與內(nèi)異癥發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)無關(guān)，本研究結(jié)果與其他中國(guó)漢族人群的報(bào)道[24-26]相符。其原因是本研究?jī)H檢測(cè)IL-1β基因上一個(gè)位點(diǎn)，而基因上分布多個(gè)SNP, 推測(cè)可能是基因序列上其他位點(diǎn)的改變調(diào)節(jié)了IL-1β的轉(zhuǎn)錄，據(jù)報(bào)道IL-1β表達(dá)與3953位點(diǎn)多態(tài)性之間無相關(guān)性[27-29]，需要探索其他功能性位點(diǎn)。本研究中CYP1A1基因的多態(tài)性與內(nèi)異癥易感性有關(guān)，同時(shí)也檢測(cè)出病例組中CYP1A1mRNA水平高于對(duì)照組。此外，本研究結(jié)果表明內(nèi)異癥患者血液中AhR mRNA和GSTP1 mRNA水平明顯增加，但這些基因的多態(tài)性僅在與其他基因多態(tài)性聯(lián)合作用時(shí)才表現(xiàn)出與疾病易感的相關(guān)性。另外，病例組中ARNT mRNA水平較在對(duì)照組中明顯增加，該基因的多態(tài)性與疾病無相關(guān)性，但其與CYP1A1基因多態(tài)性突變型基因間的交互作用與疾病的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)?？紤]到基因位點(diǎn)上的改變可能會(huì)影響基因的轉(zhuǎn)錄，繼而出現(xiàn)表達(dá)的異常，所以本研究檢測(cè)基因SNP同時(shí)檢測(cè)相應(yīng)基因的mRNA, 但出現(xiàn)的結(jié)果較復(fù)雜，對(duì)這一現(xiàn)象的解釋可能需要離體試驗(yàn)及擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步驗(yàn)證。