葉酸與TSLC1在喉鱗狀細(xì)胞癌中的相關(guān)性研究

常 浩，李陽(yáng)陽(yáng)，馬 民，韓亞靜

喉鱗狀細(xì)胞癌(carcinoma of larynx)是耳鼻喉科中最為常見(jiàn)的喉部上皮組織惡性腫瘤之一，以鱗狀細(xì)胞癌為最多見(jiàn)，約占90%[1-2]。喉鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生、發(fā)展受環(huán)境、生活習(xí)慣、內(nèi)分泌因素、遺傳因素和腫瘤基因改變等多種因素的作用和影響。最近研究表明，葉酸缺乏可能與人類腫瘤的發(fā)生有關(guān)[3]。TSLC1(tumor suppressor in lung cancer,肺癌腫瘤抑制因子-1)與多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[4]。但二者之間的相關(guān)性，國(guó)內(nèi)外鮮有報(bào)道。本研究采用了免疫組化、放射免疫學(xué)的方法，探討喉鱗狀細(xì)胞癌患者血清中葉酸的含量和癌組織細(xì)胞中TSLC1蛋白表達(dá)與喉鱗癌病變程度之間的關(guān)系。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 一般資料觀察組：選取2011年9月至2014年9月河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院耳鼻喉科手術(shù)切除的喉鱗狀細(xì)胞癌組織60例及同一病人的癌旁組織(距離腫瘤組織邊緣0.5 cm非腫瘤組織)石蠟標(biāo)本為對(duì)照。所有被抽取的患者術(shù)前均未經(jīng)過(guò)任何輔助性放、化療，且均為第一次入院病例。所有病例病理診斷明確，臨床資料真實(shí)可靠，病理分期按照國(guó)際TNM分期標(biāo)準(zhǔn)。對(duì)照組：30例健康對(duì)照者通過(guò)門診常規(guī)體檢的方式募集，排除營(yíng)養(yǎng)性巨幼紅細(xì)胞性貧血及其他類型的貧血、上消化道疾病及有手術(shù)史、半年內(nèi)B族維生素使用史等。本研究通過(guò)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法抽取納入試驗(yàn)的患者靜脈血，4 ℃離心(3 000 r·min-1，15 min)，分離血清，使用放射免疫法(radioimmunoassay,RIA)定量檢測(cè)上述90例患者的血清葉酸水平(試劑盒及所用輔助用品均與儀器配套)，嚴(yán)格按照試劑盒操作說(shuō)明書進(jìn)行并詳細(xì)記錄。血清葉酸診斷采用國(guó)際通用的<6.8 mmol·L-1(3 ng·mL-1)標(biāo)準(zhǔn)。組織中TSLC1蛋白檢測(cè)：取喉鱗狀細(xì)胞癌患者的癌組織和癌旁組織石蠟，每一石蠟塊連續(xù)切片3張，厚度4 μm，1張常規(guī)HE染色，再次病理證實(shí)，另2張常規(guī)脫蠟水化，采用枸櫞酸緩沖液煮沸法進(jìn)行抗原修復(fù)后按SP試劑盒(北京康為世紀(jì)公司)說(shuō)明書進(jìn)行操作。結(jié)果判讀：與陰性對(duì)照片相比，TSLC1蛋白以細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞膜內(nèi)發(fā)現(xiàn)棕黃色顆粒判斷為陽(yáng)性細(xì)胞。采用雙盲法，高倍鏡下隨機(jī)選取10個(gè)視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞，按照文獻(xiàn)[5]方法統(tǒng)計(jì)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)：<30%為陰性(-)，≥30%為陽(yáng)性(+)。

1.3 統(tǒng)計(jì)方法使用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，采用卡方檢驗(yàn)、Fisher’s精確概率法、單因素方差分析、SNK-q檢驗(yàn)、Spearman相關(guān)分析、logistic回歸等統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 喉鱗狀細(xì)胞癌組與對(duì)照組葉酸含量喉鱗狀細(xì)胞癌組血清中葉酸的含量(3.35±1.51) ng·mL-1明顯低于對(duì)照組(4.40±1.47) ng·mL-1(t=3.13,P<0.05)。

2.2 TSLCI在喉鱗狀細(xì)胞癌及癌旁組織的表達(dá)TSLC1蛋白在癌旁組織中的表達(dá)率為78%，TSLC1蛋白在癌組織中的表達(dá)率為20%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=28.229,P<0.01)。見(jiàn)圖1。

紅箭頭：癌旁組織；藍(lán)箭頭：癌組織。圖1 TSLC1蛋白在癌旁組織和癌組織中的表達(dá)(SP，×100)

2.3 葉酸含量與喉鱗狀細(xì)胞癌臨床特征用單因素方差分析比較血清中葉酸濃度在喉鱗狀細(xì)胞癌各個(gè)不同臨床特征之間的水平：葉酸的表達(dá)水平與喉鱗狀細(xì)胞癌臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、組織分化程度有關(guān)(P<0.05)，與年齡無(wú)關(guān)(P>0.05)，見(jiàn)表1。

表1 喉鱗狀細(xì)胞癌患者血清葉酸含量之間的關(guān)系

2.4 TSLCI表達(dá)與喉鱗狀細(xì)胞癌臨床特征TSLCI蛋白的表達(dá)與臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、組織分化程度有關(guān)(P<0.05)，與年齡無(wú)關(guān)(P>0.05)，見(jiàn)表2。

表2 喉鱗狀細(xì)胞癌組織中TSLC1蛋白表達(dá)之間的關(guān)系

2.5 癌癥組葉酸含量與癌組織中TSLC1表達(dá)的關(guān)系Spearman相關(guān)分析顯示：r為0.642，P<0.01，兩指標(biāo)呈正相關(guān)。logistic回歸模型分析顯示，OR值為3.91，P<0.01，表明喉鱗狀細(xì)胞癌患者血清中的葉酸含量每增加0.003 μmol·L-1，TSLC1的蛋白表達(dá)陽(yáng)性率增加3.91倍。

3 討論

喉癌是耳鼻喉科最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)多個(gè)癌基因和抑癌基因的變異與其發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)歸有關(guān)[6]。多基因表達(dá)異常是其發(fā)生發(fā)展的基礎(chǔ)。

葉酸是一種水溶性維生素，其主要的生物學(xué)功能是作為一碳單位的載體參與細(xì)胞內(nèi)的甲基化反應(yīng)、DNA的成分和修復(fù)、細(xì)胞的凋亡等[7-8]。McGlynn等[9]觀察到的結(jié)腸腺瘤性息肉患者體內(nèi)葉酸的濃度要明顯低于沒(méi)有息肉的正常對(duì)照組，葉酸濃度在正常結(jié)腸組織、結(jié)腸息肉的邊緣組織、息肉組織中呈梯度性降低。Sie等[10]表明，實(shí)驗(yàn)孕鼠使用足夠葉酸的食物后，可顯著改變子代錯(cuò)誤DNA的編碼水平，而減少結(jié)腸癌的發(fā)生。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，血清中的葉酸在健康對(duì)照組中的濃度明顯要高于喉鱗狀細(xì)胞癌組，并且喉鱗狀細(xì)胞癌組中隨著病變程度的加重，血清中的葉酸逐漸降低。

TSLC1是一種抑癌基因，參與細(xì)胞間的黏附、細(xì)胞間的運(yùn)動(dòng)、信號(hào)傳導(dǎo)及免疫調(diào)節(jié)，并在抑制腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。TSLC1可廣泛表達(dá)于除骨骼肌外的大多數(shù)正常組織，但在許多腫瘤中，特別是侵襲性強(qiáng)的腫瘤中呈現(xiàn)低表達(dá)或不表達(dá)[11-12]。Lung等[13]運(yùn)用PCR和免疫組化技術(shù)闡明了TSLC1蛋白的缺失可以作為一個(gè)在鼻咽癌患者中判斷有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的指標(biāo)，在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的鼻咽癌患者組織中，大部分的TSLC1蛋白表達(dá)缺失。Steenbergen等[14]研究發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)中的宮頸癌細(xì)胞株82%的TSLC1基因表達(dá)的蛋白下降。在正常宮頸組織和Ⅰ度CIN組織中未檢測(cè)到TSLC1蛋白表達(dá)下降，TSLC1基因表達(dá)下降在Ⅱ度和Ⅲ度CIN組織中的檢出率分別為58%和35%，并且TSLC1表達(dá)下降的頻率隨著宮頸病變的嚴(yán)重程度、病理分級(jí)程度的增高而增加。本研究與文獻(xiàn)報(bào)道相似。

本研究發(fā)現(xiàn)隨著喉鱗狀細(xì)胞臨床分期加重、組織分化程度降低、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，患者血清中葉酸含量逐漸降低，組織中TSLC1蛋白表達(dá)逐漸降低，而且葉酸濃度與TSLC1蛋白表達(dá)呈正相關(guān)，喉鱗狀細(xì)胞癌患者血清中葉酸含量減少0.003 μmol·L-1，TSLC1蛋白表達(dá)陽(yáng)性率降低3.91倍，這可能是因?yàn)槿~酸可以修復(fù)受損的DNA和引導(dǎo)正確的DNA復(fù)制，從而促使TSLC1蛋白正常表達(dá)。

葉酸缺乏可能導(dǎo)致基因組DNA低甲基化、組蛋白甲基化改變和致癌基因激活，致使一系列的DNA損傷、DNA鏈斷裂和染色體的破壞，參與喉鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程。增加膳食中葉酸的攝入會(huì)降低患病風(fēng)險(xiǎn)，可望成為喉鱗狀細(xì)胞癌簡(jiǎn)便易行的預(yù)防措施，同時(shí)TSLC1可能成為其基因治療的靶點(diǎn)，為其早期預(yù)防和臨床靶向治療提供科學(xué)依據(jù)。