不同干燥方式澤瀉湯指紋圖譜的建立及2 種成分測定

伍蕊嗣， 姚運(yùn)秀， 劉 錢， 楊 慧， 曾琦璐， 劉 濤*

（1. 成都大學(xué)藥學(xué)與生物工程學(xué)院， 四川 成都610106； 2. 四川省中醫(yī)藥科學(xué)院， 四川 成都610041； 3.廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院， 廣西 南寧530001）

中藥經(jīng)典名方澤瀉湯出自東漢張仲景《金匱要略·痰飲咳嗽病》篇, 原文記載為“心下有支飲, 其人苦冒眩, 澤瀉湯主之” “澤瀉五兩, 白術(shù)二兩, 右二味, 以水二升, 煮取一升, 分溫再服”。 澤瀉湯由澤瀉和白術(shù)2 味藥組成, 具有消飲利水、 調(diào)補(bǔ)脾腎之功效, 系歷代醫(yī)家治療痰飲所致眩暈之效方。 目前廣泛應(yīng)用于臨床, 療效顯著, 現(xiàn)代多用于治療梅尼埃病、 良性陣發(fā)性位置性眩暈、椎基底動脈供血不足等眩暈病[1]。

古代經(jīng)典名方制劑的研制分標(biāo)準(zhǔn)煎液與制劑研制2 個(gè)階段, 標(biāo)準(zhǔn)煎液應(yīng)作為經(jīng)典名方制劑藥用物質(zhì)確定的基準(zhǔn)[2]。 干燥是其制備工藝中必不可少的步驟, 減壓、 常壓、 噴霧、 冷凍干燥是中藥提取物常見的干燥方式, 由于原理及加熱方式不同, 不同的干燥方式可能會對產(chǎn)物的成分含有量及物理性質(zhì)產(chǎn)生影響[3-4]。

目前干燥方式對藥物的影響多以指標(biāo)成分含有量作為評價(jià)依據(jù), 不能全面地反應(yīng)對物料的影響,不同干燥方式會對產(chǎn)物的粉體學(xué)性質(zhì)產(chǎn)生影響, 進(jìn)而關(guān)系到制劑工藝過程及質(zhì)量, 最終影響制劑安全性、 穩(wěn)定性及有效性。 然而這方面的研究卻不多[5], 未查見關(guān)于經(jīng)典名方標(biāo)準(zhǔn)煎液干燥方式的研究報(bào)告, HPLC 指紋圖譜是中藥整體質(zhì)量評價(jià)思路的重要體現(xiàn), 這一技術(shù)已廣泛應(yīng)用于中藥質(zhì)量評價(jià)[6]。 HPLC 波長切換指紋圖譜能反映樣品更多的化學(xué)信息, 色譜峰分離效果更好, 數(shù)量更多, 峰型更美觀, 以達(dá)到更好的整體質(zhì)量控制目的[7-8]。

為了更全面地研究不同干燥方式對澤湯標(biāo)準(zhǔn)煎液的物理及化學(xué)性質(zhì)的影響[9], 本研究通過建立HPLC 指紋圖譜、 物理指紋譜及成分含有量測定,考察4 種干燥方式對經(jīng)典名方澤瀉湯標(biāo)準(zhǔn)煎液的影響, 以期為澤瀉湯制劑的研發(fā)提供參考。

1 儀器與材料

SQP Satorious 型電子天平[賽多利斯科學(xué)儀器（北京） 公司]； BS-6KH 型電子天平（上海友聲衡器公司）； FA2004 型電子分析天平（上海良平儀器儀表公司）； 3～9 號藥典篩（道墟化驗(yàn)儀器廠）；DSH-10 A 型電子水分測定儀（邦西儀器科技公司）； HS-3120 型超聲波清洗器（天津市恒奧科技公司）； TD5 型臺式多管架離心機(jī)（長沙英泰儀器公司）； TU-1810 型紫外可見分光光度計(jì)（北京普析通用儀器公司）； P230Ⅱ型高效液相色譜儀（大連依利特分析儀器公司）； Waters 2695 型高效液相色譜儀（美國Waters 公司）。

澤瀉飲片（批號20180301）、 白術(shù)飲片（批號20180301） 均購自四川省成都市金牛區(qū)荷花池中藥材市場, 經(jīng)成都大學(xué)劉濤高級工程師鑒定分別為正品。 23-乙酰澤瀉醇B 對照品（wkq16040904）、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ對照品 （wkq16092604）, 含有量≥98%, 均購于四川省維克奇生物科技公司； 氯化鈉（2017081101, 成都市科龍化工試劑廠）。

2 方法與結(jié)果

2.1 澤瀉湯標(biāo)準(zhǔn)煎液制備 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上, 利用星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法確定了澤瀉湯標(biāo)準(zhǔn)煎液的提取工藝, 以白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ轉(zhuǎn)移率為指標(biāo)確定了其濃縮工藝, 即取澤瀉和白術(shù)飲片（5 ∶2） 適量,加13.41 倍水回流提取, 提取3 次, 2.21 h/次,趁熱過濾, 取濾液進(jìn)行減壓濃縮（80 ℃, -0.08 ～-0.09 MPa） 至密度為1.05～1.10 （80 ℃）。

經(jīng)前期4 種干燥方式工藝參數(shù)優(yōu)選后, 將同一批浸膏等分為4 份, 分別進(jìn)行常壓干燥（80 ℃）、減 壓 干 燥 （80 ℃, - 0.08 MPa）、 冷 凍 干 燥（t預(yù)凍= 2 h, - 55 ℃, P ＜10 Pa）、 噴 霧 干 燥（T進(jìn)風(fēng)=150 ℃, T出風(fēng)=60 ℃）, 所得干膏含水量分別為4.48%、 4.19%、 4.04%、 4.54%, 將所得干膏經(jīng)相同粉碎時(shí)間后過2 號篩, 即得。

2.2 物理指紋圖譜[10-14]

2.2.1 物理屬性確定 共篩選出9 個(gè)物理參數(shù),分別為相對均齊指數(shù)（Iθ） 是指粉末粒徑的分布均勻程度； 松密度（Da） 表示粉末的工藝性能, 是指粉末在規(guī)定條件下自由充滿標(biāo)準(zhǔn)容器后所測得的堆積密度； 振實(shí)密度（Dc） 是指粉末在規(guī)定條件下經(jīng)振實(shí)所測得的單位容積的質(zhì)量； 豪斯納比（IH） 表示粉末的流動性, 數(shù)值越接近于1, 則流動性越好； 休止角（α） 是衡量粉末流動性的重要參數(shù), α＜30°時(shí)流動性好, α＞45°時(shí)流動性差； 卡爾指數(shù)（IC） 表示粉末能夠被震實(shí)的能力； 顆粒間孔隙率（Ie） 表示粉末的可壓性； 吸濕性（H）表征粉末的穩(wěn)定性, 是指物質(zhì)在一定環(huán)境條件下吸附水分的能力； 干燥失重（HR） 是指物料中水分及揮發(fā)性成分含有量, 其高低不僅對物料成分含有量有影響, 還可能導(dǎo)致物料變質(zhì), 是1 個(gè)重要的物理參數(shù)。

以上9 個(gè)參數(shù), 為物理指紋譜的二級指標(biāo)。 根據(jù)澤瀉湯標(biāo)準(zhǔn)煎液物理性質(zhì), 將其粉體學(xué)質(zhì)量屬性分為5 個(gè)物理指紋譜一級指標(biāo), 即穩(wěn)定性、 均一性、 流動性、 堆積性和可壓性。 以吸濕性和干燥失重表征穩(wěn)定性； 以相對均齊指數(shù)表征均一性； 以豪斯納比及休止角表征流動性, 良好的流動性可保證固體制劑的成型工藝和產(chǎn)品質(zhì)量； 以振實(shí)密度和松密度表征堆積性； 以卡爾指數(shù)和顆粒間孔隙率表征可壓性。

2.2.2 測定方法 物理指紋譜二級指標(biāo)的測定首選法定標(biāo)準(zhǔn)收載方法。 松密度, 取潔凈、 干燥的50 mL 量筒, 將20 g 左右待測粉末緩慢地加入到量筒中, 輕輕抹平粉末表面, 讀取待測粉末的體積；振實(shí)密度, 將上述盛有待測粉末的量筒, 同一高度上下振動200 次, 讀取待測粉末的體積； 相對均齊度指數(shù), 將待測粉末依次過藥典篩3 ～9 號篩, 振蕩5 min, 分別記錄每個(gè)篩網(wǎng)上截留的粉末質(zhì)量。取平均孔徑分別為0.302 5、 0.215 0、 0.165 0、0.137 5、 0.107 5、 0.082 5 mm 的篩網(wǎng)截留的粉末, 計(jì)算相對均齊度指數(shù), 公式為Iθ=Fm/100+（dm-dm-1） Fm-1+ （dm+1-dm） Fm+1+ （dm-dm-2）Fm-2+ （dm+2-dm） Fm+2…（dm+n-dm） Fm+n, 其中, Fm為中間粒徑范圍粉末的質(zhì)量百分比, Fm-1為中間粒徑范圍下一層粉末的質(zhì)量百分比, Fm+1為中間粒徑范圍上一層粉末的質(zhì)量百分比, n 為所確定的粒徑范圍個(gè)數(shù), dm為中間粒徑范圍的粉末平均粒徑,dm-1為中間粒徑范圍下一層的粉末平均粒徑, dm+1為中間粒徑范圍上一層的粉末平均粒徑； 豪斯納比, 由松密度和振實(shí)密度計(jì)算而得, 公式為IH=Dc/Da； 休止角, 采用固定漏斗法測定, 將2 個(gè)漏斗串聯(lián)放置漏斗下端頂尖位置距離坐標(biāo)紙的高度為H, 緩慢勻速地將粉末倒入漏斗中, 直至粉末所形成圓錐體的頂尖接觸到漏斗的頂尖位置時(shí), 計(jì)算圓錐體底面半徑R, 公式為α=tan-1（H/R）； 顆粒間空隙率, 由松密度和振實(shí)密度計(jì)算而得, 公式為Ie= （Dc-Da） / （Da×Dc）； 卡爾指數(shù), 由松密度和振實(shí)密度計(jì)算而得, 公式為IC= （Dc-Da） ×100/Dc； 干燥失重, 使用快速水分測定儀, 取約3 g待測粉末平鋪于樣品盤中, 于105 ℃下加熱10 min, 根據(jù)儀器顯示的最終讀數(shù)記錄即可； 吸濕性為取干燥的蒸發(fā)皿置于下部盛有飽和氯化鈉水溶液的恒溫干燥器中, 12 h 后精密稱定質(zhì)量（m1）。取約3 g 待測粉末平鋪于上述蒸發(fā)皿中, 精密稱定質(zhì)量（m2）。 將蒸發(fā)皿置于上述恒溫干燥器中,24 h后精密稱定質(zhì)量（m3）。 計(jì)算其吸濕性, 公式為H= （m3-m2） / （m2-m1）。

2.2.3 物理參數(shù)標(biāo)準(zhǔn)化轉(zhuǎn)換 由于二級物理質(zhì)量指標(biāo)的數(shù)值和量綱不同, 為了方便在同一雷達(dá)圖更加直觀的表現(xiàn)出來, 參照藥典標(biāo)準(zhǔn)和相關(guān)文獻(xiàn)資料, 確定每個(gè)指標(biāo)的可能數(shù)據(jù)范圍, 然后將其所測的物理參數(shù)數(shù)值標(biāo)準(zhǔn)化至0～10, 見表1。

表1 物理質(zhì)量指標(biāo)的可接受范圍及標(biāo)準(zhǔn)化轉(zhuǎn)換公式Tab.1 Limit values accepted for the physical quality indexes and standardized conversion formula

2.2.4 物理指紋譜建立 取經(jīng)4 種干燥方式所得的3 批澤瀉湯標(biāo)準(zhǔn)煎液, 按“2.2.2” 項(xiàng)下方法測定并按表1 標(biāo)準(zhǔn)化轉(zhuǎn)換物理參數(shù), 構(gòu)成不規(guī)則的九邊形疊加物理指紋譜, 結(jié)果見圖1。

2.2.5 相似度分析 以減壓干燥為基準(zhǔn), 采用SPSS 數(shù)據(jù)處理軟件中Pearson 法對4 種干燥方式所得3 批澤瀉湯標(biāo)準(zhǔn)煎液物理指紋譜進(jìn)行相似度分析, 比較不同干燥方式所得澤瀉湯標(biāo)準(zhǔn)煎液的物理性質(zhì)差異, 結(jié)果見表2。

表2 物理指紋譜相似度Tab.2 Similarities of physical fingerprints

圖1 各樣品物理指紋譜Fig.1 Physical fingerprints of various samples

其余3 種干燥方式與減壓干燥方式所得物理指紋譜相似度均值的RSD 54.99%, 結(jié)果表明, 不同干燥方式對澤瀉湯標(biāo)準(zhǔn)煎液物理指紋譜有較大影響。

2.3 HPLC 指紋圖譜

2.3.1 供試品溶液制備 精密稱定干膏粉末1 g于100 mL 錐形瓶中, 精密移取10 mL 甲醇作為溶劑, 稱定質(zhì)量, 超聲40 min, 冷卻至室溫后, 稱定質(zhì)量, 補(bǔ)足溶劑, 混勻后過0.45 μm 有機(jī)濾膜即得。

2.3.2 色譜條件[15]依利特Supersil C18色譜柱（4.6 mm× 250 mm, 5 μm）； 柱溫35 ℃； 流動相乙腈 （A） -水 （B）, 梯度洗脫 （0 ～30 min,10% ～45% A； 30 ～85 min, 45% ～90% A； 85 ～90 min, 90% ～10% A； 90 ～100 min, 10% A）； 體積流量1 mL/min； 檢測波長（0 ～50 min, 240 nm；30～85 min, 240 ～210 nm； 85 ～90 min, 210 nm）；進(jìn)樣量10 μL。

2.3.3 方法學(xué)考察（減壓干燥樣品）

2.3.3.1 精密度試驗(yàn) 按“2.3.1” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液, 在“2.3.2” 項(xiàng)色譜條件下, 連續(xù)進(jìn)樣6 次, 測得各共有峰相對峰面積和相對保留時(shí)間的RSD 分別在2.54%和0.63% 內(nèi), 表明儀器精密度良好。

2.3.3.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 按“2.3.1” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液, 在“2.3.2” 項(xiàng)色譜條件下, 于配制后0、 2、 4、 6、 8、 10 h 連續(xù)進(jìn)樣6 次, 測得各共有峰相對峰面積和相對保留時(shí)間的RSD 分別在1.71%和0.46%內(nèi), 表明供試品溶液在10 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.3.3 重復(fù)性試驗(yàn) 按“2.3.1” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液6 份, 在“2.3.2” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣, 測得各共有峰相對峰面積和相對保留時(shí)間的RSD 分別在1.74% 和0.43% 內(nèi), 表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.3.4 HPLC 指紋圖譜建立 取3 批經(jīng)4 種干燥方式所得澤瀉湯標(biāo)準(zhǔn)煎液, 按“2.3.1” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液, 在“2.3.2” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣, 得不同干燥方式澤瀉湯標(biāo)準(zhǔn)煎液的HPLC 疊加指紋圖譜, 結(jié)果見圖2。

圖2 12 批樣品HPLC 指紋圖譜Fig.2 HPLC fingerprints of twelve batches of samples

2.3.3.5 相似度分析 以減壓干燥為基準(zhǔn), 采用中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)2004A 版軟件對4 種干燥方式所得3 批澤瀉湯標(biāo)準(zhǔn)煎液HPLC 指紋圖譜進(jìn)行相似度分析, 結(jié)果見表3。

表3 12 批樣品相似度Tab.3 Similarities of twelve batches of samples

其余3 種干燥方式與減壓干燥方式所得HPLC指紋圖譜相似度均值RSD 6.54%, 表明, 不同干燥方式對澤瀉湯標(biāo)準(zhǔn)煎液HPLC 指紋圖譜有一定影響。

2.4 樣品含有量測定

2.4.1 色譜條件[16-17]依利特Supersil C18色譜柱（4.6 mm× 250 mm, 5 μm）； 柱溫35 ℃； 流動相乙腈（A） -水（B）； 體積流量1 mL/min； 檢測波長白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ220 nm, 23-乙酰澤瀉醇B 208 nm；進(jìn)樣量10 μL。

2.4.2 樣品含有量 按“2.3.1” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液, 在“2.4.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣, 以干燥品計(jì)算23-乙酰澤瀉醇B 和白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ的含有量, 結(jié)果見表4。

表4 不同干燥方式各成分含有量測定結(jié)果（μg/g）Tab.4 Results of content determination of various constituents in different drying methods （μg/g）

4 種干燥方式23-乙酰澤瀉醇B 含有量均值的RSD 25.48%, 含有量排序?yàn)槔鋬龈稍铮緶p壓干燥＞常壓干燥＞噴霧干燥； 白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ含有量均值的RSD 25.89%, 含有量排序?yàn)槔鋬龈稍铮緶p壓干燥＞常壓干燥＞噴霧干燥, 表明不同干燥方式所得澤瀉湯標(biāo)準(zhǔn)煎液成分含有量有一定差別, 且減壓干燥與常壓干燥對以上2 種成分含有量的影響差距不大,最終優(yōu)選冷凍干燥。

3 討論

標(biāo)準(zhǔn)煎液作為經(jīng)典名方制劑藥用物質(zhì)確定的基準(zhǔn), 在古代經(jīng)典名方制劑的研制中占有極其重要的地位, 經(jīng)典名方制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)必須依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)煎液進(jìn)行制定。 而如何建立能反應(yīng)理化屬性的指標(biāo)成為其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究的關(guān)鍵[18]。

對中藥整體質(zhì)量進(jìn)行控制是對中藥質(zhì)量評價(jià)的重要途徑, 采用指紋圖譜對其進(jìn)行宏觀綜合分析是1 種有效的手段, 主要有液相、 氣相、 質(zhì)譜、 紫外、 紅外光譜法等[5]。 目前, HPLC 一般是在單一波長下對出峰物質(zhì)進(jìn)行控制, 澤瀉湯標(biāo)準(zhǔn)煎液在單一波長下出峰不多, 無法反映其更多的化學(xué)信息,本研究采用了波長切換的方法, 采集不同保留時(shí)間及不同吸收波長下更多的物質(zhì)信息, 達(dá)到了更好的整體質(zhì)量控制目的。 不同的物料有不同的物理性質(zhì), 本研究建立的物理指紋圖譜包含9 個(gè)二級指標(biāo)去反應(yīng)物料的吸濕性、 流動性及均一性等, 亦可為整體質(zhì)量控制方式。

本研究以減壓干燥方式所得到的物料為基準(zhǔn),與其余3 種干燥方式所得物料的HPLC 和物理指紋譜的相似度、 白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ及23-乙酰澤瀉醇B 含有量測定結(jié)果的RSD 值指為指標(biāo), 通過其大小來判斷不同干燥方式對澤湯湯標(biāo)準(zhǔn)煎液理化性質(zhì)的影響, 方法簡單可行。 結(jié)果表明不同干燥方式對澤瀉湯標(biāo)準(zhǔn)煎液粉末可壓性影響較大； 對HPLC 指紋圖譜中色譜峰3 （未知共有峰） 和色譜峰11 （未知共有峰） 及23-乙酰澤瀉醇B 和白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ的含有量有一定的影響。 綜合考慮, 4 種干燥方式中, 冷凍干燥為澤瀉湯標(biāo)準(zhǔn)煎液的最佳干燥方式。