鎘在黃瓜幼苗中的化學(xué)形態(tài)及亞細(xì)胞分布

閆 雷，朱園辰，陳 辰，張思佳，丁宮堯，喇樂鵬，曲娟娟

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，哈爾濱 150030）

近年來，由于工業(yè)污染源的排放以及化肥農(nóng)藥的不合理使用，導(dǎo)致農(nóng)田土壤鎘污染問題日趨嚴(yán)重。據(jù)統(tǒng)計我國受重金屬污染耕地面積近2000萬hm2[1]。鎘在土壤中遷移能力強，易被植物吸收利用，且鎘對植物的毒性是其他重金屬的2～10倍[2]。當(dāng)過量鎘進(jìn)入植物體后，會通過影響植物生長發(fā)育、抑制葉片的光合呼吸作用、減少其對營養(yǎng)元素的吸收等途徑破壞植物的產(chǎn)量、品質(zhì)和安全。鎘通過食物鏈進(jìn)入人體后，會對人體的骨骼、免疫系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)等造成損傷，嚴(yán)重還會有致癌致畸致突變的風(fēng)險[3]。

重金屬被植物吸收以后，會在植物的各個細(xì)胞、組織和器官中呈現(xiàn)出選擇性分布來減輕重金屬毒害作用[4]。有些超積累植物可以在地上部富集大量的鎘，自身卻不受鎘毒害的影響，而有些不同基因型的作物各器官鎘積累量相同，但受害程度卻有很大差異，這些都與細(xì)胞內(nèi)鎘的亞細(xì)胞分布以及化學(xué)形態(tài)密切相關(guān)[5]。研究發(fā)現(xiàn)超積累植物東南景天細(xì)胞壁與可溶性部分鎘的含量遠(yuǎn)大于細(xì)胞器鎘含量，化學(xué)形態(tài)以氯化鈉（NaCl）提取態(tài)、醋酸（HAc）提取態(tài)和水（H2O）提取態(tài)占優(yōu)勢[6]。生物量相對低的非礦山型水蜈蚣草（Kyllinga brevifolia Rottb）根細(xì)胞壁鎘的占比大于生物量相對高的礦山型水蜈蚣草[7]。鎘敏感型蘿卜品種中細(xì)胞壁鎘含量水平明顯高于鎘耐受型蘿卜品種，而且NaCl提取態(tài)和HAc提取態(tài)的鎘含量也相對較高[8]。因此對鎘在亞細(xì)胞內(nèi)的分布和其以何種化學(xué)形態(tài)存在的研究，更有利于我們明析鎘在植物體內(nèi)的遷移轉(zhuǎn)化和植物耐受機理。

黃瓜是世界上栽培面積最大的蔬菜作物之一，其對鎘響應(yīng)敏感，易受毒害[9]，但目前的研究主要集中于黃瓜對鎘的富集能力以及生理適應(yīng)性[10]，無法全面反映黃瓜對鎘脅迫下的響應(yīng)。鑒于此，作者前期對32種東北常見黃瓜品種進(jìn)行了鎘的耐性篩選，本文選用其中相對敏感品種，采用營養(yǎng)液培養(yǎng)法，探究不同鎘污染條件下，黃瓜幼苗地上部與根部鎘的累積、化學(xué)形態(tài)特征和亞細(xì)胞分布，旨在探究黃瓜吸收鎘的第一高峰期——苗期對鎘的積累特征和耐性機理[11]，為黃瓜對鎘的適應(yīng)性和重金屬污染防治提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試黃瓜品種為“津春9號”。選取飽滿種子在10%H2O2溶液中浸泡30 min，徹底清洗后在30°C溫水中避光催芽24 h，播種于全蛭石育苗盤。待幼苗長至兩葉一心時選取大小均一的幼苗，移栽至泡沫板上于1.5 L全營養(yǎng)液的黑色塑料盆中培養(yǎng)，每盆6株幼苗。水培整個過程都在人工氣候箱中培養(yǎng)（晝/夜12 h/12 h，溫度28℃/20℃，相對濕度65%，光照度10 000 lx/0 lx）。每2 d更換一次營養(yǎng)液并隨機移動塑料盒。營養(yǎng)液配方如下（mmol·L-1）：0.75 K2SO4，0.65 MgSO4，0.01 KCl，0.25 KH2PO4，2.0 Ca（NO3）2，0.1 Fe-EDTA，0.01 H3BO3，1.0× 10-3MnSO4，1.0× 10-4CuSO4，0.05×10-4（NH4）6Mo7O4，1.0×10-3ZnSO4，采用去離子水配制成鹽溶液，用HCl和NaOH調(diào)節(jié)溶液pH至6[12]。

1.2 試驗方法

黃瓜幼苗在營養(yǎng)液體系中培養(yǎng)1周后進(jìn)行鎘處理，實驗共設(shè)6個處理，鎘濃度分別為：0（CK）、10、50、100、200、300 mol·L-1。其中鎘以CdCl2·2.5H2O形式加入。每個處理3次重復(fù)，共6株幼苗。分別在鎘處理1、5、9、13、17 d時取黃瓜幼苗第三片真葉進(jìn)行亞細(xì)胞分布的測定，鎘處理17 d時測量黃瓜地上部與根部的鎘含量及葉片鎘的化學(xué)形態(tài)。

1.3 測定項目

1.3.1 樣品鎘的測定及轉(zhuǎn)移系數(shù)的計算

用去離子水將植物樣品洗凈，將根系用25 mmol·L-1的Na2-EDTA溶液浸泡15 min，去除表面吸附的鎘及其他離子。將清洗干凈的植株分成根部和地上部兩個部分，在信封中烘干至恒質(zhì)量，磨碎備用。采用GB 5009.15—2014的方法進(jìn)行濕式消解，取植物干樣各0.50 g于三角瓶中，加入HNO3-HClO4（9∶1）混合酸10 mL過夜。調(diào)節(jié)沙浴逐級升溫至（196±5）℃，消煮至澄清，潤洗過濾，用1%HNO3定容至25 mL待測，原子吸收分光光度計測定消化液中鎘含量，采用下式確定試樣中鎘含量。

式中：X為試樣中鎘含量，mg·kg-1；C1為試樣消化液中鎘含量，ng·mL-1；C0為空白液中鎘含量，ng·mL-1；V為試樣消化液總體積，mL；m為試樣質(zhì)量，g；1000為換算系數(shù)。

植物對鎘的轉(zhuǎn)移系數(shù)（TF）=地上部分鎘含量（mg·kg-1）/根部鎘含量（mg·kg-1）[13]

1.3.2 亞細(xì)胞組分的分離測定

參考Weigel等[14]的技術(shù)，稱取去離子水洗凈后的新鮮葉片0.50 g，在預(yù)冷的緩沖液中[250 mmol·L-1蔗糖、50 mmol·L-1Tris-HCl（pH 7.5）和1.0 mmol·L-1二硫蘇糖醇]研磨至勻漿，使勻漿最終體積為20 mL。所有處理均在4℃下進(jìn)行：勻漿在3000 r·min-1下離心15 min，分離得到的沉淀部分為細(xì)胞壁組分；將所得上清液在15 000 r·min-1下離心30 min，再次分離得到的沉淀部分為細(xì)胞器組分；上清液為細(xì)胞可溶性部分。

1.3.3 鎘化學(xué)結(jié)合形態(tài)測定

鎘化學(xué)形態(tài)的提取分離采用改進(jìn)的化學(xué)試劑逐步提取法[15]。將0.50 g新鮮黃瓜葉片置于冷凍研缽中，加入20 mL提取劑研磨至勻漿后轉(zhuǎn)入50 mL離心管，在25℃條件下進(jìn)行恒溫振蕩浸提，22 h后離心分離（5000 r·min-1、10 min）并回收上清液。殘渣加入10 mL相同提取劑后繼續(xù)振蕩提取，并每隔2 h更換1次提取劑（重復(fù)2次），每種試劑提取3次，合并3次上清液（共40 mL）于三角瓶中，加入混合酸進(jìn)行消解。提取劑依次采用（1）80%乙醇（提取硝酸鹽、氯化物為主的無機鹽以及氨基酸鹽）；（2）去離子水（H2O，提取有機酸鹽）；（3）1 mol·L-1氯化鈉（NaCl，提取果膠鹽、與蛋白質(zhì)結(jié)合態(tài)或呈吸附態(tài)的重金屬）；（4）2%醋酸（HAc，提取難溶性重金屬磷酸鹽）；（5）0.6 mol·L-1鹽酸（HCl，提取草酸鹽）。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0軟件中的One-way ANOVA模塊進(jìn)行方差分析和顯著性檢驗，采用LSD對數(shù)據(jù)進(jìn)行多重比較；用重復(fù)度量法分析不同時間、不同濃度鎘處理及二者交互效應(yīng)對黃瓜葉片中亞細(xì)胞鎘含量的影響，采用Origin 2018作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃瓜不同器官中的鎘積累

通過17 d的水培處理后可以看出（表1），黃瓜地上部和根部的鎘含量都隨添加的鎘處理濃度增加而顯著上升。當(dāng)鎘處理濃度≤10mol·L-1時，黃瓜地上部鎘含量大于根部鎘含量；相反，當(dāng)鎘處理濃度大于10mol·L-1時，黃瓜幼苗內(nèi)的鎘主要累積在根部。根部的鎘含量變化范圍為 74.42～183.75 mg·kg-1，約為地上部的1.23～1.74倍。轉(zhuǎn)移系數(shù)是衡量植物將鎘從根部轉(zhuǎn)運到地上部能力大小的重要指標(biāo)，轉(zhuǎn)移系數(shù)越大，其轉(zhuǎn)運能力就越強。本研究中，黃瓜的轉(zhuǎn)移系數(shù)介于0.57～1.38之間，隨著鎘處理濃度的升高，轉(zhuǎn)移系數(shù)逐漸下降。

2.2 黃瓜葉片鎘的亞細(xì)胞分布

表2表明不同鎘處理濃度、時間及其交互處理對鎘在黃瓜葉片中各亞細(xì)胞的分布產(chǎn)生極顯著影響。由圖1可知，隨著處理時間的延長和鎘處理濃度的增大，鎘在各亞細(xì)胞組分的含量均有所上升，鎘處理1 d時，黃瓜葉片在300mol·L-1鎘濃度下細(xì)胞壁、細(xì)胞器及可溶性部分的鎘含量為10mol·L-1鎘濃度下的5.8、3.9、3.2倍；而當(dāng)鎘處理17 d時，在300 mol·L-1鎘濃度下細(xì)胞壁、細(xì)胞器及可溶性部分的鎘含量為10mol·L-1鎘濃度下的7.5、11.3、15.9倍。

表1 不同濃度鎘處理下黃瓜幼苗中的鎘含量Table 1 Cadmium contents in cucumber seedlings under the treatments with different concentrations of Cd

表2 黃瓜葉片亞細(xì)胞各組分鎘含量的方差分析Table 2 Analysis of variance of Cd concentration in subcellular fractions of cucumber leaves

圖1 黃瓜葉片亞細(xì)胞各組分的鎘含量Figure 1 Cadmium contents of subcellular components in cucumber leaves

黃瓜葉片亞細(xì)胞組分的分布均表現(xiàn)為可溶性部分＞細(xì)胞壁＞細(xì)胞器（圖2）。其中可溶性部分鎘含量占44.88%～84.94%，遠(yuǎn)大于細(xì)胞器（3.10%～17.05%）與細(xì)胞壁（11.20%～39.66%）。同一時間不同鎘濃度處理下，隨鎘濃度的增大，可溶性組分中的鎘百分比先減小后增大，細(xì)胞壁和細(xì)胞器之和則相反，其中細(xì)胞壁組分鎘的百分比先增大后減小，細(xì)胞器組分鎘的百分比略有減少；同一鎘濃度不同時間下，細(xì)胞壁組分鎘的百分比逐漸減小，可溶性部分鎘的百分比逐漸增大。

2.3 黃瓜葉片中鎘的化學(xué)形態(tài)特征

圖2 黃瓜葉片中亞細(xì)胞組分的鎘含量分配比例Figure 2 Distribution percentages of Cd among different subcellular fractions in leaves of cucumber

在不同化學(xué)形態(tài)中，鎘在H2O和乙醇中遷移活性最強，相應(yīng)提取態(tài)的鎘毒性最強；鎘在HAc和HCl中遷移活性最弱，相應(yīng)毒性最弱；而NaCl提取態(tài)毒性則處于中間位置。在不同鎘濃度下處理17 d后，黃瓜葉片中的鎘主要以NaCl提取態(tài)的形式存在，占各化學(xué)形態(tài)總和的33.69%～54.23%（表3）。隨著鎘處理濃度增大，乙醇提取態(tài)和H2O提取態(tài)比例逐漸升高，NaCl提取態(tài)比例則降低。當(dāng)鎘濃度達(dá)到300mol·L-1時，NaCl提取態(tài)、乙醇提取態(tài)和H2O提取態(tài)占比相近，占比分別為33.69%、30.71%、29.24%。在所有鎘處理條件下，HAc提取態(tài)鎘和HCl提取態(tài)鎘含量最低，其中HAc提取態(tài)鎘所占各化學(xué)形態(tài)總量的比例為2.32%～5.62%，HCl提取態(tài)鎘所占比例為1.23%～7.34%。

3 討論

植物對鎘的富集和轉(zhuǎn)運與植物的耐受解毒能力密切相關(guān)[4]。本實驗中，鎘處理濃度≤10 mol·L-1時，黃瓜的鎘含量分布為地上部大于根部；鎘處理濃度大于10mol·L-1時，鎘含量分布符合大多數(shù)植物的普遍分布規(guī)律——根部大于地上部[16]?？梢姴煌瑵舛孺k處理對黃瓜體內(nèi)鎘的吸收分配有明顯區(qū)別。隨鎘處理濃度升高，轉(zhuǎn)移系數(shù)逐漸下降，說明黃瓜中的鎘從根部向地上部的遷移能力減弱。這可能由于高濃度鎘處理下，黃瓜將大部分鎘滯留在根系中，從而減弱鎘對地上部光合組織的損傷，緩解重金屬對植物生命活動的不良影響[17]。這是黃瓜在一定條件下的自我保護(hù)方式。

重金屬污染物在亞細(xì)胞水平上的選擇性區(qū)域分布可在一定程度上緩解其對生物體的毒性作用[18]。在細(xì)胞水平上，鎘離子由植物細(xì)胞外轉(zhuǎn)運到胞內(nèi)的過程中，植物細(xì)胞壁是其經(jīng)過的第一道屏障，也是儲存鎘的第一個場所[19]。Wang等[5]研究發(fā)現(xiàn)，有49.3%～53.7%的鎘儲存于苧麻葉片細(xì)胞壁中。韓超等[20]對兩種小白菜亞細(xì)胞的研究結(jié)果也表明鎘主要存在于細(xì)胞壁中。在本研究中，不同處理下黃瓜葉片細(xì)胞壁中的鎘也占有較大比例，為11.9%～39.6%。這是因為植物細(xì)胞壁主要由蛋白質(zhì)和多糖（包括纖維素、半纖維素和果膠）組成，它可以為植物體提供羧基、羥基、醛基、氨基，從而吸持鎘離子并限制其在細(xì)胞膜上的轉(zhuǎn)運，而且植物細(xì)胞壁表面帶負(fù)電，鎘離子帶正電，這使得鎘更易于在細(xì)胞壁上絡(luò)合，從而減少進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的鎘[21]。細(xì)胞內(nèi)的可溶性部分主要包括細(xì)胞質(zhì)和液泡。液泡是鎘積累的最大器官。Li等[22]研究發(fā)現(xiàn)在茶樹菇中可溶性部分的鎘分配比例在53%～75%之間。箭舌豌豆葉片中可溶性部分的鎘高達(dá)87.2%[23]。本研究結(jié)果與這些結(jié)果相似，可能是由于液泡中含有大量的富硫態(tài)和有機酸，可以螯合并分隔鎘，從而避免重金屬對細(xì)胞器的損傷[24]。細(xì)胞器是植物體的核心也是較活躍的部分，本研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞器內(nèi)鎘的含量最小，且隨著鎘處理濃度增大，細(xì)胞器的鎘百分比略有減少。有研究發(fā)現(xiàn)，植物在受到鎘脅迫時，會將大量鎘絡(luò)合在可溶性部分；或者大量鎘儲存于細(xì)胞壁上，僅有部分進(jìn)入胞內(nèi)[25]。本研究表明黃瓜葉片細(xì)胞同時存在上述兩種結(jié)合方式，但以可溶性部分的絡(luò)合為主導(dǎo)。隨著鎘處理濃度的提高或處理時間的延長，細(xì)胞壁上的鎘占比減少，這主要是因為植物細(xì)胞壁的截留能力有限，當(dāng)外界鎘濃度達(dá)到較高水平時，細(xì)胞器會受到一定鎘脅迫，其內(nèi)的高爾基體受到傷害后會直接引起新形成的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，從而導(dǎo)致細(xì)胞壁吸持鎘的能力減弱[26]。相同時間，不同鎘濃度處理下，可溶性部分鎘的百分比先減小后增大，這類似于Floodgate原理[27]，低鎘濃度時進(jìn)入胞內(nèi)的鎘會減少，但當(dāng)鎘濃度超過某一閾值時，進(jìn)入胞內(nèi)的鎘會突然增大。

表3 黃瓜葉片中鎘的化學(xué)形態(tài)分布（mg·kg-1FW）Table 3 Chemical distribution of cadmium in cucumber leaves（mg·kg-1FW）

鎘的化學(xué)形態(tài)與生物體內(nèi)鎘的毒性和遷移能力有關(guān)，鎘主要存在的化學(xué)形態(tài)不同，其生物體表現(xiàn)出的功能也隨之產(chǎn)生差異[18]。Zhao等[28]研究發(fā)現(xiàn)，可食用海藻中大部分鎘在2%HAc提取液中獲得。Weng等[29]對紅樹林研究后發(fā)現(xiàn)NaCl提取態(tài)和HAc提取態(tài)的鎘占優(yōu)勢。賀遠(yuǎn)等[30]研究發(fā)現(xiàn)，煙草根系鎘主要以H2O提取態(tài)為主，葉片中的鎘大部分為HAc結(jié)合態(tài)。本研究發(fā)現(xiàn)，在黃瓜葉片中NaCl提取態(tài)鎘的分配比例最大。這與對茶樹菇[21]、花生[31]的研究結(jié)果相似。說明蛋白質(zhì)、果膠等配體在減輕鎘毒性上發(fā)揮了重要作用。鎘進(jìn)入黃瓜中會通過與有機配體絡(luò)合作用，減少鎘游離離子，從而降低鎘的遷移活性和毒性。隨著鎘處理濃度的提高，黃瓜葉片中乙醇提取態(tài)和H2O提取態(tài)鎘的分配比例不斷升高，而NaCl提取態(tài)鎘的分配比例不斷降低。楊嵐鵬[32]對欒樹的研究也發(fā)現(xiàn)了類似結(jié)果，提高鎘濃度時，鎘的水溶態(tài)和無機鹽態(tài)分配比例增大?？梢娫诟哝k濃度時，黃瓜中存在向高遷移活性形態(tài)轉(zhuǎn)化的趨勢。綜合考慮亞細(xì)胞與化學(xué)形態(tài)，鎘耐性植物的細(xì)胞壁占有高比例鎘，鎘非耐性植物液泡占有高比例鎘[33]。而黃瓜屬于鎘非耐性植物，當(dāng)鎘濃度增大時，會造成細(xì)胞壁和原生質(zhì)膜通透性增加，截留能力衰退，使大量的鎘進(jìn)入胞內(nèi)，導(dǎo)致與細(xì)胞壁上蛋白質(zhì)、果膠等物質(zhì)結(jié)合的鎘（NaCl提取態(tài)鎘）減少。鎘在HAc提取態(tài)和HCl提取態(tài)所占比例較低，表明黃瓜葉片中難溶性重金屬磷酸鹽和草酸鹽類物質(zhì)較少，對鎘的吸持能力有限，這可能是因為硫醇基團(tuán)和低分子量有機化合物的影響所致[34]。

4 結(jié)論

（1）隨鎘處理濃度升高，鎘的轉(zhuǎn)移系數(shù)逐漸降低，黃瓜內(nèi)鎘由根向地上部的轉(zhuǎn)運能力減弱。

（2）黃瓜葉片中鎘主要分布在可溶性組分中，其次是細(xì)胞壁，細(xì)胞器內(nèi)含量很少。隨鎘處理濃度增大或處理時間的延長，細(xì)胞壁組分鎘的占比降低，可溶性部分鎘占比增大。黃瓜會通過降低細(xì)胞壁吸持鎘的能力，提升液泡區(qū)室化作用的方式來應(yīng)對高濃度鎘和長時間脅迫。

（3）低鎘處理濃度時，黃瓜葉片的鎘主要以NaCl提取態(tài)形式存在；隨鎘處理濃度增大，乙醇提取態(tài)和H2O提取態(tài)的鎘占比逐漸增大，黃瓜有向高遷移活性狀態(tài)轉(zhuǎn)化的趨勢。高鎘處理濃度（300mol·L-1）時，黃瓜葉片中鎘形態(tài)以乙醇提取態(tài)、NaCl提取態(tài)和H2O提取態(tài)為主要形態(tài)。