結(jié)直腸癌患者 KRAS、NRAS、BRAF基因突變與臨床病理特征關(guān)系的研究

贠 田，王長(zhǎng)松，李富林，呂學(xué)霞，蒙念龍，高春芳

散發(fā)性結(jié)直腸癌是消化道最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，發(fā)病率和病死率長(zhǎng)期高居惡性腫瘤前列。結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展是多基因、多步驟的復(fù)雜過(guò)程，個(gè)體差異較大，隨著精準(zhǔn)治療時(shí)代的來(lái)臨，基于基因檢測(cè)治療策略的選擇在提升結(jié)直腸癌的診治水平中發(fā)揮著巨大的作用，在結(jié)直腸癌靶向治療過(guò)程中檢測(cè)KRAS、NRAS、BRAF基因突變狀態(tài)對(duì)于結(jié)直腸癌的治療有很重要的意義［1，2］。結(jié)直腸癌是一個(gè)復(fù)雜的多基因參與的疾病，這些個(gè)體化藥物的靶點(diǎn)基因在結(jié)直腸癌中起到關(guān)鍵的作用，因此探討這些靶點(diǎn)與病理學(xué)因素之間的關(guān)系也很有必要。此前也有很多的文獻(xiàn)對(duì)這些基因進(jìn)行研究，但是學(xué)者們對(duì)于這些基因與臨床病理之間的關(guān)系眾說(shuō)紛紜，因此該文采用大樣本量的病例更進(jìn)一步研究在結(jié)直腸癌患者中，KRAS、NRAS、BRAF 基因狀態(tài)與病理學(xué)因素之間的關(guān)系，以便能得到一個(gè)更確切的結(jié)果。

1 資料與方法

1.1 一般資料所有檢測(cè)樣本均來(lái)自2013年9月—2017年7月筆者所在醫(yī)院病理科留存蠟塊389例，均為結(jié)直腸癌病理診斷明確的腫瘤標(biāo)本。其中男 225例，女 164例；年齡27～92歲，中位年齡 60歲。所有患者均經(jīng)病理組織學(xué)檢查，確診為結(jié)直腸癌患者。所有患者在做KRAS、NRAS、BRAF檢測(cè)前均知情同意并簽署知情同意書。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 主要試劑和儀器 石蠟組織樣本DNA分離試劑盒購(gòu)自福建廈門艾德有限公司，KRAS、NRAS、BRAF基因突變檢測(cè)試劑盒購(gòu)自廈門艾德公司。核酸蛋白質(zhì)濃度測(cè)量?jī)xB-500購(gòu)自上海創(chuàng)萌生物科技有限公司，Mx3000P實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀購(gòu)自美國(guó)Stratagene公司。

1.2.2 DNA提取 比照蘇木精-伊紅染色在顯微鏡下標(biāo)記腫瘤區(qū)域，切片過(guò)程中僅選取相關(guān)腫瘤區(qū)域，將含有腫瘤區(qū)域的DNA組織的蠟塊10μm厚連續(xù)切片5張，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明步驟進(jìn)行操作。DNA提取后應(yīng)用核酸蛋白質(zhì)濃度測(cè)量?jī)x測(cè)量DNA質(zhì)量及濃度。按照測(cè)量的DNA濃度稀釋至2～5 mg/L備用。

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè) KRAS基因突變檢測(cè)試劑盒檢測(cè)KRAS基因的12、13、61密碼子上的7種突變類型。NRAS檢測(cè)外顯子2的12、13密碼子，外顯子3的59、61密碼子，外顯子4的117、146密碼子。BRAF基因突變檢測(cè)15外顯子上的V600E突變。檢測(cè)儀器使用的是美國(guó)的Agilent Mx3000P。檢測(cè)程序按照試劑盒說(shuō)明書設(shè)定。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析所有數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件，結(jié)果運(yùn)用χ2檢驗(yàn)及Fisher確切概率法，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，并設(shè)定P值為雙側(cè)分布，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 KRAS基因突變與臨床病理參數(shù)之間的相關(guān)性檢測(cè)結(jié)直腸癌中KRAS基因第12、13位密碼子7種熱點(diǎn)突變，總突變率為42.4%（165/389）。389例結(jié)直腸癌中，KRAS基因在直腸的突變率 （50%，120/240） 顯著高于結(jié)腸 （30.2，45/149，P＜0.05）。KRAS基因突變與性別，年齡、腫瘤分化程度，TNM分期，有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移特征無(wú)明顯相關(guān)（P＞0.05）。 見(jiàn)表 1。

2.2 NRAS基因突變與臨床病理參數(shù)之間的相關(guān)性檢測(cè)結(jié)直腸癌中 NRAS基因第 12、13、59、61、117和146密碼子突變，總突變率為4.6%（18/389）。389例結(jié)直腸癌中，NRAS基因突變率與患者年齡、性別、腫瘤部位、腫瘤分化程度、TNM分期，有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及有無(wú)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移其他臨床病理特征無(wú)明顯相關(guān)（P＞0.05，表1）。 NRAS基因突變的結(jié)直腸癌中未同時(shí)檢測(cè)到KRAS基因突變。

表1 389例結(jié)直腸癌患者KRAS、NRAS和BRAF基因突變分析

表2 389例結(jié)直腸癌患者KRAS、NRAS和BRAF基因突變分析

2.3 BRAF基因突變與臨床病理參數(shù)之間的相關(guān)性檢測(cè)結(jié)直腸癌中BRAF基因第600位密碼子突變 GTG→GAG （V600E），突變率為 4.1%（16/389）。389例結(jié)直腸癌患者中，BRAF基因突變與患者年齡、性別、腫瘤部位、腫瘤分化程度、TNM分期、有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及有無(wú)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移無(wú)相關(guān)性 （P＞0.05，表1）。BRAF基因V600E突變的結(jié)直腸癌中未同時(shí)檢測(cè)到KRAS基因突變。

2.4 KRAS、NRAS和BRAF基因突變分析在389例結(jié)直腸癌患者中，KRAS基因突變率為42.4%（165/389），12、13密碼子中檢測(cè)的 7個(gè)常見(jiàn)突變的比 率 分 別 為 GGT→GAT （14.7% ），GGT→GTT（7.96%），GGC→GAC （7.46%），GGT→GCT（6.94），GGT→TGT （2.31%），GGT→AGT （2.06%），GGT→CGT（0.77%）。其中以 GGT→GAT突變率最高14.7%，最為常見(jiàn)，GGT→GTT（7.96%）次之。 NRAS總突變率為 4.6%（18/389）， 在 12、13、61、117 和146密碼子中檢測(cè)17種常見(jiàn)的突變，其中共有4種常見(jiàn)的突變，位于12、13和61密碼子上，分別為：GGT→GAT（12 號(hào)密碼子 0.8%）、GGT→GAT（13 號(hào)密碼子 0.5%）、GAA→CTA （1.8%）、GAA→AAA（1.5%）。BRAF 基因 V600E點(diǎn)突變率 4.1%（16/389）。 見(jiàn)表 2。

3 討論

結(jié)直腸癌是人類最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，近年來(lái)其發(fā)病率呈明顯上升趨勢(shì)，逐漸成為一種嚴(yán)重危害人類健康的惡性疾病。隨著靶向治療的應(yīng)用，結(jié)腸癌患者預(yù)后有了明顯改善［2，3］。 KRAS、NRAS 以及BRAF是Ras-Raf-MEK-ERK通路中的重要組成部分，而該通路對(duì)于細(xì)胞增殖、分化、基因表達(dá)、有絲分裂以及細(xì)胞凋亡有重要的調(diào)控作用。

結(jié)直腸癌KRAS基因突變率為30%～60%，結(jié)直腸癌中KRAS基因突變主要集中12、13密碼子上［4］。 該實(shí)驗(yàn) KRAS基因總突變率為 42.4%（165/389），在389例結(jié)直腸癌中，KRAS基因在直腸的突變率（50%，120/240）顯著高于結(jié)腸（30.2，45/149，P＜0.05），表現(xiàn)在直腸中KRAS基因更易發(fā)生突變。目前的研究熱點(diǎn)對(duì)于右半結(jié)腸與左半結(jié)腸由于胚胎來(lái)源的差異，其分子特征、致癌基質(zhì)等方面也存在相應(yīng)的差異已經(jīng)得到各界的認(rèn)可。對(duì)于結(jié)腸和直腸由于部位、功能的差異是否也存在著基因的差異有待進(jìn)一步的研究。

NRAS是RAS基因家族中的一員。NRAS基因在結(jié)直腸癌中突變率為1%～6%，NRAS突變主要位于外顯子2、3、4的多個(gè)密碼子上，這些密碼子編碼的氨基酸是RAS蛋白和GTP酶活化蛋白（GAP）的作用位點(diǎn)，突變可導(dǎo)致RAS-GTP處于持續(xù)激活狀態(tài)，引起細(xì)胞惡性增殖和轉(zhuǎn)移［5］。NRAS在結(jié)直腸癌中突變率報(bào)道并不多見(jiàn)，有國(guó)外的研究發(fā)現(xiàn)，NRAS的突變率不高，在西方人中大約為3.8%，亞洲人的突變率為 3.6%，阿拉伯人中的突變率為 4%［6，7］。 該研究發(fā)現(xiàn)NRAS的突變率為4.6%，與國(guó)內(nèi)外的大多數(shù)研究結(jié)果相同。在NRAS的突變與臨床病理特征之間的關(guān)系方面，國(guó)外的研究并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)NRAS突變與之有關(guān)的病理特征。該研究389例結(jié)直腸癌患者中，NRAS總突變率為4.6%（18/389），總體突變率不高。同時(shí)沒(méi)有發(fā)現(xiàn)NRAS的突變結(jié)直腸癌患者年齡，性別，腫瘤分化程度，TNM分期，有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移特征明顯相關(guān)性（P＞0.05）。

BRAF基因位于7q34，長(zhǎng)約190kb，在絕大多數(shù)組織和細(xì)胞類型中，BRAF是MEK/ERK最為關(guān)鍵的激活因子。BRAF蛋白的主要功能為有絲蛋白激酶（MAPK）通路中的絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶，該激酶將幫助信號(hào)從RAS轉(zhuǎn)導(dǎo)至MEK1/2，參與調(diào)控細(xì)胞內(nèi)多種生物學(xué)事件，如細(xì)胞生長(zhǎng)、分化和凋亡等［8］。對(duì)于BRAF基因在結(jié)直腸癌中突變率研究國(guó)內(nèi)外也存在著很多不一致，在西方人群中BRAF的突變率為9.2%，亞洲人群的突變率為4.9%，中東人群的突變率為4.6%［9］。國(guó)內(nèi)的研究認(rèn)為，BRAF的突變率為3%～8%［10］，在BRAF基因突變主要與腫瘤直徑、患者年齡以及有無(wú)轉(zhuǎn)移有相關(guān)性。而在該研究中發(fā)現(xiàn)，BRAF基因與患者年齡有相關(guān)性 （P＜0.05），與患者性別，腫瘤分化程度，TNM分期，有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移特征無(wú)明顯相關(guān) （P＞0.05）。與臨床病理關(guān)系存在突變率差異的原因有多方面的，樣本量的多少會(huì)直接影響統(tǒng)計(jì)的結(jié)果，檢查方法的不同，也會(huì)造成結(jié)果的差異性。

綜上所述，對(duì)KRAS、NRAS及BRAF基因進(jìn)行分析，KRAS的突變率明顯高于NRAS與BRAF，可見(jiàn)在結(jié)直腸癌中KRAS突變時(shí)常見(jiàn)的生物學(xué)事件，而在KRAS突變的患者中并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)NRAS以及BRAF突變，可見(jiàn)三者的發(fā)生是屬于相互聯(lián)系的通路，一個(gè)基因發(fā)生突變將制約另外兩個(gè)基因的發(fā)生改變。KRAS、NRAS和BRAF基因檢測(cè)人群的篩選對(duì)結(jié)直腸癌患者治療方案的選擇意義重大，能夠更有效地指導(dǎo)精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)個(gè)體化治療。