對(duì)峙培養(yǎng)法在生防菌抑制效果研究中的應(yīng)用

田書鑫，劉南南，王桂清

(聊城大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，山東 聊城 252000)

植物在生長發(fā)育和貯藏運(yùn)輸過程中，遭受病原微生物的侵染引起病害是常見現(xiàn)象，導(dǎo)致農(nóng)作物、蔬菜、果樹等產(chǎn)量降低、品質(zhì)變劣，致使國家經(jīng)濟(jì)遭受嚴(yán)重?fù)p失。為了降低植物病害引起的經(jīng)濟(jì)損失，必須對(duì)植物病害的發(fā)生進(jìn)行預(yù)防和防治，化學(xué)防治和生物防治是防控植物病害的常用方法。隨著科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步、人類生活質(zhì)量的提高和對(duì)生存環(huán)境要求的提高，化學(xué)防治的弊端越來越被詬病，于是,能夠克服化學(xué)防治缺點(diǎn)的生物防治越來越受到重視[1]。生物防治最主要的內(nèi)容之一是利用微生物進(jìn)行防治。微生物農(nóng)藥，包括農(nóng)用抗生素和活體微生物農(nóng)藥，主要是利用微生物或其代謝產(chǎn)物來防治危害農(nóng)作物等的有害生物，而且可以促進(jìn)作物生長、提高產(chǎn)品品質(zhì)，有利于農(nóng)村經(jīng)濟(jì)增長和農(nóng)民增收，生態(tài)效益、社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益不可估量。

為了明確有益微生物或其次生代謝產(chǎn)物的抑(殺)菌效果和作用范圍，首先必須采用適當(dāng)?shù)姆椒ㄟM(jìn)行抑菌活性研究，這是將其開發(fā)成微生物農(nóng)藥的第一步，而對(duì)峙培養(yǎng)法是常用的研究方法。通過對(duì)峙培養(yǎng)可以明確生防菌的抑菌效果與抑菌方式，從而預(yù)估該生防菌的應(yīng)用前景。為了更深入地了解對(duì)峙培養(yǎng)方法，對(duì)不同對(duì)峙培養(yǎng)方法的操作步驟、特點(diǎn)和適用生防菌種類等進(jìn)行了總結(jié)，以期為選擇合適的方法進(jìn)行抑菌活性研究提供有力依據(jù)。

1 對(duì)峙培養(yǎng)的意義

對(duì)峙培養(yǎng)是檢測(cè)供試生防菌(或代謝產(chǎn)物)與病原菌是否存在拮抗作用的一種方法，通過將2種菌同時(shí)培養(yǎng)在培養(yǎng)基中，或者將一系列病原菌接入含生防菌發(fā)酵液的培養(yǎng)基中，再采用不同的放置方法和手段培養(yǎng)，觀測(cè)其生長狀態(tài)，并檢查其菌絲與孢子的變化，根據(jù)抑菌圈大小、菌落直徑變化程度和病原菌形態(tài)有無變化等，最終確定生防菌對(duì)一系列病原菌抑菌能力的強(qiáng)弱[2]。

通過對(duì)峙培養(yǎng)，首先可以明確抑菌效果，即明確生防菌(包括其代謝產(chǎn)物，下同)對(duì)一系列真菌、細(xì)菌及其他致病菌的抑菌能力；其次可以初步了解抑菌方式，即通過對(duì)菌絲與孢子形態(tài)的觀察明確其抑菌方式，包括菌絲的競(jìng)爭(zhēng)、纏繞或次生代謝物的刺激等。通過明確生防菌的抑菌能力與抑菌方式，可以預(yù)估該生防菌的應(yīng)用前景，為進(jìn)一步明確其抑菌活性物質(zhì)，研究其抑菌機(jī)制，研發(fā)新的先導(dǎo)化合物，開發(fā)新型微生物殺菌劑奠定理論依據(jù)。

2 對(duì)峙培養(yǎng)的方法及應(yīng)用

對(duì)峙試驗(yàn)由于操作方法的不同可分為菌餅法、菌液法、劃線法和擴(kuò)散法4種形式，方法不同，操作步驟、特點(diǎn)和適用范圍不同。

2.1 菌餅法

菌餅法是最常使用的對(duì)峙培養(yǎng)方法，常用于有益生防真菌和細(xì)菌的抑菌活性測(cè)定，該方法可通過觀察生防菌與病原菌的生長狀態(tài)，進(jìn)一步明確生防菌的抑菌方式，如競(jìng)爭(zhēng)、抑制、纏繞、重寄生等。該法按接種菌餅數(shù)量和放置位置又分為菌餅兩點(diǎn)法與菌餅多點(diǎn)法(Multiple fungus cake method, MFCM)，多點(diǎn)法又區(qū)分為3種，具體如下。

2.1.1 菌餅兩點(diǎn)法(Two fungus cake method，TFCM2) 菌餅兩點(diǎn)法是對(duì)峙試驗(yàn)中操作最簡(jiǎn)單、使用最頻繁的一種方法，僅需要將生防菌與病原菌的菌餅接種于相距20 mm以上的同一平板培養(yǎng)基的兩點(diǎn)，培養(yǎng)一定時(shí)間后，觀察生長情況，計(jì)算抑菌率。

木霉菌(Trichoderma)屬于半知菌類的絲孢綱叢梗孢目叢梗孢科，是一類普遍存在的、具有廣譜性的拮抗生防菌，具有適應(yīng)廣泛性、寄生廣譜性、拮抗物多樣性和環(huán)境友好性等特點(diǎn)，已經(jīng)成功地應(yīng)用于植物病害等的防治。綠色木霉(T.viride)、長枝木霉(T.longibrachiatum)、哈茨木霉(T.harzianum)等生防木霉菌對(duì)棉花黃萎病菌(Verticilliumdahliae)、松枯枝病菌(Cenangiumferruginosum)、小麥根腐病菌(Bipolarissorokiniana)等的拮抗作用[3-7]試驗(yàn)均采用的是菌餅兩點(diǎn)法，證實(shí)了生防木霉菌強(qiáng)大的抑菌活性；在對(duì)峙培養(yǎng)過程中進(jìn)一步通過顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，木霉菌菌絲緊貼或者纏繞致病菌菌絲，逐漸覆蓋或深入到致病菌的菌落內(nèi)部，在菌絲上生長并產(chǎn)孢，使致病菌菌絲被纏繞的部分出現(xiàn)明顯萎縮、退化，最終使菌絲斷裂、解體直至死亡[8-9]，從而明確了木霉菌的抑菌方式。

2.1.2 菌餅三點(diǎn)法(Three fungus cake method，TFCM3) 該方法是菌餅兩點(diǎn)法的延伸，操作雖然簡(jiǎn)單，但僅限于菌體生長前期就表現(xiàn)出較強(qiáng)抑菌活性的生防菌的抑菌試驗(yàn)。三點(diǎn)在培養(yǎng)皿中呈直線排列，其中，中間菌餅為生防菌，兩側(cè)為病原菌(既可以是同一種，也可以是不同種)，病原菌沿生防菌左右對(duì)稱分布。通過測(cè)量菌落直徑和抑菌圈大小，判斷生防菌的抑菌活性強(qiáng)弱。任飛娥[10]從土壤中分離得到95株細(xì)菌，以其中1株來源于貝母土壤的菌株BM5(多黏類芽孢桿菌，Paenibacilluspolymyxa)為測(cè)試對(duì)象，采用菌餅三點(diǎn)法研究了其生防作用，結(jié)果表明，該菌株對(duì)水稻紋枯病菌(Thanatephoruscucumeris)具有較強(qiáng)的拮抗效果，對(duì)其他7種病原真菌具有一定的抑制作用，說明該菌株的生防作用具有廣譜性，開發(fā)應(yīng)用前景廣闊。

2.1.3 菌餅四點(diǎn)法(Four fungus cake method，F(xiàn)FCM4) 該方法也是菌餅兩點(diǎn)法的延伸，此種方法可同時(shí)研究1種生防菌對(duì)幾種病原菌的抑菌活性，也可同時(shí)研究幾種生防菌對(duì)1種病原菌的抑制效果。王美琴等[11]等采用此方法，以芽孢桿菌(Bacillus)為生防菌，測(cè)定了其對(duì)多種病害致病菌的拮抗作用，最終發(fā)現(xiàn)其對(duì)番茄灰霉病菌(Botrytiscinerea)和番茄葉霉病菌(Fulviafulva)的抑制效果穩(wěn)定，抑菌帶明顯。

菌餅四點(diǎn)法的操作流程：將病原菌(或生防菌)接種于培養(yǎng)基中央，在其周圍3個(gè)不同位置(距離中央菌餅的距離相同)分別接上3種不同的生防菌(或病原菌)，培養(yǎng)一段時(shí)間后，觀察生防菌對(duì)病原菌的抑制作用。該方法同菌餅三點(diǎn)法一樣，適用于菌體生長前期便表現(xiàn)出較強(qiáng)抑菌活性的生防菌的活性測(cè)定。

2.1.4 菌餅五點(diǎn)法(Five fungus cake method，F(xiàn)FCM5) 五點(diǎn)法比上述3種方法更為方便，在同一皿中即可實(shí)現(xiàn)多次重復(fù)，但其局限性是僅適用于短時(shí)間內(nèi)就表現(xiàn)出抑制效果的生防菌?？蓪⑴囵B(yǎng)好的生防菌(或病原菌)菌餅接種于培養(yǎng)基中央，采用十字交叉法在以生防菌(或病原菌)菌餅為中心的≥20 mm十字線上的4點(diǎn)處接種病原菌(或生防菌)，恒溫培養(yǎng)一定時(shí)間后測(cè)量菌落直徑，計(jì)算抑菌率。

五點(diǎn)法在生防細(xì)菌的活性測(cè)定中被廣泛應(yīng)用。植物內(nèi)生細(xì)菌以其占據(jù)有利的生態(tài)位、不易受環(huán)境條件影響、能夠很好地定植于植株的相應(yīng)部位、可抵抗病原物入侵等獨(dú)有的優(yōu)勢(shì)，成為植物病害生物防治的潛在資源菌。趙超等[12]、周國旺等[13]、王西祥等[14]采用菌餅五點(diǎn)法，研究了熒光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、蘇云金芽孢桿菌(B.thuringiensis)等生防細(xì)菌對(duì)芒果炭疽病菌(Colletotrichumgloeosporioiles)、芒果蒂腐病菌(Botryodiplodiatheobromae)、馬鈴薯腐皮鐮刀病菌(Fusariumsolani)等致病真菌的抑菌活性，表明3種細(xì)菌均具有較強(qiáng)的抑制效果且抑菌譜廣泛；進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，枯草芽孢桿菌可以成功定植于植物根際、體表或體內(nèi)，與病原菌競(jìng)爭(zhēng)植物周圍的營養(yǎng)，并分泌抗菌物質(zhì)，如細(xì)菌素、細(xì)胞壁水解酶等酶類和活性蛋白質(zhì)類等物質(zhì)，以抑制病原菌生長，同時(shí)誘導(dǎo)植物防御系統(tǒng)抵御病原菌入侵，從而達(dá)到生物防治的目的。

菌餅法雖然適用范圍廣，但要結(jié)合生防菌或病原菌的生長速率因素，選用適宜的具體方法進(jìn)行抑菌試驗(yàn)。對(duì)于生長速率不一致的2個(gè)或多個(gè)菌種，需要考慮生長速率與時(shí)間的關(guān)系，部分菌種需要延長接種時(shí)間，從而減小菌種自身生長速率對(duì)試驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生的影響。若遇到這種情況，需先將生長較慢的菌種接入平板，讓其先生長一定時(shí)間，再接種生長較快的菌種，培養(yǎng)至所接種的菌餅均距離培養(yǎng)基平板邊緣5 mm左右時(shí)進(jìn)行數(shù)據(jù)測(cè)量，但具體延長時(shí)間需依據(jù)所研究菌種的培養(yǎng)特性決定。不同菌餅法的特點(diǎn)和適用生防菌范圍比較如表1所示。

表1 菌餅法的特點(diǎn)和適用生防菌種類Tab.1 Features of fungus cake method and applicable biocontrol species

2.2 菌液法

菌液法是繼菌餅法之后的另一種常用的對(duì)峙培養(yǎng)方法，該方法利用的不是生防菌的菌餅，而是其發(fā)酵液，主要用于生防真菌、細(xì)菌和酵母菌等次生代謝物質(zhì)的生防效果研究。根據(jù)菌液在培養(yǎng)基上的滴加方式，可將菌液法分為涂布法、混勻法和五點(diǎn)法，不同菌液法的特點(diǎn)和所適用的生防菌范圍如表2所示。

表2 菌液法的特點(diǎn)和適用生防菌種類Tab.2 Features of solution method and applicable biocontrol species

2.2.1 菌液涂布法(Solution coating method，SCM) 涂布法即在培養(yǎng)基上滴加一定量的生防菌菌液，用無菌涂布棒涂勻并晾干，再接種病原菌，恒溫?zé)o菌條件下培養(yǎng)，通過計(jì)算抑制率，從而明確生防菌活性物質(zhì)的抑菌效果。張?jiān)赖萚15]在研究生防淺白酵母菌(Cryptococcusalbicans)對(duì)葡萄灰霉病菌和柑橘青霉病菌(Penicilliumdigitatum)的抑菌效果時(shí)采用了涂布的方法，結(jié)果表明，淺白酵母菌的抑菌活性好，抑制率高達(dá)83.1%和82.8%。

2.2.2 菌液混勻法(Solution blending method，SBM) 該方法是先將菌液與培養(yǎng)基按一定濃度及一定比例混勻，以不加菌液為對(duì)照，接種病原菌培養(yǎng)一段時(shí)間后，采用十字交叉法測(cè)量菌落直徑，計(jì)算抑制率。此方法操作簡(jiǎn)捷，效果良好，被學(xué)者們廣泛應(yīng)用于細(xì)菌、真菌等生防菌活性物質(zhì)的篩選研究中。為了明確枯草芽孢桿菌EBS05菌株對(duì)12種農(nóng)作物致病菌的抑菌活性，李剛等[16]首先利用酸沉淀法提取了該菌株的脂肽類抗生素，之后采用混勻法測(cè)定了抗生素對(duì)菌絲生長速率的抑制作用，其中，對(duì)小麥紋枯病菌(Rhizoctoniacerealis)的作用效果最佳，抑菌中質(zhì)量濃度(EC50)為0.012 mg/mL。甘林等[17]通過振蕩培養(yǎng)并經(jīng)細(xì)菌過濾膜過濾得到木霉菌株FJ2006-8發(fā)酵液，采用混勻法研究了其對(duì)番茄灰霉病菌的抑菌效果，并分析出主要活性物質(zhì)為聚酮類、氨基酸及其衍生物、萜烯類等。

2.2.3 菌液五點(diǎn)法(Five-spot solution method，F(xiàn)SM) 菌液五點(diǎn)法類似于菌餅五點(diǎn)法，即于中央放置病原菌菌餅，四周4點(diǎn)滴加供試生防菌菌液。一般情況下，首先制備生防菌菌液，并將其按一定量(如4 μL)滴加于培養(yǎng)基周圍選定的4點(diǎn)處，在培養(yǎng)基中央位置接種病原菌，根據(jù)有無抑菌圈及抑菌帶的寬度，判斷供試生防菌的拮抗效果。萎縮芽孢桿菌(B.atrophaeus)和枯草芽孢桿菌次生代謝物質(zhì)對(duì)番茄早疫病菌(Alternariasolani)的抑制效果試驗(yàn)便是采用了菌液五點(diǎn)法，研究發(fā)現(xiàn)，2種細(xì)菌的次生代謝物質(zhì)均可以抑制番茄早疫病菌菌絲的生長，導(dǎo)致其菌絲明顯畸形，從而發(fā)揮生防效果[18]。

真菌、細(xì)菌、酵母菌均可采用菌液法進(jìn)行生防效果測(cè)定，其中，混勻法與涂布法最為常用?；靹蚍ㄊ菍⒕褐苯踊旌嫌谂囵B(yǎng)基中，因此菌液分布均勻，病原菌生長均勻，抑菌效果準(zhǔn)確，但要求混合前培養(yǎng)液溫度不能太高，以免破壞菌液的生防活性；而涂布法是將菌液涂于培養(yǎng)基表面，使病原菌與菌液直接接觸，最大程度地發(fā)揮抑菌活性，但該方法操作時(shí)需要借助涂布器，往往會(huì)出現(xiàn)菌液涂布不均勻現(xiàn)象，從而導(dǎo)致病原菌菌落長勢(shì)不均，同時(shí)，由于菌液的濃度和顏色不同，可能會(huì)影響病原菌長勢(shì)的觀察和測(cè)量。

2.3 劃線法

劃線法常用于個(gè)體十分微小的細(xì)菌或放線菌等菌種，該菌種既可是生防供試菌或病原對(duì)象菌中的1種，也可同時(shí)作為兩者中的2種。根據(jù)生防菌與病原菌的生長速率差異，將劃線法具體分為即時(shí)劃線法和延時(shí)劃線法。

2.3.1 即時(shí)劃線法(Simultaneously lining method，SLM) 即時(shí)劃線法是于培養(yǎng)基一側(cè)接種病原菌，距其30 mm處接種供試生防菌，培養(yǎng)一段時(shí)間后，根據(jù)抑菌帶寬度判斷生防菌的抑菌效果。王雪潔等[19]采用即時(shí)劃線法研究了葡萄內(nèi)生細(xì)菌銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)對(duì)10種植物致病菌的抑菌活性，結(jié)果表明，其對(duì)辣椒疫霉菌(Phytophthoracapsici)、番茄灰霉病菌的抑菌帶寬度分別為17.13、15.60 mm，對(duì)其他幾種病原菌的抑菌帶寬度也均≥5 mm，表明該菌具有很高的開發(fā)價(jià)值。血紅柳釘菇(Gomphidiusviscidus)對(duì)土傳病原菌有較強(qiáng)的抑菌活性，可將根癌菌(Agrobacteriumtumefaciens)菌絲完全覆蓋并殺死，該研究結(jié)果獲得所采用的試驗(yàn)方法為即時(shí)劃線法[20]。

2.3.2 延時(shí)劃線法(Delay marking method，DMM) 放線菌是一類廣泛分布于自然界、能產(chǎn)生多種抗生物質(zhì)的拮抗微生物，在放線菌的抑菌活性研究中普遍采用延時(shí)劃線法。該方法是在即時(shí)劃線法的基礎(chǔ)上發(fā)展而來的，當(dāng)生防供試菌或病原對(duì)象菌生長速度較慢時(shí)均可采用延時(shí)法：首先將生長較慢的一方接種于培養(yǎng)基表面一側(cè)，待生長至一定大小時(shí)，在另一側(cè)劃線接種生長較快的另一方，培養(yǎng)一定時(shí)間后測(cè)量抑菌帶寬度。徐斌等[21]采用此法研究了拮抗放線菌K13的抑菌活性和作用范圍，明確了K13的抑制效果和抑菌譜，并通過進(jìn)一步的顯微觀察，明確了其作用方式，即引起病原菌菌絲扭曲、畸形、斷裂甚至解離，表明放線菌K13具有開發(fā)為生防菌劑的潛能。

2.4 擴(kuò)散法

對(duì)峙培養(yǎng)中若需借助牛津杯、濾紙、打孔器等試驗(yàn)工具或試驗(yàn)手段才能完成的方法，則統(tǒng)稱為擴(kuò)散法，主要用于研究生防菌次生代謝產(chǎn)物對(duì)病原菌的抑制效果。

2.4.1 牛津杯法(Oxford cup method，OCM) 牛津杯為直徑6 mm、高度10 mm的小鋼管，是用于抑菌試驗(yàn)或藥敏試驗(yàn)的一種輔助工具。試驗(yàn)時(shí)主要將其放置于培養(yǎng)基中心，在其兩側(cè)或四周的對(duì)稱位置接種病原菌，也可將病原菌置于中心，而四周放置牛津杯，杯內(nèi)加入供試生防菌(真菌或細(xì)菌)發(fā)酵液，根據(jù)抑菌圈直徑判斷生防效果?？莶菅挎邨U菌、死谷芽孢桿菌(B.vallismortis)對(duì)葡萄灰霉病菌、蘋果褐腐病菌(Moniliniafructigena)等多種致病菌的抑制效果試驗(yàn)借助了牛津杯進(jìn)行，明確了2種生防細(xì)菌的抑菌活性和抑菌范圍；進(jìn)一步顯微觀察發(fā)現(xiàn)，死谷芽孢桿菌對(duì)葡萄灰霉病菌的菌絲和分生孢子均具有致畸作用，導(dǎo)致菌絲不能正常生長以及分生孢子異常萌發(fā)或不萌發(fā)，從而發(fā)揮其生防作用[22-23]。

2.4.2 濾紙片法(Filtering paper method，F(xiàn)PM) 該法借助了濾紙片，適用于生防真菌和細(xì)菌活性物質(zhì)的篩選，首先需要制作含發(fā)酵液的濾紙片，即將Whatman 3號(hào)濾紙或其他較厚定性濾紙打制成直徑相同的圓片，經(jīng)濕熱滅菌及紫外燈下自然晾干后，在其上滴加定量發(fā)酵液或?qū)⑵湓诎l(fā)酵液中沾濕。吳衛(wèi)剛等[24]采用濾紙片法研究了枯草芽孢桿菌對(duì)煙草疫霉菌(P.nicotianae)的抑菌活性，先將疫霉菌菌餅接種到培養(yǎng)基中央，再將4片濾紙片成對(duì)角線貼在距邊緣20 mm處的培養(yǎng)基上，其中3片分別滴加5 μL菌液，1片滴加等量無菌水作為對(duì)照，培養(yǎng)5 d后的抑菌帶寬度為14.7 mm，說明枯草芽孢桿菌對(duì)煙草疫霉菌具有較好的生防效果。解淀粉芽孢桿菌(B.amyloliquefaciens)對(duì)人參根腐病菌(腐皮鐮刀菌)的生防效果研究也采用了此方法，結(jié)果表明，解淀粉芽孢桿菌具有極顯著的抑菌效果，抑菌帶寬度達(dá)到了46.5 mm，說明該細(xì)菌是通過分泌某種抑菌活性物質(zhì)發(fā)揮抑菌作用的[25]。此種方法下，也可將沾有菌液的濾紙片放于中央，四周放置不同種類的病原菌，可按試驗(yàn)需求進(jìn)行自由組合。

2.4.3 打孔法(Punch stiletto method，PSM) 打孔法是在固體培養(yǎng)基中借助打孔的方式注入發(fā)酵液，可以一孔也可多孔，將病原菌接種于平板一端或中央，于另一端或距離中心相同位置的兩端/四周用打孔器均勻打孔，加入定量供試生防菌發(fā)酵液，培養(yǎng)并觀察結(jié)果；供試生防菌和病原菌的位置也可調(diào)換。盧行等[26]在測(cè)定短短芽孢桿菌(Brevibacillusbrevis)X23對(duì)大腸桿菌(Escherichiacoli)的抑菌活性時(shí)采用此方法，抑菌帶寬度為20 mm，抑菌效果顯著。打孔法不僅可用于生防細(xì)菌對(duì)病原細(xì)菌的抑菌效果研究，也可用于生防真菌對(duì)病原真菌的活性測(cè)定。ZJ353菌株是一株來源于海洋沉積物樣品中的真菌，蔡思琦等[27]利用打孔法測(cè)定了其對(duì)8種病原真菌的抑菌效果，其中，對(duì)尖孢鐮刀菌(F.oxysporum)的抑菌帶寬度高達(dá)37.1 mm，作用效果顯著，但其分類地位有待于確定。

2.4.4 接種環(huán)法(Inoculating loop method，ILM) 枯草芽孢桿菌是一種抑菌活性顯著的生防細(xì)菌，李鐵軍等[28]采用接種環(huán)法研究了其對(duì)水稻紋枯病菌(R.solani)、番茄灰霉病菌的生防效果，抑菌率分別為29.4%、27.8%。該方法即在平板培養(yǎng)基中央(或四周)接種病原真菌，在其周圍四角(或中央)用接種環(huán)將生防細(xì)菌菌株或發(fā)酵液涂成直徑相同的圓形，培養(yǎng)數(shù)天后，觀察確定供試生防菌的抑菌活性。

4種擴(kuò)散法均可1次測(cè)定2個(gè)及以上生防菌(或病原菌)，減少了重復(fù)，節(jié)約了時(shí)間與成本，并且借助試驗(yàn)工具可有效防止不同菌種間的相互影響，進(jìn)而提高試驗(yàn)準(zhǔn)確度。在不同的試驗(yàn)需求下，可將病原菌與供試菌的放置位置自由組合，更好地完成試驗(yàn)。這幾種擴(kuò)散法的特點(diǎn)和所適用的生防菌范圍如表3所示。

表3 擴(kuò)散法的特點(diǎn)和適用生防菌種類Tab.3 Features of diffusion method and applicable biocontrol species

3 展望

通過總結(jié)生防菌抑制效果研究中不同對(duì)峙培養(yǎng)方法的具體應(yīng)用，可以指導(dǎo)試驗(yàn)人員根據(jù)研究目的、生防菌種類、靶標(biāo)材料和試驗(yàn)內(nèi)容等選擇合適的對(duì)峙方法，使試驗(yàn)?zāi)康母用魑?、操作步驟更加簡(jiǎn)捷、試驗(yàn)結(jié)果更加科學(xué)。對(duì)峙試驗(yàn)不僅可以明確生防菌的抑菌效果和抑菌譜，還可了解其抑菌方式，為深入研究生防菌的抑菌機(jī)制和將其開發(fā)成微生物農(nóng)藥奠定了堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)，對(duì)峙試驗(yàn)也可用于植物源農(nóng)藥的相關(guān)研究。目前，對(duì)于生防菌的抑菌活性、作用方式、抑菌機(jī)制等的研究比較普遍，但能夠?qū)⑵鋵?shí)際應(yīng)用于田間的成品寥寥無幾[29-32]，生防菌的商品化是研究重點(diǎn)之一。同時(shí)，部分生防菌劑在實(shí)際應(yīng)用中表現(xiàn)出一些問題，如生防效果不穩(wěn)定、在作物上的定植能力低、效果受環(huán)境因素影響大，等等。針對(duì)這些問題，必須優(yōu)化室內(nèi)拮抗試驗(yàn)過程，積極尋找或創(chuàng)造新的對(duì)峙試驗(yàn)方法，從而篩選出穩(wěn)定性強(qiáng)、效果突出、定植能力高的生防菌和活性物質(zhì)，建立優(yōu)化的發(fā)酵、增殖生產(chǎn)工藝和規(guī)范的生產(chǎn)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)而研發(fā)出高效安全廣譜的微生物農(nóng)藥；并進(jìn)一步加強(qiáng)微生物農(nóng)藥作用機(jī)制研究，根據(jù)其作用位點(diǎn)和活性中心反推導(dǎo)，指導(dǎo)菌種選育，更新劑型，合成新農(nóng)藥的先導(dǎo)化合物，創(chuàng)制新農(nóng)藥，促進(jìn)微生物農(nóng)藥的產(chǎn)業(yè)化，保證無公害農(nóng)產(chǎn)品的生產(chǎn)，保障食物安全，保護(hù)環(huán)境，促進(jìn)農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展。