耐酸產(chǎn)蛋白酶芽孢桿菌SD48菌株液體發(fā)酵豆粕產(chǎn)大豆肽條件的優(yōu)化

周星華，董偉潔，姜軍坡,2，劉 雙，王世英，朱寶成

(1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河北 保定 071001； 2.河北大學(xué) 化學(xué)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，河北 保定 071001；3.河北省畜牧站，河北 石家莊 050011)

大豆肽是大豆蛋白經(jīng)水解產(chǎn)生的低分子肽混合物，不僅具有易消化吸收、加熱不凝固、易溶于水等優(yōu)良特性，還具有低氧化性、低過敏性和低抗原性等生理活性，并且能夠降血壓、血脂和膽固醇以及調(diào)節(jié)血糖濃度[1]，可在蛋雞和肉雞體內(nèi)發(fā)揮免疫和抗氧化功能，提高其生產(chǎn)性能[2]。

甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌(Bacillusmethylotrophicus)與枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)、解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefacines)的同源性極高，具有可利用甲醇等非C-C鍵低碳化合物的特點(diǎn)，首次被報(bào)道于2010年[3]，研究者發(fā)現(xiàn)其具有產(chǎn)抗菌蛋白[4]、降解黃曲霉毒素[5]、抑制植物病原菌[6-7]等多種功能。

前期試驗(yàn)以酸性脫脂牛奶培養(yǎng)基為限制性培養(yǎng)基，篩選到1株耐受酸性環(huán)境且產(chǎn)酸性蛋白酶活力較高的甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌SD48菌株，并且優(yōu)化了SD48菌株固體發(fā)酵豆粕的條件，發(fā)酵后的豆粕pH值顯著降低，其酸溶蛋白相對含量和抗氧化活性顯著提高，β-伴大豆球蛋白和大豆球蛋白接近完全降解，豆粕的營養(yǎng)價(jià)值得到了極大提高[8]。鑒于此，本研究以大豆肽含量為指標(biāo)，通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)確定SD48菌株液體發(fā)酵豆粕產(chǎn)大豆肽的最優(yōu)培養(yǎng)基組成和最佳發(fā)酵條件，以期為發(fā)酵豆粕產(chǎn)高含量大豆肽的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)菌株 甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌SD48菌株由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)制藥工程系實(shí)驗(yàn)室分離并保存。

1.1.2 試劑與培養(yǎng)基 膨化豆粕由中儲糧油脂(唐山)有限公司生產(chǎn)(粗蛋白≥(43.0±0.5)%，水分≤13.0%)。NB培養(yǎng)基、NA培養(yǎng)基、TPTZ工作液的配制方法參照文獻(xiàn)[8]；基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基的配制：豆粕10.000 g、Na2HPO40.840 g、KH2PO40.032 g，水100 mL，自然pH值。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 豆粕發(fā)酵液中蛋白質(zhì)和游離氨基酸含量的測定 將豆粕發(fā)酵液充分混勻后取1.0 mL，加入到300 mL消解管中，再加入1.5 mL超純水，然后采用凱氏定氮法測定豆粕發(fā)酵液中粗蛋白含量。再吸取1.5 mL充分混勻后的豆粕發(fā)酵液加入10 mL 15%三氯乙酸，振蕩60 min，于5 000 r/min離心20 min，然后吸取3 mL上清液于消解管中，采用粗蛋白含量測定法測定酸溶蛋白含量。

采用茚三酮法測定游離氨基酸含量。首先分別取不同濃度的賴氨酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液1.5 mL，加入10 mL 15%三氯乙酸，于4 000 r/min離心20 min后取上清液5 mL，加入1 mL 1%茚三酮溶液，沸水浴8 min。冷卻后，用無水乙醇定容至10 mL，于450 nm下測定吸光度。以水代替賴氨酸溶液同法操作，所得溶液用來調(diào)零。根據(jù)測定結(jié)果以吸光度為縱坐標(biāo)，以賴氨酸濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。以相同的方法處理豆粕發(fā)酵液，并根據(jù)測定結(jié)果，結(jié)合茚三酮法測定賴氨酸濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算豆粕發(fā)酵液中游離氨基酸的濃度(mmol/L)。游離氨基酸含量(X，%)的計(jì)算如下：

X=(x×128)/10 000

式中，x為結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出的豆粕發(fā)酵液中游離氨基酸的濃度(mmol/L)，128為賴氨酸摩爾質(zhì)量。

1.2.2 豆粕發(fā)酵液中大豆肽含量的測定 由1.2.1中測定出的酸溶蛋白含量與游離氨基酸含量的差值，即為豆粕發(fā)酵液中大豆肽的含量。大豆肽相對含量為發(fā)酵豆粕中大豆肽與粗蛋白含量的比值。

1.2.3 豆粕發(fā)酵液中蛋白質(zhì)分子質(zhì)量分布測定 吸取充分混勻后的豆粕發(fā)酵液1 mL于10 000 r/min離心10 min，取40 μL上清液，加入5×上樣緩沖液10 μL，進(jìn)行10 min的沸水浴，然后于12 000 r/min離心5 min，得到待測液后根據(jù)文獻(xiàn)[8]測定蛋白質(zhì)分子質(zhì)量分布。對照組除不添加種子液外，其余同試驗(yàn)組。

1.2.4 豆粕發(fā)酵液的抗氧化活性測定 抗氧化活性測定方法參照文獻(xiàn)[8]，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程如下：

y=2.292 7x-0.035 2(r2=0.999 4)。

豆粕發(fā)酵液與15%三氯乙酸按1∶1比例浸提，于4 000 r/min離心20 min后，取100 μL上清液加入3 mL TPTZ工作液，混合均勻后于35 ℃水浴30 min，在597 nm處測定吸光度。以水代替維生素C溶液同法操作，用來調(diào)零。豆粕發(fā)酵液的抗氧化活性以μg AEAC/mL(每1 mL豆粕發(fā)酵液的抗氧化能力相當(dāng)于1 μg維生素C的抗氧化能力)表示。豆粕發(fā)酵液的抗氧化活性(Y，μg AEAC/mL)的計(jì)算如下：

Y=(y×176.2×n)/10 000

式中，y為標(biāo)準(zhǔn)曲線中的維生素C的濃度(mmol/L)，n為稀釋倍數(shù)，176.12為維生素C的摩爾質(zhì)量。

1.2.5 SD48菌株種子液的制備 SD48菌株種子液的制備方法同文獻(xiàn)[8]。

1.2.6 SD48菌株液體發(fā)酵產(chǎn)大豆肽培養(yǎng)基組成的優(yōu)化 碳源種類的選擇：在基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中分別添加2.00%的蔗糖、葡萄糖、乳糖、甘露醇、可溶性淀粉、玉米粉和糊精，配制成含有不同碳源的發(fā)酵培養(yǎng)基，SD48菌株的接種量均為6.00%，于37 ℃、180 r/min培養(yǎng)48 h后分別測定粗蛋白、酸溶蛋白、游離氨基酸含量，最后以大豆肽含量作為指標(biāo)，篩選出最適碳源。

無機(jī)鹽種類的選擇：在基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中加入上述所得2.00%的最適碳源，然后分別加入0.05%的MgSO4、ZnSO4、MnSO4、KCl、NaCl、FeCl3等無機(jī)鹽，共配制6種不同的發(fā)酵培養(yǎng)基，在上述發(fā)酵條件下，篩選出最適無機(jī)鹽。

培養(yǎng)基組成的正交試驗(yàn)優(yōu)化：以大豆肽含量為指標(biāo)，按正交試驗(yàn)表L9(34)設(shè)計(jì)四因素三水平試驗(yàn)，對碳源、氮源、硫酸銨以及無機(jī)鹽含量進(jìn)行優(yōu)化，正交試驗(yàn)因素水平見表1。根據(jù)其配制發(fā)酵培養(yǎng)基，SD48菌株的接種量均為6.00%，于最適發(fā)酵溫度下以180 r/min搖床培養(yǎng)48 h，然后以大豆肽含量為指標(biāo)，對正交試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行極差分析，從而得到最優(yōu)發(fā)酵培養(yǎng)基組成。

1.2.7 培養(yǎng)溫度對SD48菌株發(fā)酵產(chǎn)大豆肽的影響試驗(yàn) 在基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中加入2.00%的最適碳源和0.05%的最適無機(jī)鹽，分別在28、30、35、37 ℃條件下以180 r/min搖床培養(yǎng)48 h，得出最佳的培養(yǎng)溫度。

表1 SD48菌株液體發(fā)酵培養(yǎng)基組成的正交優(yōu)化試驗(yàn)因素水平 Tab.1 Level of factors for orthogonal optimization of liquid fermentation medium composition of SD48 strain %

1.2.8 SD48菌株液體發(fā)酵產(chǎn)大豆肽培養(yǎng)條件的正交優(yōu)化試驗(yàn) 以大豆肽含量為指標(biāo)，按正交試驗(yàn)表L9(34)設(shè)計(jì)四因素三水平試驗(yàn)，對接種量、發(fā)酵時間、起始pH值以及裝瓶量進(jìn)行優(yōu)化，正交試驗(yàn)的因素水平如表2所示。以大豆肽含量為指標(biāo)，對正交試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行極差分析，得出最佳的發(fā)酵培養(yǎng)條件。

表2 SD48菌株液體發(fā)酵培養(yǎng)條件的正交優(yōu)化試驗(yàn)因素水平Tab.2 Level of factors for orthogonal optimization of liquid fermentation conditions of SD48 strain

2 結(jié)果與分析

2.1 豆粕發(fā)酵液中游離氨基酸濃度測定的標(biāo)準(zhǔn)曲線

由圖1可知，通過茚三酮法測定豆粕發(fā)酵液后，得到游離氨基酸濃度線性方程為y=0.004 2x+0.055 6，r2=0.991 4。游離氨基酸濃度在0～150 mmol/L，具有良好線性。

圖1 茚三酮法測定賴氨酸濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve for determination of lysine concentration by ninhydrin method

2.2 碳源對大豆肽產(chǎn)量的影響

由表3可知，當(dāng)碳源為蔗糖、玉米粉和乳糖時，發(fā)酵液中不含大豆肽；當(dāng)碳源為甘露醇、葡萄糖和糊精時，大豆肽含量分別為0.24%、0.53%、0.50%；當(dāng)碳源為可溶性淀粉時，大豆肽含量為0.70%。故選擇淀粉作為最適碳源，此時，大豆肽相對含量為11.27%。

表3 碳源對SD48菌株發(fā)酵豆粕產(chǎn)大豆肽的影響Tab.3 Effects of carbon sources on soybean peptide production from soybean meal fermented by SD48 strain %

2.3 無機(jī)鹽對大豆肽產(chǎn)量的影響

由表4可知，分別以MgSO4、ZnSO4、KCl、NaCl和FeCl3作為無機(jī)鹽時，大豆肽含量在1.36%～1.91%。當(dāng)無機(jī)鹽為MnSO4時，大豆肽含量最高，為2.18%，故選擇MnSO4作為最適無機(jī)鹽，此時，大豆肽相對含量為34.88%。

表4 無機(jī)鹽對SD48菌株發(fā)酵豆粕產(chǎn)大豆肽的影響Tab.4 Effect of inorganic salts on soybean peptide production from soybean meal fermented by SD48 strain %

2.4 SD48菌株液體發(fā)酵培養(yǎng)基組成的正交優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

由表5—6可知，影響SD48菌株發(fā)酵豆粕產(chǎn)大豆肽含量的培養(yǎng)基組成依次為豆粕含量>硫酸銨含量>無機(jī)鹽含量>可溶性淀粉含量，綜合分析得到最佳組合為A2B3C3D3(可溶性淀粉2.00%、豆粕15.00%、硫酸銨4.00%、無機(jī)鹽0.09%)。將A2B3C3D3組與正交試驗(yàn)中表現(xiàn)最佳的組合A1B3C3D3(可溶性淀粉1.00%、豆粕15.00%、硫酸銨4.00%、無機(jī)鹽0.09%)進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，A1B3C3D3組大豆肽含量較高，此條件下SD48菌株液體發(fā)酵產(chǎn)大豆肽的含量為5.52%，大豆肽相對含量為54.06%，發(fā)酵產(chǎn)物的抗氧化活性為557.90 μg AEAC/mL(表7)。

2.5 溫度對大豆肽產(chǎn)量的影響

由表8可知，當(dāng)發(fā)酵溫度為30 ℃時，豆粕發(fā)酵液中大豆肽含量最低，為2.87%；此時酸溶蛋白含量最低，為4.45%；但游離氨基酸含量最高，為1.58%。當(dāng)發(fā)酵溫度為35 ℃時，豆粕發(fā)酵液中大豆肽含量為3.34%。當(dāng)發(fā)酵溫度為28 ℃和37 ℃時，豆粕發(fā)酵液中大豆肽含量較高，分別為3.68%和3.56%，大豆肽相對含量分別為56.79%和56.24%，此外，考慮到發(fā)酵溫度較低時耗能較少，故選擇28 ℃作為SD48菌株發(fā)酵豆粕的最適溫度。

表5 SD48菌株液體發(fā)酵培養(yǎng)基組成的正交優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果(部分)Tab.5 Orthogonal optimization of medium composition for liquid fermentation of SD48 strain (Part)

表6 SD48菌株液體發(fā)酵培養(yǎng)基組成的正交優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果極差分析Tab.6 Range analysis of orthogonal optimization test on composition of liquid fermentation medium of SD48 strain %

表7 SD48菌株液體發(fā)酵培養(yǎng)基組成的正交優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果驗(yàn)證Tab.7 Verification of the results of orthogonal test on liquid fermentation medium composition of SD48 strain

表8 溫度對SD48菌株發(fā)酵豆粕產(chǎn)大豆肽的影響Tab.8 Effect of temperature on soybean peptide production from soybean meal fermented by SD48 strain %

2.6 SD48菌株液體發(fā)酵培養(yǎng)條件優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果

由表9—10可知，影響SD48菌株發(fā)酵豆粕產(chǎn)大豆肽含量的培養(yǎng)條件依次為接種量>發(fā)酵時間>裝瓶量>pH值，綜合分析得到最佳組合為E5F6G5H5(接種量6.00%、培養(yǎng)時間72 h、pH值為6.00、裝瓶量為40%)。將E5F6G5H5組與正交試驗(yàn)中大豆肽相對含量最高的組合E5F6G4H5(接種量6.00%、培養(yǎng)時間72 h、pH值為5.00、瓶裝量為40%)進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，E5F6G5H5組對應(yīng)的大豆肽含量更高，所產(chǎn)大豆肽含量為8.03%，大豆肽相對含量71.06%，抗氧化活性為343.70 μg AEAC/mL(表11)。與僅向基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入可溶性淀粉作為碳源所得結(jié)果相比，大豆肽含量提高了10.47倍。

2.7 SD48菌株豆粕發(fā)酵產(chǎn)物的蛋白質(zhì)分子質(zhì)量分布分析

如圖2所示，對照組發(fā)酵豆粕中蛋白質(zhì)的分子量主要分布于72、53、43、34、20 ku，其中存在β-伴大豆球蛋白(7S)的α亞基(72 ku)、β亞基(53 ku)以及大豆球蛋白(11S)的酸性多肽鏈(34 ku)和堿

表9 SD48菌株液體發(fā)酵培養(yǎng)條件的正交優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果(部分)Tab.9 Orthogonal optimization of liquid fermentation conditions of SD48 strain (Part)

表10 SD48菌株液體發(fā)酵培養(yǎng)條件的正交優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果極差分析Tab.10 Range analysis of orthogonal optimized culture conditions of SD48 strain in liquid fermentation %

表11 SD48菌株液體發(fā)酵培養(yǎng)條件的正交優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果驗(yàn)證Tab.11 Verification of the results of orthogonal optimization on liquid fermentation culture conditions of SD48 strain

1：蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；2：空泳道；3：空白對照組；4—6：由E5F6G5H5組發(fā)酵豆粕所得的蛋白質(zhì)；7、8：由E5F6G4H5組發(fā)酵豆粕所得的蛋白質(zhì)

1: Protein Marker; 2: Lane without sample; 3: Control group; 4—6: Proteins from fermented soybean meal of E5F6G5H5group; 7,8: Proteins from fermented soybean meal of E5F6G4H5group

圖2 SD48菌株液體發(fā)酵豆粕最佳條件下蛋白產(chǎn)物的分子質(zhì)量分布
Fig.2 Molecular weight distribution of the products of SD48strain under the optimum conditions of liquid fermentationof soybean meal

性多肽鏈(20 ku)，表明對照組發(fā)酵豆粕中主要的抗?fàn)I養(yǎng)因子沒有被消除。但經(jīng)SD48菌株發(fā)酵72 h后，由E5F6G5H5組和E5F6G4H5組發(fā)酵豆粕所得蛋白質(zhì)的條帶較淺，說明β-伴大豆球蛋白、大豆球蛋白多數(shù)被降解。由E5F6G5H5組發(fā)酵豆粕所得的蛋白質(zhì)較由E5F6G4H5組所得的蛋白質(zhì)條帶在20～72 ku區(qū)域內(nèi)更淺一些，這說明以E5F6G5H5組作為發(fā)酵條件進(jìn)行發(fā)酵時，β-伴大豆球蛋白和大豆球蛋白的降解效果更好。此外，在小于10 ku的區(qū)域內(nèi)，由E5F6G5H5組發(fā)酵豆粕所得蛋白質(zhì)的條帶較E5F6G4H5組所得蛋白質(zhì)的條帶(呈彌散狀)顏色更深，這說明以E5F6G5H5組作為發(fā)酵條件時，豆粕發(fā)酵液中含有較多的大豆肽。

3 結(jié)論與討論

大豆肽的氨基酸組成與大豆蛋白質(zhì)相同，必需氨基酸平衡良好且含量豐富。大豆肽可有效提高家禽的抗氧化水平和免疫性能，可提高蛋雞產(chǎn)蛋率，降低料蛋比，提高蛋品質(zhì)，也可有效提高肉雞體質(zhì)量、胸肌率和腿肌率[2]。

為了提高液體發(fā)酵豆粕生產(chǎn)大豆肽的產(chǎn)量和轉(zhuǎn)化率，國內(nèi)外研究者對發(fā)酵菌種及工藝進(jìn)行了廣泛研究，發(fā)酵豆粕所使用菌種可以劃分為曲霉、芽孢桿菌以及混合菌種3種類型。當(dāng)選用曲霉為菌種時，大豆肽的含量和轉(zhuǎn)化率較低，例如秦思思等[9]利用米曲霉(A.oryzae)A-9005發(fā)酵豆粕，在最優(yōu)條件下，發(fā)酵液中大豆肽的轉(zhuǎn)化率達(dá)到55.60%，大豆肽含量為16.68 mg/mL。當(dāng)選用芽孢桿菌為菌種時，液體發(fā)酵豆粕所獲得的大豆肽含量和轉(zhuǎn)化率主要取決于發(fā)酵菌株和工藝條件。一些研究者利用普通芽孢桿菌液體發(fā)酵豆粕時，所獲得的大豆肽含量為13.51～16.47 mg/mL，與曲霉的發(fā)酵效果相比并沒有顯著差異[10-12]；但當(dāng)采用優(yōu)良的芽孢桿菌菌株并為其提供適宜的發(fā)酵條件時，即可獲得較高產(chǎn)量的大豆肽，例如在最優(yōu)條件下利用芽孢桿菌液體發(fā)酵豆粕，可獲得23.60～39.47 mg/mL的大豆肽[13-17]。此外，以曲霉和芽孢桿菌組成的混合菌種發(fā)酵豆粕時，并沒有表現(xiàn)出顯著優(yōu)勢[18]。

本研究采用單因素和正交試驗(yàn)優(yōu)化大豆肽產(chǎn)生條件，在優(yōu)化氮源時，豆粕的添加量最多達(dá)到15.00%，此時發(fā)酵培養(yǎng)基成黏稠狀態(tài)，若豆粕含量高于15.00%，發(fā)酵培養(yǎng)基不再呈液體狀，而呈半固體狀態(tài)。發(fā)酵條件優(yōu)化后，發(fā)酵豆粕中大豆肽含量為8.03%，與僅向基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入可溶性淀粉作為碳源所得結(jié)果相比提高了10.47倍，此時大豆肽相對含量為71.06%，抗氧化活性達(dá)到343.70 μg AEAC/mL，極大地提高了液體發(fā)酵豆粕中的大豆肽含量和抗氧化活性。

綜上，本研究獲得了甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌SD48菌株液體發(fā)酵豆粕產(chǎn)大豆肽的最優(yōu)培養(yǎng)基組成，利用其發(fā)酵豆粕后，可大幅度提高大豆肽的含量及抗氧化活性，為高含量大豆肽發(fā)酵豆粕在蛋雞、肉雞養(yǎng)殖中的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。