大鼠脊髓背角膠狀質(zhì)神經(jīng)元去極化反跳參與大鼠慢性神經(jīng)病理性疼痛*

李凌超 朱夢葉 吳艷盈 張達(dá)穎

（1大連醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院疼痛科，大連 116000；2南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院疼痛科，南昌 330006；3大連花園口新城醫(yī)院內(nèi)科，大連 116000）

慢性疼痛被定義為持續(xù)或復(fù)發(fā)的時間超過1個月的疼痛[1]。慢性疼痛不僅影響工作及生活質(zhì)量，還可能誘發(fā)焦慮、抑郁等負(fù)面情緒，給家庭和社會帶來沉重的負(fù)擔(dān)。調(diào)查顯示：我國慢性疼痛的發(fā)病率為52.99%[2]，而且隨年齡的增長而增加，50%～75%的老年人存在一種或多種慢性疼痛[3]。慢性疼痛的發(fā)病率高，其病理生理機(jī)制尚未完全明確，臨床治療效果不佳。

神經(jīng)元在接受超極化刺激后爆發(fā)動作電位的現(xiàn)象叫做“去極化反跳(rebound depolarization)”[4,5]。有研究發(fā)現(xiàn)，去極化反跳在生理和病理狀態(tài)下都發(fā)揮作用[6,7]，而且發(fā)生部位不同其功能也不同。去極化反跳還可能與抑制性和興奮性信息之間的轉(zhuǎn)換以及與外周刺激強(qiáng)度識別相關(guān)[8～10]。

脊髓背角II層被稱為膠狀質(zhì)(substantia gelatinosa, SG)區(qū)，是痛覺信號由外周傳入中樞的第一個中繼站[11]，在痛覺傳遞與調(diào)制中起到關(guān)鍵的作用。Rivera-Arconada等人對脊髓背角IV、V、VI層神經(jīng)元的去極化反跳進(jìn)行了研究[10]，但I(xiàn)I層SG神經(jīng)元在慢性疼痛狀態(tài)下的去極化反跳特點尚無報道，因此，本研究制作坐骨神經(jīng)部分結(jié)扎(partial sciatic nerve ligation, PSNL)模型，結(jié)合膜片鉗電生理技術(shù)，初步探討離體脊髓切片中SG神經(jīng)元去極化反跳的基本特點，為明確慢性疼痛的脊髓機(jī)理以及發(fā)現(xiàn)慢性疼痛治療的新靶點提供理論依據(jù)。

方 法

1.實驗動物

選取4周齡雄性SD大鼠66只，體重為90 ～ 100 g，采用隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為3組：模型組模型組（坐骨神經(jīng)部分結(jié)扎，PSNL）、假手術(shù)組(sham)和對照組(control)，每組各22只。模型組行坐骨神經(jīng)部分結(jié)扎(partial sciatic nerve ligation,PSNL)，假手術(shù)組不縫扎神經(jīng)，余步驟同模型組，對照組不做任何處理。本實驗中所有大鼠均來源于江西中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心，本研究嚴(yán)格按照《南昌大學(xué)動物實驗倫理審查》原則和《南昌大學(xué)實驗動物管理辦法》進(jìn)行。

2.實驗相關(guān)溶液配制

（1）解剖液組成成分為(mmol/L)：sucrose 240，NaHCO325，KCl 2.5，NaH2PO4·2H2O 1.25，CaCl2·2H2O 0.5，MgCl2·6H2O 3.5，ascorbic acid 0.4，sodium pyruvate 2 (pH=7.4, 310 mOsm)。

（2）人工腦脊液(ACSF)組成成分為(mmol/L)：NaCl 117，KCl 3.6，NaH2PO4·2H2O 1.2，CaCl2·2H2O 2.5，MgCl2·6H2O 1.2，NaHCO325，glucose 11，ascorbic acid 0.4，sodium pyruvate 2 (pH=7.4,310 mOsm)。

（3）電極內(nèi)液成份為(mmol/L)：K-gluconate 130，KCl 5，EGTA 0.5，HEPES 10，Mg-ATP 4，Li-GTP 0.3，phosphocreatine di (tris) salt 10 (pH=7.2,300 mOsm)。K-gluconate購自Wako，余試劑均購自Sigma。

3.實驗方法

參照Seltzer等[12]的方法，制作坐骨神經(jīng)部分結(jié)扎(PSNL)模型：取 4周齡雄性 SD 大鼠，乙醚麻醉后，無菌操作下在右側(cè)股段高位切開皮膚，鈍性分離肌肉，暴露坐骨神經(jīng)，將7-0尼龍絲線縫入神經(jīng)干內(nèi)，使神經(jīng)的背側(cè)1/3～1/2被收在線圈內(nèi)，然后較松結(jié)扎套在線圈內(nèi)的部分神經(jīng)干，逐層縫合至皮膚。假手術(shù)組不縫扎神經(jīng)，其他步驟和模型組相同，對照組不做任何處理。應(yīng)用Von Frey觸覺測痛儀，采用 Dixon 的Up and down方法[13]測量模型組和假手術(shù)組術(shù)前、術(shù)后3、7、10和14 d以及對照組相應(yīng)時間點的機(jī)械痛閾，克數(shù)遞增或遞減的方式進(jìn)行測試，每次測試重復(fù)10次，持續(xù)時間6 ～ 8 s，每兩次測試間隔超過15 s，若10次中出現(xiàn)縮爪或舔爪反應(yīng)≥5次被認(rèn)為陽性，并記錄出現(xiàn)陽性反應(yīng)的最小克數(shù)作為其縮爪閾值。

模型組和假手術(shù)組均于術(shù)后15 d制作離體脊髓切片后處死，對照組同期制作脊髓切片。腹腔注射烏拉坦（每公斤體重1.2 g），行心臟灌流，剪下并取出以腰骶膨大為中心的脊髓，用振動切片機(jī)在冰水混合狀態(tài)下的解剖液中切取300 μm厚的脊髓縱切片。將切好的脊髓切片轉(zhuǎn)入32 ℃恒溫并持續(xù)充氧(95% O2+ 5% CO2)的人工腦脊液中孵育半個小時，目的為盡可能模擬SG神經(jīng)元正常的生理環(huán)境。獲取所需標(biāo)本后，采用放血法處死仍在麻醉狀態(tài)下的實驗動物。

應(yīng)用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)記錄模型組、假手術(shù)組和對照組SG神經(jīng)元(n=34)的去極化反跳反應(yīng)及其他電生理特性。把孵育后的脊髓縱切片移到電生理記錄槽內(nèi)，表面持續(xù)恒速灌流充以95% O2和5% CO2混合氣體的人工腦脊液。參照我們以前的方法[14]，首先在顯微鏡低倍鏡(BX51WI, Olympus)，10倍下找到半透明的脊髓背角SG區(qū)（見圖1A），然后換用高倍紅外微分干涉相差鏡(IR-1000, Dage-MIT)40倍，選取狀態(tài)良好的神經(jīng)元（表現(xiàn)為細(xì)胞立體感強(qiáng)，胞膜較為清晰，富有彈性）進(jìn)行全細(xì)胞膜片鉗記錄（見圖1B）。通過調(diào)節(jié)顯微鏡粗調(diào)和微操控系統(tǒng)，使電極尖端和神經(jīng)元細(xì)胞膜緊密連接，然后將鉗制電位(holding potential, HP)控制在-70 mV，破膜，形成全細(xì)胞膜片鉗(whole cell patch clamp)記錄模式。所有實驗結(jié)果的記錄均在封接5 ～ 10 min電流穩(wěn)定之后進(jìn)行。給予時程1 s，大小 -120 pA的超極化電流刺激，可觀察到細(xì)胞受超極化刺激（見圖1C紫色框內(nèi)部分）后產(chǎn)生的去極化反應(yīng)（見圖1CE黑色箭頭所指）。根據(jù)有或無去極化反跳及是否伴有放電，將SG神經(jīng)元分為三組：無去極化反跳（見圖1C）、去極化反跳無放電（見圖1D）和去極化反跳伴放電（見圖1E），后兩者歸納為有去極化反跳。本實驗應(yīng)用EPC-10放大器（HEKA公司生產(chǎn)）進(jìn)行細(xì)胞電信號的采集并使用Patchmaster軟件進(jìn)行記錄和分析，整個記錄過程在室溫下進(jìn)行。

4.統(tǒng)計學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤()表示。各組數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 5.0進(jìn)行曲線擬合。采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。多組樣本差異比較采用方差分析；重復(fù)測量數(shù)據(jù)采用重復(fù)測量方差分析；計數(shù)資料采用卡方檢驗。P?0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1.大鼠疼痛行為學(xué)

模型組(n= 22)術(shù)后3天機(jī)械痛閾(3.1±0.3 g)相比假手術(shù)組(3.7±0.3 g)和對照組(3.8±0.3 g)有下降趨勢，但無統(tǒng)計學(xué)意義；模型組術(shù)后7天(2.1±0.2 g)、10天(1.7±0.2 g)、14天(1.5±0.2 g)機(jī)械痛閾比假手術(shù)組 (3.9±0.3 g)、(3.7±0.3 g)、(4.0±0.3 g)和對照組 (3.9±0.2 g)、(3.7±0.3 g)、(3.8±0.3 g)顯著降低（P?0.05，見圖2）。

2.PSNL術(shù)后SG神經(jīng)元去極化反跳現(xiàn)象增加

圖1 SG神經(jīng)元在顯微鏡下的形態(tài)及接受超極化電流刺激后反應(yīng)代表圖Fig.1 The representative diagram of morphology under microscope and the response after hyperpolarizing current stimulation of SG neurons

本實驗共記錄102個SG神經(jīng)元的電生理記錄，模型組、假手術(shù)組和對照組每組均記錄了34個，每組中有去極化反跳的神經(jīng)元數(shù)分別為26、19和17。SG神經(jīng)元中50%以上有去極化反跳，而且模型組去極化反跳的出現(xiàn)概率明顯高于假手術(shù)組和對照組（P?0.05，見圖3）。

3.PSNL術(shù)后SG神經(jīng)元電生理特性的變化

模型組(n= 34)、假手術(shù)組(n= 34)和對照組(n= 34)神經(jīng)元的電生理特點（見表1）：模型組SG神經(jīng)元的動作電位閾值(-36.0±2.0 mV)明顯低于假手術(shù)組(-29.1±1.0 mV)和對照組(-28.7±1.6 mV) (P?0.05)，而輸入阻抗 (966.0±119.0 Ω)明顯高于假手術(shù)組(632.0±58.0 Ω)和對照組(636.0±91.0 Ω) (P?0.05)。

另外，給予SG神經(jīng)元0 pA至150 pA階躍式電流刺激，在110 pA、120 pA、130 pA、140 pA和150 pA刺激過程中，PSNL組(n= 34)動作電位頻率分別為 21.3±2.5 Hz，22.2±2.6 Hz，23.0±2.8 Hz，23.6±3.0 Hz，24.5±3.2 Hz，假手術(shù)組(n= 34)分別為 18.7±1.7 Hz，19.4±1.8 Hz，19.7±2.0 Hz ，20.5±2.0 Hz，21.0±2.2 Hz，對照組(n= 34)分別為18.6±1.7 Hz，19.4±1.8 Hz，19.7±2.0 Hz，20.5±2.1 Hz，21.0±2.2 Hz，PSNL組動作電位頻率明顯高于假手術(shù)組和對照組（P?0.05，見圖4）。

圖2 模型組術(shù)后3、7、10、14天機(jī)械痛閾(EM)Fig.2 Comparison of the mechanical threshold on 3, 7, 10 and 14 days after operation among the model group(EM)

討 論

當(dāng)正離子由膜內(nèi)向膜外轉(zhuǎn)運（如腺苷A1受體激活后引起的鉀離子外流[15]）或負(fù)離子由膜外向膜內(nèi)轉(zhuǎn)運（如甘氨酸和γ氨基丁酸受體激活后引起的氯離子內(nèi)流[16]）時，這種外向電流可使膜電位增大，發(fā)生超極化。去極化反跳是神經(jīng)元細(xì)胞膜在接受超極化刺激后出現(xiàn)的短暫去極化現(xiàn)象，部分神經(jīng)元在該去極化的基礎(chǔ)上可爆發(fā)動作電位[17,18]。去極化反跳多見于具有自發(fā)性節(jié)律發(fā)放的神經(jīng)元，如丘腦皮層神經(jīng)元[19]，此外還見于無自發(fā)性節(jié)律發(fā)放的神經(jīng)元，如內(nèi)膝體神經(jīng)元[20]和脊髓背角深層神經(jīng)元[10]等。很多區(qū)域的神經(jīng)元在接受超極化刺激后，都可形成去極化反跳，也就是說可將抑制性的信號輸入轉(zhuǎn)化為興奮性的信號輸出[21]。

來自Aδ及C纖維傳入的外周傷害性信息由SG區(qū)神經(jīng)元初步整合，再經(jīng)過脊髓丘腦束等上行通路進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)高級部位，另外，SG區(qū)還匯聚來自腦干和大腦皮質(zhì)的下行抑制性投射神經(jīng)纖維，這些上行與下行系統(tǒng)以及局部的中間神經(jīng)元共同構(gòu)成了復(fù)雜的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，這是“閘門控制理論”的核心[22]。本研究發(fā)現(xiàn)超過1/2的脊髓背角SG神經(jīng)元可記錄到去極化反跳現(xiàn)象。Yasaka等發(fā)現(xiàn)SD大鼠具有去極化反跳的SG神經(jīng)元約占所記錄神經(jīng)元的30%～ 40%[23]，而在幼年C57Bl/6小鼠的背角淺層神經(jīng)元中，該比例不到30%[24]，均低于本研究中的比例，表明不同種屬或不同部位的神經(jīng)元，去極化反跳也不完全相同[25]。

圖3 模型組SG神經(jīng)元去極化反跳出現(xiàn)的概率(EM)Fig.3 Comparison of the probability of SG neurons depolarization rebound among the model group (EM)

表1 模型組、假手術(shù)組和對照組SG神經(jīng)元的基本電生理特性比較(n=34,EM)Table 1 Comparison of basic electrophysiological characteristics of SG neurons in the PSNL group, the sham operation group,and the control group (n=34,EM)

表1 模型組、假手術(shù)組和對照組SG神經(jīng)元的基本電生理特性比較(n=34,EM)Table 1 Comparison of basic electrophysiological characteristics of SG neurons in the PSNL group, the sham operation group,and the control group (n=34,EM)

RMP為靜息電位；Cm為膜電容；AP-T為動作電位閾值；AP-A為動作電位振幅；AP-HF為動作電位半寬度；Rin為輸入阻抗。 *P?0.05，模型組和假手術(shù)組比較，#P?0.05，模型組和對照組比較RMP: Resting membrane potential; Cm: Membrane capacitance; AP-T: Threshold of action potential; AP-A: Amplitude of action potential; APHF: Half width of action potential; Rin: Input impedance.*P?0.05, compared with the sham operation group; #P?0.05, compared with the control group.

對照組Control RMP (mV) -53.5±0.8 -55.3±1.6 -52.8±1.0 -52.1±1.5 Cm (pF) 61.2±7.2 53.2±5.1 56.5±4.9 74.2±2.8 AP-T (mV) -31.6±1.0 -36.0±2.0*# -29.1±1.0 -28.7±1.6 AP-A (mV) 71.7±1.7 66.9±2.3 72.6±1.6 76.3±4.1 AP-HF (ms) 1.2±0.1 1.5±0.2 1.0±0.1 1.0±0.1 Rin (Ω) 762.0±100.0 966.0±119.0*# 632.0±58.0 636.0±91.0總數(shù)Total模型組PSNL假手術(shù)組Sham

圖4 模型組SG神經(jīng)元動作電位頻率(EM)Fig.4 Comparison of the action potential frequency of SG neurons among the model group (EM)

通常情況下，動作電位閾值越低越容易發(fā)生去極化，神經(jīng)元興奮性就越高。本研究發(fā)現(xiàn)，反跳并放電組神經(jīng)元的動作電位閾值比無反跳組低。PSNL組SG神經(jīng)元的輸入阻抗(Rin)明顯高于假手術(shù)組，在給予相同的電流刺激時輸入阻抗大的神經(jīng)元會產(chǎn)生更高的電壓，會更接近于動作電位閾值，更容易產(chǎn)生動作電位，神經(jīng)元的興奮性也就越高。

PSNL模型是經(jīng)典的神經(jīng)病理性疼痛模型之一，可導(dǎo)致出現(xiàn)長達(dá)7個月的機(jī)械痛敏、熱痛敏和自發(fā)性疼痛。王英偉等人研究發(fā)現(xiàn)，6 ～ 8周齡的SD大鼠PSNL模型組術(shù)后3～28 d時機(jī)械痛閾和熱痛閾降低[26]，而在本研究中，PNSL術(shù)后3天手術(shù)側(cè)機(jī)械痛閾與假手術(shù)組比較，但無統(tǒng)計學(xué)意義，可能由于不同周齡的大鼠其行為學(xué)特點也有所不同。

本研究通過建立大鼠坐骨神經(jīng)部分結(jié)扎模型，對各組離體脊髓切片的SG神經(jīng)元進(jìn)行全細(xì)胞膜片鉗記錄，探討了慢性疼痛狀態(tài)下SG神經(jīng)元的基本電生理特性以及其去極化反跳的表達(dá)情況，進(jìn)一步闡述了調(diào)控疼痛的脊髓機(jī)理，為臨床治療慢性疼痛的藥物研發(fā)提供了理論依據(jù)。