七參連濕疹膏對幼齡動物皮膚刺激性和過敏性的影響

鄧紹友，李 麗，楊仁華，劉 光，劉 韜

（1.云南省執(zhí)業(yè)藥師注冊中心，云南 昆明 650106；2.昆明醫(yī)科大學第三附屬醫(yī)院 藥劑科，云南 昆明 650118；3.醫(yī)科大學藥學院/云南省天然藥物藥理重點實驗室，云南 昆明 650500；4.紅河衛(wèi)生職業(yè)學院 藥學系，云南 紅河 661100）

兒科人群是臨床用藥風險評估中的敏感人群，屬于特殊群體。美國FDA強調由于幼齡動物試驗可檢出潛在的、可能與人體安全性相關的危害，臨床使用兒童人群的年齡和治療期限，以及從成年動物試驗和成年患者使用中得到的安全性數(shù)據(jù)，在兒科患者開始短期、多次給藥的有效性和安全性臨床試驗之前應考慮獲得適當?shù)挠g動物非臨床安全性評價的研究結果[1]，完成幼齡動物試驗[2，3]。

濕疹(chronic eczema)是皮膚科臨床常見的一組變態(tài)反應性皮膚病，主要包括變應性接觸性皮炎、濕疹和特應性皮炎，多認為由機體內、外因共同作用引起，反復發(fā)作[4，5]。目前的治療方法西醫(yī)多采用查找并消除過敏源、脫敏療法和H1受體拮抗劑、糖皮質激素等非特異性藥物治療、中藥、抗菌藥等進行局部或全身藥物治療。

七參連濕疹膏具有清熱燥濕、活血消腫、祛風止癢之功效，已經(jīng)上市用于治療成人濕疹，對因風濕熱毒瘀阻所引起的濕疹臨床療效肯定。現(xiàn)擬經(jīng)皮膚涂抹治療嬰幼兒濕疹，因此，本文按照《中藥、天然藥物刺激和溶血性研究的技術指導原則》[6]、《中藥、天然藥免疫原性（過敏、光敏反應） 研究的技術指導原則》[7]進行幼齡家兔皮膚刺激性和幼齡豚鼠主動皮膚過敏試驗，觀察給藥局部和全身性反應情況，為嬰幼兒臨床試驗和安全用藥提供試驗依據(jù)，現(xiàn)報告如下。

材料與方法 一、藥品與試劑 七參連濕疹膏（組方：黃連、苦參、蒼術、重樓、三七、白鮮皮、爐甘石、花椒、冰片、甘草）及基質均由同一生產企業(yè)提供。2，4一二硝基氯苯，化學試劑產品，用橄欖油配制成1%和0.1%濃度。致敏用1%濃度，激發(fā)用0.1%濃度，硫化鈉。

二、試驗動物 健康幼齡（2月齡）家兔，雌雄各半，體重0.8～1.2kg，健康幼齡豚鼠，雌雄各半，體重150～200g，由昆明醫(yī)科大學實驗動物學部提供。動物單籠飼養(yǎng)，自由飲食。適應性飼養(yǎng)1周后開始實驗。

三、方法 1.幼齡家兔皮膚局部刺激反應[6]

①分組與給藥 設置單次給藥完整皮膚試驗組和破損皮膚試驗組（包括七參連濕疹膏受試藥物組、空白基質陰性對照組共2組，每組6只幼齡家兔），多次給藥整皮膚試驗組（包括七參連濕疹膏受試藥物組、空白基質陰性對照組共2組，每組6只）和破損皮膚試驗組（包括七參連濕疹膏受試藥物組、空白基質陰性對照組共2組，每組6只幼齡家兔）。

②對幼齡家兔完整皮膚的刺激反應 健康幼齡家兔6只，雌雄各半，將其背部兩側對稱脫毛2塊，面積每側約5.0cm×7.5cm。試驗采用同體左右側自身對照法，即左側背部皮膚涂搽七參連濕疹膏4g，右側背部皮膚涂擦基質4g。

③對幼齡家兔破損皮膚的刺激反應 健康幼齡家兔6只，雌雄各半，將其背部兩側對稱脫毛2塊，面積每側約5.0cm×7.5cm。用無菌8號針頭劃直徑為2cm的“#”形擦傷，注意只刺破表皮，不傷及真皮，以有輕度滲血為度。試驗采用同體左右側自身對照法，即左側背部皮膚涂搽七參連濕疹膏4g，右側背部皮膚涂搽基質4g。

④單次給藥皮膚刺激性試驗 取完整去毛皮膚和破損皮膚各1組（每組6只），將受試物4g均勻涂抹于左側脫毛區(qū)皮膚上，然后用一層保鮮膜、兩層紗布覆蓋，再用剪去指套的乳膠手套包住整個背部和腹部加以固定；右側涂布空白基質作為陰性對照。涂藥后用兩層紗布和一層無刺激性膠布固定6h，貼敷6h后，去除受試藥物，并用0.9%氯化鈉溶液洗凈給藥部位。給藥前及給藥后0.5h、1h、24h、48h和72h，觀察動物有無紅斑和水腫反應，涂搽部位是否有色素沉著、出血點、皮膚粗糙或皮膚菲薄，記錄出現(xiàn)和消退時間。

⑤多次給藥皮膚刺激性試驗 取完整去毛皮膚和破損皮膚組各1組（每組6只），給藥方式同單次用藥，但在同一部位連續(xù)給藥14d，每次給藥時間相同，每次涂藥后用兩層紗布和一層無刺激性膠布固定6h。固定結束后，除去受試藥物并用溫水清潔給藥部位。連續(xù)涂藥14d。每天給藥前及末次給藥后0.5h、1h、24h、48h和72h，觀察動物有無紅斑和水腫反應，涂搽部位是否有色素沉著、出血點、皮膚粗糙或皮膚菲薄，記錄出現(xiàn)和消退時間。

⑥刺激強度評價[6，8]分別于給藥前及給藥后0.5h、1h、24h、48h和72h觀察實驗區(qū)部位皮膚是否出現(xiàn)紅斑及紅腫。評價標準：（1）紅斑：0分：皮膚處未出現(xiàn)紅斑；1分：勉強可以看見皮膚處存在輕微紅斑；2分：明顯可以看見皮膚處中度紅斑；3分：重度紅斑；4分：紅斑呈紫紅色，形成焦痂； （2）水腫：0分：未出現(xiàn)水腫；1分：勉強可以看見輕微水腫；2分：明顯可以看見水腫處高出周圍皮膚；3分：水腫處高出周圍皮膚1mm，重度水腫，有較為清晰的輪廓；4分：嚴重水腫，潛在擴大、水腫，甚至破潰、嚴重水腫。皮膚刺激性強度評價標準：分值0.000～0.049為無刺激性；分值為0.50～1.99為輕度刺激性；分值為2.00～5.99為中度刺激性；6.00～8.00為強刺激性。

刺激反應平均分值=（紅斑形成總分+水腫形成總分）/動物數(shù)。

2.幼齡豚鼠皮膚過敏反應[7]①分組及給藥量幼齡豚鼠40只，雌雄各半，隨機分為4組，10只/組。受試藥組：七參連濕疹膏按每只每次0.2mL涂搽；基質對照組：軟膏基質按每只每次0.2mL涂搽；陽性對照組：2，4一二硝基氯苯，用橄欖油配制成1%和0.1%濃度。致敏用1%濃度，激發(fā)用0.1%濃度。均按每只0.2mL涂搽；空白對照組：0.9%生理鹽水，按每只0.2mL涂搽。

②致敏接觸 將幼齡豚鼠背部兩側毛脫掉，去毛區(qū)范圍每側約3cm×3cm。脫毛后24h，將上述各受試物分別涂于各組動物左側脫毛區(qū)（陽性對照用1%2，4一二硝基氯苯），用一層油紙及二層紗布覆蓋，再以無刺激膠布封閉、固定，持續(xù)6h。每只動物單籠飼養(yǎng)，于第7d和第14d，以同樣方法各重復一次，共3次。

③激發(fā)接觸 末次給受試物致敏后14d，將上述各受試物分別涂于各組動物右側脫毛區(qū)（陽性對照用0.1%2，4一二硝基氯苯），6h后用溫水清除受試物，即刻觀察，然后于24h、48h、72h再次觀察皮膚過敏反應情況。

④致敏性評價 按前述“刺激強度評價標準”計算激發(fā)接觸后24h、48h和72h時間點過敏反應分值；致敏性評價標準[8，9]：致敏發(fā)生率0%～10%為無致敏性；11%～30%為輕度致敏性；31%～60%為中度致敏性；61%～80%為高度致敏性；81%～100%為極度致敏性。

致敏發(fā)生率=出現(xiàn)皮膚紅斑、水腫或全身性過敏反應的動物數(shù)/動物總數(shù)

結 果 一、單次涂搽皮膚給藥對幼齡家兔皮膚的刺激反應 七參連濕疹膏及其基質對照單次涂搽于家兔完整皮膚和破損皮膚后，各組動物均未觀察到嚴重的紅斑及水腫出現(xiàn)，也未見色素沉著、出血點、皮膚粗糙或皮膚菲薄等情況發(fā)生，見表1。用藥前及用藥后24h、48h和72h的刺激評分均為0分；用藥后0.5h和1h七參連組評分均為0.33，基質對照組評分為0.33和0.17，這與藥物涂搽于皮膚固定物摩擦皮膚有關，其分值＜0.49，為無刺激反應，見表2。

二、多次涂擦皮膚給藥對幼齡家兔皮膚的刺激反應 七參連濕疹膏及其基質多次涂搽于幼齡家兔完整皮膚后，在14d內，涂藥過程中以及每次涂藥后各組動物均未觀察到嚴重的紅斑及水腫出現(xiàn)，也未見色素沉著、出血點、皮膚粗糙或皮膚菲薄等情況發(fā)生。在14d內，每次用藥前及用藥后48h和72h的刺激評分均為0分；用藥后0.5h、1h和24h七參連濕疹膏組和基質對照組評分均為0.33、0.33和0.17，這與藥物涂搽于皮膚固定物摩擦皮膚有關，其分值＜0.49，為無刺激反應，見表3。

七參連濕疹膏及其基質多次涂搽于幼齡家兔破損皮膚后，各組動物均未觀察到嚴重的紅斑及水腫出現(xiàn)，也未見色素沉著、出血點、皮膚粗糙或皮膚菲薄等情況發(fā)生。在14d內，每次用藥前及用藥48 h和72h的刺激評分均為0分；用藥后0.5h、1h和24h七參連濕疹膏組和基質對照組評分均為0.50、0.33和0.17，這與藥物涂搽于皮膚固定物摩擦皮膚有關，0.5h評分為其0.50，屬輕度刺激反應，1h后分值＜0.49，為無刺激反應，見表4。

三、對幼齡豚鼠皮膚過敏性的影響 在致敏期間，2，4一二硝基氯苯陽性藥物組，部分動物出現(xiàn)紅斑和水腫，其余各組動物均未見過敏反應；激發(fā)后，生理鹽水空白對照組1只動物在激發(fā)后24h出現(xiàn)輕度紅斑，致敏發(fā)生率為10%，為無致敏性，見表5。在激發(fā)給藥后24h、48h和72h，七參連濕疹膏組致敏率分別為10%、0%和0%；其基質對照組致敏率分別為10%、0%和0%；陽性藥物組各時間點的致敏發(fā)生率均為100%，見表6。

表1 七參連濕疹膏單次涂搽幼齡家兔完整皮膚的刺激反應評分（n=6）

討 論 中藥外用為傳統(tǒng)中醫(yī)藥治療疾病尤其是皮膚疾病的重要手段，但近年來外用中藥過敏的臨床事件時有發(fā)生。中藥致皮膚過敏反應的類型有接觸性皮炎、局部皮膚刺激、光毒性及光變應性皮炎、系統(tǒng)性接觸性反應等，引起這些反應的中藥既有單味藥，也有復方制劑[10]。這些中藥外用可能引起局部過敏反應或全身過敏反應，嚴重者甚至中毒致死[11]。因此，有必要對外用中藥進行系統(tǒng)的安全性評價。

表2 七參連濕疹膏單次涂搽幼齡家兔破損皮膚的刺激反應評分（n=6）

表5 七參連濕疹膏涂搽幼齡豚鼠皮膚過敏試驗結果（n=10）

表6 七參連濕疹膏涂搽幼齡豚鼠皮膚的致敏發(fā)生率和致敏性

表3 七參連濕疹膏多次涂搽幼齡家兔完整皮膚的刺激反應評分（n=6）

表4 七參連濕疹膏多次涂搽幼齡家兔破損皮膚的刺激反應評分（n=6）

本次家兔皮膚刺激試驗結果顯示，對幼齡家兔的正常皮膚和破損皮膚，七參連濕疹膏單次及多次涂搽皮膚用藥的刺激指數(shù)均≤0.49。病理組織學檢查也未見明顯異常，可認為無刺激性。在激發(fā)給藥后24h、48h和72h，七參連濕疹膏組致敏率分別為10%、0%和0%，根據(jù)致敏性評價標準[8，9]，致敏發(fā)生率在0%～10%，提示七參連濕疹膏無致敏性。

綜上所述，七參連濕疹膏單次及多次經(jīng)皮涂搽對幼齡家兔的完整皮膚和破損皮膚均無明顯刺激性；給幼齡豚鼠皮膚用藥后，無過敏作用。皮膚安全性評價實驗表明七參連濕疹膏對幼齡動物皮膚給藥使用安全。