乳清蛋白抗氧化肽的制備及體外抗氧化活性研究

孫 敏，李 誠，劉愛平，方旎凡，杜 遷，楊 浩

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院，四川 雅安 625014)

生物活性肽是結(jié)構(gòu)介于氨基酸與蛋白質(zhì)之間，含有2～20個(gè)氨基酸，對生物的生命活動(dòng)具有積極作用并最終影響機(jī)體健康的特殊蛋白片段[1]?？寡趸幕钚詮?qiáng)，相對分子質(zhì)量小，易吸收，能捕捉和消除生物體內(nèi)多余自由基，延緩脂質(zhì)過氧化[2-3]，已成為國內(nèi)外研究較多的一種生物活性肽。國內(nèi)外研究者已經(jīng)從沙丁魚[4]、豬皮[5]、蛋清[6]、大米[7]、大豆[8]、玉米[9]等動(dòng)植物蛋白酶解液中分離純化具有顯著抗氧化活性的肽段。

乳清是奶酪和酪蛋白生產(chǎn)過程中的副產(chǎn)物，全世界乳清年產(chǎn)量為180×106～190×106t，但只有50%的乳清被利用[10]。乳清中含有乳糖、乳清蛋白、脂肪、維生素和礦物質(zhì)等營養(yǎng)物質(zhì)。如果乳清中的蛋白質(zhì)未充分回收而直接排放乳清，必會(huì)造成資源的極大浪費(fèi)。近年來隨著乳源生物活性肽研究的興起，乳清蛋白中具有生物活性的肽段被越來越多的研究者發(fā)現(xiàn)[2,11-12]。利用乳清蛋白開發(fā)功能肽產(chǎn)品，不僅可以減少浪費(fèi)，減輕污染，還能提高產(chǎn)業(yè)附加值。本研究先篩選酶解乳清蛋白的最佳蛋白酶，然后在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過響應(yīng)面法優(yōu)化酶解乳清蛋白制備抗氧化肽的工藝條件，并在體外評價(jià)其抗氧化活性，旨在為乳清蛋白的開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 原料與試劑

乳清蛋白：市售(蛋白質(zhì)含量為79.69%)；中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶、酸性蛋白酶和菠蘿蛋白酶，上海瑞永生物科技有限公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)，2′-聯(lián)氨-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)，美國Sigma公司；Lowry法蛋白濃度測定試劑盒，北京索萊寶科技有限公司；其他試劑均為分析純。

1.1.2 儀器與設(shè)備

PHS-3C型pH計(jì)；D-37520高速冷凍離心機(jī)、Varioskan Flash酶標(biāo)儀，美國Thermo Fisher公司；HH數(shù)顯恒溫水浴鍋；QT-2旋渦混合器。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 乳清蛋白抗氧化肽的制備

乳清蛋白→溶解→沸水浴10 min →冷卻至室溫→調(diào)pH→加酶恒溫酶解→沸水浴10 min→離心→乳清蛋白抗氧化肽。

以5種蛋白酶為對象，選擇加酶量5 000 U/g，在最適條件(見表1)下酶解3 h后離心(4 000 r/min，20 min)，取上清液，測定上清液多肽含量和羥自由基清除率，篩選最適蛋白酶。以篩選的蛋白酶為研究對象，進(jìn)一步研究酶解pH(5.5、6.0、6.5、7.0、7.5)、酶解時(shí)間(1、2、3、4、5 h)、酶解溫度(50、55、60、65、70℃)、底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)(1%、3%、5%、7%、9%)和加酶量(1 000、3 000、5 000、7 000、9 000 U/g)對酶解效果的影響。

表1 蛋白酶酶解條件

1.2.2 多肽含量測定

Lowry 法中酶標(biāo)儀法，具體參照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.2.3 體外抗氧化活性測定

將在最優(yōu)條件下制備的乳清蛋白抗氧化肽配制成不同質(zhì)量濃度(1、2、3、4、5 mg/mL) 溶液，分別測定其對羥自由基清除率、ABTS+自由基清除率、DPPH自由基清除率和超氧陰離子自由基清除率并與相同質(zhì)量濃度的VC比較。羥自由基清除率測定參照徐懷德等[13]的方法；ABTS+自由基清除率測定參照綦蕾等[14]的方法；DPPH自由基清除率測定參照張周莉等[15]的方法；超氧陰離子自由基清除率測定參照Pan等[16]的方法。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理

用Microsoft Excel 2010進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，SPSS 22進(jìn)行顯著性分析，Design-Expert 8.0軟件進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，每個(gè)處理平行測定3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白酶的篩選

在底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%、加酶量5 000 U/g條件下，在各蛋白酶最適溫度和最適pH下酶解3 h，不同蛋白酶對酶解效果的影響如圖1所示。

圖1 酶種類對酶解效果的影響

由圖1可知，中性蛋白酶酶解液中多肽含量最高，達(dá)到 35.02 mg/mL，而酸性蛋白酶酶解液中多肽含量最低，僅為 25.43 mg/mL。并且中性蛋白酶酶解液對羥自由基清除能力最強(qiáng)，清除率達(dá)到66.69%，菠蘿蛋白酶酶解液對羥自由基清除能力最弱，清除率僅為53.58%。因此，選擇中性蛋白酶為最優(yōu)酶進(jìn)行后續(xù)酶解工藝的優(yōu)化。

2.2 單因素試驗(yàn)

2.2.1 pH對酶解效果的影響

在底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%、加酶量5 000 U/g、酶解溫度55℃、酶解時(shí)間3 h條件下，不同pH對酶解效果的影響如圖2所示。

由圖2可知，隨著pH的增大，酶解液對羥自由基清除率和多肽含量均呈先上升后下降趨勢。當(dāng)pH為6.0時(shí)，酶解液對羥自由基清除能力最強(qiáng)，清除率達(dá)到72.29%，此后，隨著pH的增加，羥自由基清除率下降；多肽含量在pH為7.0時(shí)達(dá)到最大值，為35.79 mg/mL。這可能是反應(yīng)體系的pH會(huì)直接影響酶分子及底物的解離狀態(tài)，進(jìn)而影響酶與底物的結(jié)合，最終影響酶解液的多肽含量和羥自由基清除活性[17]。因此，確定酶解適宜的pH為6.0。

圖2 pH對酶解效果的影響

2.2.2 酶解時(shí)間對酶解效果的影響

在pH 6.0、底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%、加酶量5 000 U/g、酶解溫度55℃條件下，不同酶解時(shí)間對酶解效果的影響如圖3所示。

圖3 酶解時(shí)間對酶解效果的影響

由圖3可知，隨酶解時(shí)間的延長，酶解液對羥自由基清除率和多肽含量都呈先上升后下降的趨勢。當(dāng)酶解時(shí)間為2 h時(shí)，酶解液清除羥自由基的能力最強(qiáng)，清除率達(dá)到了73.09%。在酶解時(shí)間為3 h時(shí)，酶解液中多肽含量達(dá)到最高，為32.67 mg/mL。之后酶解液的多肽含量和羥自由基清除率都隨酶解時(shí)間的延長而緩慢降低?？赡苁且?yàn)殡S酶解時(shí)間的延長，具有抗氧化活性的片段被進(jìn)一步水解成氨基酸，導(dǎo)致活性降低[18]。因此，確定最適酶解時(shí)間為2 h。

2.2.3 酶解溫度對酶解效果的影響

在pH 6.0、酶解時(shí)間2 h、底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%、加酶量5 000 U/g條件下，不同酶解溫度對酶解效果的影響如圖4所示。

由圖4可知，隨酶解溫度的升高，酶解液對羥自由基清除率和多肽含量均呈先上升后下降趨勢。中性蛋白酶的最適溫度在55℃左右，此時(shí)多肽含量最高，達(dá)到36.12 mg/mL,而酶解液對羥自由基清除能力并非最強(qiáng)。當(dāng)酶解溫度達(dá)到60℃時(shí)，酶解液對羥自由基清除能力最強(qiáng)，清除率達(dá)到73.98%，此后，隨酶解溫度的升高，多肽含量和羥自由基清除率都下降?？赡苁沁^高的溫度使得維持酶分子結(jié)構(gòu)的次級(jí)鍵斷裂，導(dǎo)致酶活性降低，延緩酶解進(jìn)程[19]。因此，確定最適酶解溫度為60℃。

圖4 酶解溫度對酶解效果的影響

2.2.4 底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)對酶解效果的影響

在pH 6.0、酶解時(shí)間2 h、酶解溫度60℃、加酶量5 000 U/g條件下，不同底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)對酶解效果的影響如圖5所示。

圖5 底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)對酶解效果的影響

由圖5可知，隨著底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，酶解液對羥自由基清除率呈先上升后下降趨勢，而多肽含量一直上升。當(dāng)?shù)孜镔|(zhì)量分?jǐn)?shù)從1%增加到5%時(shí)，多肽含量迅速增加，而羥自由基清除率先上升后下降，在底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%時(shí)，羥自由基清除率達(dá)到最高，為72.73%。在底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%時(shí)，酶解液對羥自由基清除率為71.35%， 僅次于最高清除率，多肽含量則為 35.31 mg/mL，遠(yuǎn)高于底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%時(shí)的多肽含量。因此，確定最適底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%。

2.2.5 加酶量對酶解效果的影響

在pH 6.0、酶解時(shí)間2 h、酶解溫度60℃、底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%條件下，不同加酶量對酶解效果的影響如圖6所示。

由圖6可知，隨著加酶量的增加，酶解液對羥自由基清除率和多肽含量均呈先升高后下降趨勢。這可能是因?yàn)楫?dāng)?shù)孜镔|(zhì)量分?jǐn)?shù)一定時(shí)，增大加酶量，底物蛋白水解越充分，生成的小肽越多，之后隨著加酶量過多，過量的酶分子反而抑制了中間產(chǎn)物轉(zhuǎn)化為酶解終產(chǎn)物，使得多肽含量下降。在加酶量為5 000 U/g 時(shí)，酶解液對羥自由基清除率最大，為73.56%，多肽含量為34.44 mg/mL，僅次于最高的多肽含量。因此，確定5 000 U/g為最適加酶量。

圖6 加酶量對酶解效果的影響

2.3 響應(yīng)面法優(yōu)化試驗(yàn)

2.3.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，固定底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%、加酶量為5 000 U/g，選取pH(A)、酶解溫度(B)和酶解時(shí)間(C)為自變量，以羥自由基清除率(Y)為響應(yīng)值，根據(jù)響應(yīng)面分析法中心組合設(shè)計(jì)原理進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)。響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平見表2，響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表3。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

2.3.2 響應(yīng)面優(yōu)化及結(jié)果

利用Design-Expert 8.0 軟件進(jìn)行多元回歸擬合，得到回歸模型方程：Y=72.71-0.79A-0.60B-0.14C-3.48AB+0.32AC-1.29BC-1.38A2+0.39B2-1.5C2。

對該回歸模型的顯著性進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表4。

表4 方差分析

注：* * 表示差異極顯著(P<0.01)，* 表示差異顯著(P<0.05)。

2.3.3 響應(yīng)面優(yōu)化與驗(yàn)證

對試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行優(yōu)化，得到乳清蛋白抗氧化肽制備的最佳條件為pH 5.51、酶解溫度64.67℃、酶解時(shí)間1.655 h、底物質(zhì)量分?jǐn)?shù) 5%、加酶量5 000 U/g，此時(shí)乳清蛋白抗氧化肽對羥自由基清除率預(yù)測值為75.52%?？紤]到實(shí)際可操作性，將制備工藝條件調(diào)整為pH 5.50、酶解溫度65℃、酶解時(shí)間1.65 h、底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%、加酶量5 000 U/g，在此條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，測得乳清蛋白抗氧化肽對羥自由基清除率為74.54%，與預(yù)測值吻合度達(dá)到98.70%，試驗(yàn)值與回歸方程預(yù)測值吻合較好，說明建立的模型能夠很好地預(yù)測乳清蛋白抗氧化肽對羥自由基清除率。

2.4 乳清蛋白抗氧化肽的體外抗氧化活性

2.4.1 羥自由基清除活性(見圖7)

圖7 乳清蛋白抗氧化肽的羥自由基清除活性

由圖7可知，乳清蛋白抗氧化肽對羥自由基清除率弱于VC，隨著其質(zhì)量濃度的增加，對羥自由基清除能力逐漸增強(qiáng)，并呈一定的量效關(guān)系。乳清蛋白抗氧化肽質(zhì)量濃度為5 mg/mL時(shí)，對羥自由基清除率達(dá)到75.25%，為相同質(zhì)量濃度VC的74.83%，其IC50值為2.174 mg/mL。

2.4.2 ABTS+自由基清除活性(見圖8)

圖8 乳清蛋白抗氧化肽的ABTS+自由基清除活性

由圖8可知，乳清蛋白抗氧化肽對ABTS+自由基清除率隨著樣品質(zhì)量濃度的增加而升高。樣品質(zhì)量濃度從1 mg/mL增加到2 mg/mL時(shí)，對ABTS+自由基清除率從68.15%增加到88.16%，增幅較大，之后隨著樣品質(zhì)量濃度的增加對ABTS+自由基清除率緩慢增加。樣品質(zhì)量濃度為5 mg/mL時(shí)，對ABTS+自由基清除率達(dá)到99.11%，接近于同質(zhì)量濃度VC的清除率，IC50值為0.709 mg/mL。

2.4.3 DPPH自由基清除活性(見圖9)

圖9 乳清蛋白抗氧化肽的DPPH自由基清除活性

由圖9可知，乳清蛋白抗氧化肽對DPPH自由基清除率隨樣品質(zhì)量濃度增加而升高，并呈一定的量效關(guān)系。乳清蛋白抗氧化肽質(zhì)量濃度為5 mg/mL 時(shí)，對DPPH自由基清除率為68.79%，為相同質(zhì)量濃度VC的69.76%，樣品的IC50值為2.813 mg/mL。

2.4.4 超氧陰離子自由基清除活性(見圖10)

圖10 乳清蛋白抗氧化肽的超氧陰離子自由基清除活性

由圖10可知，乳清蛋白抗氧化肽對超氧陰離子自由基清除率隨樣品質(zhì)量濃度增加而升高，并且呈現(xiàn)良好的量效關(guān)系。樣品質(zhì)量濃度為5 mg/mL 時(shí)，對超氧陰離子自由基清除率為51.36%，僅為相同質(zhì)量濃度VC的51.46%，相對于 VC有一定差距，樣品的IC50值為4.579 mg/mL。

3 結(jié) 論

本研究表明酶解乳清蛋白較佳蛋白酶為中性蛋白酶。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上利用響應(yīng)面法得到酶解乳清蛋白制備抗氧化肽的最佳工藝條件為pH 5.50、酶解溫度65℃、酶解時(shí)間1.65 h、底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%、加酶量5 000 U/g，在此條件下乳清蛋白抗氧化肽對羥自由基清除率為74.54%，與模型預(yù)測值(75.52%)無顯著差異，說明通過響應(yīng)面試驗(yàn)得到的回歸方程能較好預(yù)測結(jié)果。隨著乳清蛋白抗氧化肽質(zhì)量濃度增加，其對羥自由基清除率、ABTS+自由基清除率、DPPH自由基清除率和超氧陰離子自由基清除率都增大，并呈一定量效關(guān)系，IC50值分別為2.174、0.709、 2.813 mg/mL和4.579 mg/mL。表明乳清蛋白抗氧化肽具有較強(qiáng)的體外抗氧化活性，在天然抗氧化劑和保健食品中有一定的開發(fā)利用價(jià)值。