花生肽鈣復(fù)合物鈣結(jié)合特性及氨基酸組成研究

袁興宇，包小蘭，馮文君，馮國雪

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，呼和浩特 010018)

花生是一種重要的油料作物，含有豐富的蛋白質(zhì)，利用花生蛋白通過不同條件酶解制備得到不同的功能性多肽，這些多肽具有抗氧化、降血脂、降膽固醇等生理活性[1-3]，具有極高的研究價值。前期研究發(fā)現(xiàn)，花生肽可以與鈣離子結(jié)合形成水溶性復(fù)合物[4]，如何進一步提高花生肽的鈣結(jié)合量并明確其鈣結(jié)合特性及氨基酸組成，對其促進人體鈣吸收的研究及功能性食品的開發(fā)具有重要意義。有研究表明，大豆肽具有較好的鈣結(jié)合能力[5]，通過谷氨酰胺酶對大豆肽進行脫酰胺處理，可以顯著提高大豆肽的鈣結(jié)合量[6]。谷氨酰胺酶是否也會對花生肽的鈣結(jié)合量產(chǎn)生影響目前尚不明確。為此本研究探討了脫酰胺處理對花生肽鈣結(jié)合量的影響，并研究了花生肽鈣復(fù)合物的鈣結(jié)合特性及氨基酸組成，為進一步探究花生肽對促進人體鈣吸收的影響及功能性食品的開發(fā)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

花生分離蛋白(實驗室自制)；Protease M(51.5 AU/g,粉體)、谷氨酰胺酶(日本天野酶制劑株式會社)；氫氧化鈉、鹽酸、無水氯化鈣、醋酸、醋酸鈉、磷酸氫二鈉等，分析純；即用型透析袋(MWCO為500 Da，31 mm，美國光譜醫(yī)學(xué))。

AL204電子天平，梅特勒-托利多儀器有限公司；HJ-6電熱恒溫水浴鍋；PB-10酸度計；MS-H280-PRO恒溫加熱磁力攪拌器；SC-3612低速離心機；LGJ-25C冷凍干燥機；BCD-223MTX新飛冰箱；HJ-1磁力攪拌器；Magna-IR 750傅里葉變換紅外光譜儀，美國 Nicolet公司；S-3000N掃描電子顯微鏡、L-8900氨基酸自動分析儀，Hitachi日立有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 花生肽的制備

稱取1 g花生分離蛋白于燒杯中，加入50 mL蒸餾水，用1 mol/L HCl調(diào)節(jié)pH至3，放入50℃恒溫水浴中加入0.01 g Protease M，保持50℃酶解60 min。酶解后90℃水浴滅酶10 min。冷卻至室溫，3 000 r/min離心20 min，取上清液，用1 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH至7.4，冷凍干燥，得到花生肽。

1.2.2 花生肽的脫酰胺處理[7-8]

將花生肽配制成2%溶液，在pH 7.0、50℃的條件下添加谷氨酰胺酶(酶底比1∶ 50)進行酶解，分別在酶解時間為0、60、120、180、240 min時取樣，脫酰胺反應(yīng)后90℃水浴滅酶10 min，取上清液真空冷凍干燥，得到脫酰胺花生肽。

1.2.3 花生肽脫酰胺率的測定[9]

稱取樣品0.05 g于螺口培養(yǎng)管中，加入5 mL、3 mol/L鹽酸，放入110℃烘箱中干燥3 h。然后取康威氏皿，在中央內(nèi)室加入2%硼酸3 mL和指示劑1滴，在外室一側(cè)加入處理好的樣品2 mL，另一側(cè)加飽和K2CO3溶液3 mL，將康威氏皿放入30℃恒溫箱中，36 h后取出。最后用0.01 mol/L HCl滴定內(nèi)室吸收液，以藍紫色為終點。脫酰胺率的計算公式如下。

脫酰胺率=(脫酰胺處理前滴定值-脫酰胺處理后滴定值)/脫酰胺處理前的滴定值×100%

1.2.4 花生肽鈣復(fù)合物的制備及鈣結(jié)合量的測定

稱取10 mg脫酰胺花生肽溶解于蒸餾水中，配制成10%的溶液，在37℃水浴中放置10 min，使其充分溶解。然后加入5 mL 0.06 mol/L的CaCl2溶液，反應(yīng)30 min后，離心(4 500 r/min，20 min)。取上清液加入到透析袋中，將透析袋用專用夾夾緊，轉(zhuǎn)移到裝有蒸餾水的燒杯中，在冰箱內(nèi)(4℃)用磁力攪拌器進行透析，以除去游離鈣。透析過程中每4 h更換1次透析液，持續(xù)透析48 h，取部分樣品冷凍干燥，即為花生肽鈣復(fù)合物。其余樣品移到容量瓶中，透析袋用蒸餾水沖洗3次，定容到30 mL，采用原子吸收光譜法測定透析液中鈣的含量，計算鈣結(jié)合量。

1.2.5 掃描電鏡分析

取少量脫酰胺花生肽及其肽鈣復(fù)合物冷凍干燥樣品進行真空噴金。加速電壓設(shè)為15 kV，使用S-3000N掃描電子顯微鏡對樣品微觀結(jié)構(gòu)進行觀察，在600倍與1 500倍下獲取掃描圖像。

1.2.6 傅里葉變換紅外光譜分析[10]

稱取微量凍干粉樣品放于金剛石窗片上，壓平后在Magna-IR 750傅里葉變換紅外光譜儀中檢測，掃描64次，分辨率為4 cm-1。

1.2.7 花生肽鈣復(fù)合物氨基酸組成分析

稱取脫酰胺花生肽鈣復(fù)合物樣品10 mg，用6 mol/L鹽酸在100℃下水解24 h，水解液脫酸后用磷酸緩沖液(pH 2.2)定容，使用氨基酸自動分析儀測定其氨基酸組成。

1.2.8 統(tǒng)計與分析

每個實驗重復(fù)3次，利用SPSS19.0軟件進行統(tǒng)計分析，差異顯著性水平為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 脫酰胺處理對花生肽鈣結(jié)合量的影響

前期研究發(fā)現(xiàn)酶解60 min水解度為11.83%的花生酶解物的鈣結(jié)合量為82.05 mg/g，其鈣結(jié)合量顯著高于酶解30、90、120、150 min的酶解物的鈣結(jié)合量，因此本研究選取酶解時間為60 min的產(chǎn)物進行進一步研究。以花生分離蛋白為原料，采用蛋白酶Protease M將其酶解60 min獲得花生肽，得率為23.73%，進一步采用谷氨酰胺酶對其進行脫酰胺處理，分別在處理0、60、120、180、240 min取樣，獲得脫酰胺花生肽，制備花生肽鈣復(fù)合物，測定花生肽脫酰胺率及鈣結(jié)合量，結(jié)果如表1所示。

表1 花生肽的脫酰胺率及鈣結(jié)合量

注：同列數(shù)字不同字母上標為有顯著性差異(P<0.05)。

由表1可知，花生肽的鈣結(jié)合能力隨著脫酰胺時間的延長及脫酰胺率的增加得到了顯著的提高，在脫酰胺時間為180 min、脫酰胺率為35.86%時其鈣結(jié)合量達到134.41 mg/g，鈣結(jié)合量顯著提升了52.36 mg/g。繼續(xù)延長脫酰胺時間，花生肽的脫酰胺率及鈣結(jié)合量無顯著變化(P<0.05)。說明脫酰胺處理可以提高花生肽的鈣結(jié)合量。主要原因是通過脫酰胺反應(yīng)使肽鏈上的羧基更多暴露出來[11-13]，從而增加了鈣的結(jié)合位點。

2.2 花生肽與鈣的結(jié)合特性

由2.1可知，脫酰胺可以顯著提高花生肽的鈣結(jié)合量，但花生肽與鈣的具體結(jié)合特性尚未明確。選取鈣結(jié)合量最高的脫酰胺時間為240 min的花生肽制備花生肽鈣復(fù)合物，花生肽鈣復(fù)合物得率為86.75%。對該肽鈣復(fù)合物及未與鈣反應(yīng)的脫酰胺花生肽進行電鏡掃描，得到的掃描電鏡圖如圖1所示。

圖1 花生肽(H)及其肽鈣復(fù)合物(H-Ca)的600倍(A)、1 500倍(B)掃描電鏡圖

由圖1可知，花生肽呈現(xiàn)疏松片狀結(jié)構(gòu)，這是由于真空冷凍干燥時水分升華后親水區(qū)所留的痕跡[14]。加鈣反應(yīng)后，花生肽鈣復(fù)合物微觀結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，片狀結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化為顆粒狀結(jié)構(gòu)，這一研究結(jié)果與劉閃等[15]對白鰱魚骨膠原多肽及Peng等[16]對太平洋鱈魚骨肽與鈣反應(yīng)的掃描電鏡研究結(jié)果一致。

進一步通過傅里葉變換紅外光譜對花生肽及其肽鈣復(fù)合物進行分析，結(jié)果如圖2、表2所示。

注：A.脫酰胺花生肽；B.脫酰胺率為0的花生肽鈣復(fù)合物；C.脫酰胺率為19.72%花生肽鈣復(fù)合物；D.脫酰胺率為39.21%的花生肽鈣復(fù)合物。下同。

圖2 花生肽及其肽鈣復(fù)合物的中紅外光譜圖

表2 脫酰胺前后花生肽及其肽鈣復(fù)合物的中紅外光譜主要頻率譜帶 cm-1

2.3 花生肽鈣復(fù)合物的氨基酸組成

不同多肽具有的不同生理活性與其氨基酸組成相關(guān)，有研究[17]報道稱谷氨酸及天冬氨酸在鈣結(jié)合過程中起著重要的作用，肽段中酸性氨基酸含量與其鈣結(jié)合量呈線性相關(guān)。利用氨基酸自動分析儀對脫酰胺時間為240 min花生肽鈣復(fù)合物的氨基酸組成進行分析，結(jié)果如表3所示。

表3 花生肽鈣復(fù)合物的氨基酸組成 %

由表3可知，花生肽中含有大量的谷氨酸(23.49%)和天冬氨酸(10.76%)，表明花生肽鈣復(fù)合物中含有較多酸性氨基酸，酸性氨基酸含量對花生肽鈣結(jié)合量具有重要的作用。

于濟洋[18]探究了菊芋蛋白的鈣結(jié)合特性，發(fā)現(xiàn)高鈣結(jié)合量的組分中含有較多的谷氨酸，Liu等[19]研究麥胚肽與鈣離子的螯合特性，表明高鈣結(jié)合能力的麥胚肽含有較多的谷氨酸和天冬氨酸，與本研究結(jié)果相一致，表明酸性氨基酸含量是花生肽具有高鈣結(jié)合量的重要因素。

3 結(jié) 論

(1)花生肽的鈣結(jié)合能力隨著脫酰胺時間的延長及脫酰胺率的增加得到了顯著的提高，表明脫酰胺處理可以提高花生肽的鈣結(jié)合量。脫酰胺處理時間為 240 min時，花生肽的鈣結(jié)合量最大，為135.26 mg/g。

(2)掃描電鏡分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)加鈣反應(yīng)后花生肽微觀結(jié)構(gòu)由疏松片狀結(jié)構(gòu)聚合為顆粒狀結(jié)構(gòu)；傅里葉紅外光譜分析表明花生肽鏈上的氨基及羧基是鈣的主要結(jié)合位點，脫酰胺處理后羧基上的氧原子與鈣的配位作用得到增強，促進了花生肽鈣結(jié)合量的提高。

(3)花生肽鈣復(fù)合物的氨基酸組成中天冬氨酸(10.76%)及谷氨酸含量(23.49%)較高，表明酸性氨基酸含量是花生肽具有高鈣結(jié)合量的重要因素。