小麥真菌結(jié)構(gòu)分析及其與嘔吐毒素含量的關(guān)系

戴寶玲 楊華 戴賢君

摘要：旨在闡明污染小麥的真菌的結(jié)構(gòu)組成并分析污染小麥的真菌與麥粒中嘔吐毒素（DON）濃度之間的關(guān)系。采用高效液相色譜法（HPLC）測定麥粒中的DON含量，選取DON濃度為高、中、低[DON含量分別為（2 982±1 534）、（972±251）、（42±1） μg/kg]的小麥樣品各12份，抽提3組小麥微生物DNA進(jìn)行真菌測序。結(jié)果表明，通過基因組DNA提取、高通量測序、生物信息學(xué)分析后，共得到820個(gè)運(yùn)算分類單元（operational taxonomic unit，簡稱OTU）?；诓煌诸愃降姆治隹芍?，其優(yōu)勢(shì)菌門為子囊菌門（Ascomycota）、擔(dān)子菌門（Basidiomycota），平均相對(duì)豐度分別為46964 0%、0.722 1%;優(yōu)勢(shì)菌屬為鏈格孢屬（Alternaria）、附球菌屬（Epicoccum），分別占16.987 9%、5.570 1%。3組小麥中的真菌物種數(shù)量有顯著差異（P<0.05）。由研究結(jié)果可知，小麥中存在一定的病原真菌污染，如鏈格孢屬（Alternaria）、葡萄孢屬（Botrytis），有必要對(duì)攜帶真菌毒素DON小麥中的真菌結(jié)構(gòu)進(jìn)行檢測，并分析兩者間的關(guān)系。

關(guān)鍵詞：小麥;高效液相色譜;嘔吐毒素;高通量測序;菌群結(jié)構(gòu)

中圖分類號(hào)： S432.4+4 ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A ?文章編號(hào)：1002-1302（2019）12-0228-05

小麥?zhǔn)侨蠊任镏唬且环N在世界各地被廣泛種植的禾本科植物，起源于中東新月沃土地區(qū)，是世界上人們最早栽培的農(nóng)作物之一，其營養(yǎng)豐富，經(jīng)濟(jì)價(jià)值較高[1]。作為我國重要的糧食作物，小麥的種植區(qū)域非常廣闊，北到黑龍江，南到海南島[2]。但是由于受到地理位置及氣候的影響，一些地區(qū)所產(chǎn)小麥會(huì)受到真菌污染，徐文靜等于2015年對(duì)安徽省5個(gè)地級(jí)市小麥的真菌污染情況進(jìn)行調(diào)查發(fā)現(xiàn)，其污染率為100%[3]。真菌在適宜的條件下可能會(huì)產(chǎn)生有毒的代謝產(chǎn)物——真菌毒素，目前研究發(fā)現(xiàn)的300多種真菌毒素中約有20種對(duì)人類和動(dòng)物有確定的毒性作用[4]。其中脫氧血腐鐮刀菌烯醇（deoxynivalenol，簡稱DON），又稱嘔吐毒素，是小麥中常見的污染真菌毒素，DON毒性較穩(wěn)定，在加工過程中也很難將其毒性破壞，進(jìn)入食物鏈后，會(huì)對(duì)人畜的健康造成一定的威脅[5]。因此，有必要對(duì)小麥嘔吐毒素和真菌污染情況進(jìn)行調(diào)查，并分析兩者之間的關(guān)系。高效液相色譜法具有高壓、高速、高效、高靈敏度、應(yīng)用范圍廣的“四高一廣”特點(diǎn)，可以用此方法檢測小麥樣品中嘔吐毒素的含量。高通量測序技術(shù)的出現(xiàn)克服了一些試驗(yàn)技術(shù)具有的通量低、信息量小、成本高的缺陷[6]，隨著其快速發(fā)展，目前已經(jīng)成為微生物群落研究中非常重要的工具[7]。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

1.1.1 樣品來源與試驗(yàn)設(shè)計(jì) 取浙江省2016年產(chǎn)小麥，依據(jù)嘔吐毒素含量分成高（H）、中（M）、低（L）3組，每組12份樣品，用于分析其中的真菌結(jié)構(gòu)，小麥嘔吐毒素H、M、L組平均含量分別為（2 982±1 534）、（972±251）、（42±1） μg/kg。

1.1.2 儀器 高效液相色譜儀，安捷倫科技有限公司;熒光分光光度計(jì)，上海精密儀器儀表有限公司;Illumina測序儀，Illumina公司;PCR擴(kuò)增儀，德國Biometra公司。

1.2 DNA的提取及擴(kuò)增

采用ZR Fungal/Bacterial DNA MiniPrepTM（Zymo Research）對(duì)小麥的DNA進(jìn)行提取。用2%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行進(jìn)一步檢測。以提取的DNA為模板，用ITS2引物 ITS3-2024F （5′-GCATCGATGAAGAACGCAGC-3′）和ITS4-2409R（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）對(duì)小麥真菌DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（internal transcribed spacer，簡稱ITS）測序分析。

1.3 DNA測序和質(zhì)量控制

用熒光分光光度計(jì)測得提取的DNA濃度，選取濃度在40～100 ng/μL、D260 nm/280 nm在1.8～2.0之間的DNA，用Illumina Hiseq平臺(tái)高通量技術(shù)進(jìn)行測序。

1.4 生物信息學(xué)分析

采用Illumina測序技術(shù)對(duì)小麥中真菌ITS的ITS2區(qū)域進(jìn)行掃描測序，得到的圖像數(shù)據(jù)經(jīng)Base Calling轉(zhuǎn)化為序列數(shù)據(jù)，再用QIIME軟件（Quantitative Insights Into Microbial Ecology，V 1.7.0，http：//qiime.org/scripts/split_libraries_fastq.html）對(duì)序列進(jìn)行質(zhì)控和過濾，得到高質(zhì)量的DNA序列[8-9]。根據(jù)相似性≥97%的原則將通過質(zhì)控的有效序列聚類成為操作分類單元（operational taxonomic unit，簡稱OTU）[10]，基于OTU聚類分析結(jié)果，進(jìn)行香農(nóng)指數(shù)分析，基于分類學(xué)信息，分別在門、屬水平上進(jìn)行小麥真菌菌群結(jié)構(gòu)的統(tǒng)計(jì)與分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析（ANOVA），來比較不同DON濃度的小麥真菌相對(duì)豐度的差異，對(duì)有顯著性差異的處理進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 小麥中真菌物種的豐度及多樣性

通過小麥基因組DNA提取、高通量測序、生物信息學(xué)分析后共得到820個(gè)OTUs，根據(jù)相似性≥97%的原則，以抽取的序列數(shù)與它們所能代表的OTU數(shù)構(gòu)建曲線，即稀釋性曲線（rarefaction curve）[11]，繪制的曲線均趨于平緩（圖1），說明小麥樣品測序數(shù)據(jù)量合理，能夠覆蓋小麥中的所有真菌并能真實(shí)反映物種的多樣性組成。

2.2 基于門、屬水平對(duì)小麥上攜帶的真菌群落結(jié)構(gòu)的分析

2.2.1 門水平的小麥真菌群落結(jié)構(gòu)分析 從微生物分類門的水平可知，本研究收集的小麥樣品中主要包含子囊菌門（Ascomycota）、擔(dān)子菌門（Basidiomycota）、纖毛亞門（Ciliophora）、接合菌門（Zygomycota）和球囊菌門（Glomeromycota）等。其中子囊菌門、擔(dān)子菌門是小麥真菌的優(yōu)勢(shì)菌門，均100%被檢出，其相對(duì)豐度分別為46.9640%（變化范圍為12.399 6%～82.496 1%）、0.722 1%（變化范圍為0.103 2%～1.877 3%），詳見表1。

2.2.2 屬水平的小麥真菌群落結(jié)構(gòu)分析 從屬的水平上分析可知，小麥中真菌最大豐度排名前35的屬中，17個(gè)真菌屬在小麥中100%被檢出，檢出率>90%的真菌屬有24個(gè)，其中優(yōu)勢(shì)菌屬為鏈格孢屬（Alternaria）、附球菌屬（Epicoccum），平均相對(duì)豐度分別為16.987 9%、5.570 1%，中位數(shù)分別為4.634 2%（變化范圍為2.634 6%～41.050 2%）和2.358 6%（變化范圍為0.778 6%～16.341 4%），詳見表2。

2.3 基于門、屬水平對(duì)小麥中真菌和DON關(guān)系的分析

2.3.1 樣品測序概況 測序后進(jìn)行菌群結(jié)構(gòu)的多樣性分析，由圖2可以看出，3種不同濃度DON處理的小麥樣品平均分別獲得（131±23）、（117±13）、（118±13）個(gè)OTUs，其中H組小麥真菌的物種數(shù)量與M、L組有顯著差異（P<0.05）;菌群多樣性指數(shù)（香農(nóng)指數(shù)）在3組間無顯著差異（圖2）。

2.3.2 基于門水平對(duì)小麥中真菌相對(duì)豐度和DON關(guān)系的分析 從門的水平上分析可知，小麥中高濃度DON組（H組）的子囊菌門、擔(dān)子菌門的平均相對(duì)豐度分別為（40.287 8±9.067 9）%、（0.688 6±0.035 3）%，均低于中濃度DON組（M組）的（51.784 4±3.170 1）%、（0.755 7±0.069 2）%和低濃度DON組（L組）的（48.819 9±49.052 0）%、（0.722 0±0.427 2）%。H組和M組的子囊菌門相對(duì)豐度有顯著差異（P<0.05）;纖毛亞門、接合菌門和球囊菌門的相對(duì)豐度在3組間均無明顯差異，詳見圖3。

2.3.3 基于屬水平對(duì)小麥中真菌相對(duì)豐度和DON關(guān)系的分析 如圖4所示，從屬水平上分析可知，小麥中真菌最大豐度排名前35的屬中，前12個(gè)屬中鏈格孢屬的豐度相對(duì)較高，L組的平均相對(duì)豐度為（22.573 2±2.126 9）%，高于M組[（19.448 2±4477 9）%]、H組[（8.942 4±1.708 7）%]組，H組鏈格孢屬與L、M組間均有顯著差異（P<0.05）。附球菌屬的平均豐度次之，L組與M、H組間均有顯著差異（P<0.05）。此外，本研究的檢測結(jié)果顯示，存在一定量葡萄孢屬、鐮刀菌屬的病原真菌。Monographella、隱球菌屬、曲霉屬、短梗霉屬、擲孢酵母屬、Pyrenophora和匍柄霉屬的相對(duì)豐度在3組間均無明顯差異。

2.4 小麥樣品的主坐標(biāo)分析

根據(jù)3組中各個(gè)小麥樣品的OTU計(jì)算樣品間的加權(quán)UniFrac距離，再進(jìn)行主坐標(biāo)分析（PCoA）。由圖5可見，PCo1、PCo2分別解釋了17.78%、10.67%的差異性。各處理樣可以分為2個(gè)大集合，可以很明顯地看出，L組與H、M組間的差異較大，H組和M組可視為一簇，即污染毒素濃度低的小麥中的真菌菌群豐度（L組）與污染毒素高的小麥中的真菌菌群豐度（H組和M組）存在差異。小麥中的嘔吐毒素與其真菌菌群豐度呈一定的相關(guān)性。

3 討論

嘔吐毒素是一種真菌毒素，主要分布在谷物中，尤其是小麥中，人和動(dòng)物長期大量食用被DON污染的小麥后會(huì)抑制蛋白質(zhì)的合成，導(dǎo)致嘔吐、腹瀉、厭食、神經(jīng)紊亂等毒性效應(yīng)[12-14]。因此，被DON污染的小麥存在一定的膳食風(fēng)險(xiǎn)，應(yīng)進(jìn)一步對(duì)小麥進(jìn)行真菌菌群結(jié)構(gòu)的研究分析。

基于分類學(xué)門的水平上分析可知，小麥樣品中子囊菌門和擔(dān)子菌門為優(yōu)勢(shì)菌門，這與史亞千等的研究結(jié)果[15]相符。子囊菌門、擔(dān)子菌門真菌屬于病原真菌，研究發(fā)現(xiàn)，有些土壤真菌可能引起植物病害、影響作物產(chǎn)量甚至導(dǎo)致植物死亡[16]。張敏等對(duì)小麥根際土壤真菌群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，子囊菌門和擔(dān)子菌門為優(yōu)勢(shì)菌門[17]，說明土壤可能是小麥污染病原真菌導(dǎo)致其病害的原因之一。

基于分類學(xué)屬水平的分析顯示，小麥樣品中的鏈格孢屬和附球菌屬為優(yōu)勢(shì)菌屬。鏈格孢屬真菌是一類廣泛分布在自然界中的真菌，除了可引起農(nóng)作物病變外，還可使農(nóng)產(chǎn)品腐爛變質(zhì)，并危及農(nóng)產(chǎn)品的食用安全[18]。有些鏈格孢屬真菌還具有一定的產(chǎn)毒能力，是農(nóng)作物的主要致病菌之一，人或動(dòng)物一旦攝入被鏈格孢毒素污染的食物，可能導(dǎo)致急性或慢性中毒，某些鏈格孢毒素還有致畸、致癌、致突變作用[19]。從小麥中檢測發(fā)現(xiàn)的葡萄孢屬真菌屬于一種廣泛分布的植物病原真菌[20]，此外，在許多不同的寄主上發(fā)現(xiàn)了許多葡萄孢新種[21-23]，它們可導(dǎo)致多種作物灰霉病的發(fā)生。鐮刀菌屬和其有性階段的赤霉屬均被檢出，都可產(chǎn)生DON，它們都是具有破壞性的植物病原真菌，可引起小麥的赤霉病。

4 結(jié)論

本研究用高效液相色譜法測定了36份麥粒中的DON含量。通過基因組DNA 提取、高通量測序、生物信息學(xué)分析后共得到820個(gè)OTUs。基于不同分類水平的分析可知，小麥中的優(yōu)勢(shì)菌門為子囊菌門（Ascomycota）、擔(dān)子菌門（Basidiomycota），其平均相對(duì)豐度分別為46.964 0%、0.722 1%。優(yōu)勢(shì)菌屬為鏈格孢屬（Alternaria）、附球菌屬（Epicoccum），分別占16.987 9%、5.570 1%。可以看出，小麥中存在一定的病原真菌污染，應(yīng)引起重視。

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