納米金比色法在家蠶微孢子蟲(chóng)檢測(cè)中的應(yīng)用

戴衛(wèi)江 陳紅麗 張志林

摘要：家蠶微粒子病被列為蠶種生產(chǎn)的唯一檢疫對(duì)象，母蛾鏡檢家蠶微孢子蟲(chóng)（Nosema bombycis，簡(jiǎn)稱(chēng)Nb）是目前最主要的檢疫手段，但其準(zhǔn)確性受到多種因素影響。建立一種簡(jiǎn)便、快捷、準(zhǔn)確的Nb檢測(cè)技術(shù)，對(duì)家蠶微粒子病的防治具有重要意義?；诩{米金（AuNPs）比色法原理，對(duì)AuNPs探針的制備及其標(biāo)記的最佳抗體濃度和最佳pH值進(jìn)行探究，以及探究AuNPs比色法檢測(cè)Nb的靈敏度。結(jié)果表明，Nb抗體與AuNPs（20 nm）結(jié)合最佳濃度為每500 μL AuNPs溶液中添加5 μL 0.5 mg/mL抗體蛋白，標(biāo)記最佳pH值為8.5。AuNPs比色法能夠最低檢測(cè)出Nb蛋白量為 10 ng。本研究成功建立一種基于AuNPs比色法檢測(cè)Nb的新方法。

關(guān)鍵詞：家蠶微孢子蟲(chóng);多克隆抗體;納米金;探針;比色法

中圖分類(lèi)號(hào)：S884.2+1?? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A? 文章編號(hào)：1002-1302（2019）12-0208-04

家蠶微粒子病經(jīng)常給蠶業(yè)生產(chǎn)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失，嚴(yán)重影響蠶絲產(chǎn)業(yè)的穩(wěn)定，由于家蠶微孢子蟲(chóng)（Nosema bombycis，Nb）能經(jīng)胚種傳染，因此，Nb被列為蠶種生產(chǎn)的唯一法定檢疫對(duì)象[1-3]。目前最主要的檢疫手段母蛾鏡檢法主要依賴(lài)檢驗(yàn)人員的判斷，主觀(guān)性強(qiáng)，其準(zhǔn)確性受到多種因素的影響[2-4]。免疫學(xué)和分子生物學(xué)等檢測(cè)技術(shù)在微孢子蟲(chóng)檢測(cè)鑒定方面已有PCR技術(shù)[5]、酶聯(lián)免疫吸附法[6]、膠體金免疫層析技術(shù)[7]、熒光抗體技術(shù)[8]、單抗體金銀染色法[9]、酶標(biāo)抗體檢測(cè)法[10]、核酸分子雜交技術(shù)[11]等，這些檢測(cè)技術(shù)對(duì)儀器設(shè)備和檢測(cè)人員的技術(shù)水平有嚴(yán)格要求，檢測(cè)成本高且不易操作。因此，建立一種簡(jiǎn)便、快捷、準(zhǔn)確的Nb檢測(cè)技術(shù)，對(duì)家蠶微粒子病的防治具有重要意義。

納米金（AuNPs）比色法主要是利用AuNPs表面等離子體共振引起的顏色和吸光度發(fā)生變化，對(duì)目標(biāo)物質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)的方法[12-13]。在溶液中，單分散的AuNPs（20 nm）呈現(xiàn)酒紅色，并且具有相對(duì)較窄的表面等離子體吸收帶，在紫外-可見(jiàn)光吸收光譜（UV-vis）光譜中最大吸收峰波長(zhǎng)為523 nm[14]。相反，含有AuNPs聚集體的溶液則呈現(xiàn)紫色或者藍(lán)色，這是由于AuNPs表面的等離子體共振吸收峰發(fā)生紅移[12]。將蛋白質(zhì)等物質(zhì)作為形成AuNPs聚集體的連接點(diǎn)，導(dǎo)致檢測(cè)體系顏色改變，從而達(dá)到了對(duì)目標(biāo)物質(zhì)有效檢測(cè)[15-19]。Lee等發(fā)明了一種基于AuNPs比色檢測(cè)Hg2+的方法，該方法的檢測(cè)下限達(dá)到 100 nmol/L[20]。Cordray等發(fā)明了一種檢測(cè)目標(biāo)寡核苷酸濃度的AuNPs比色法，該方法在200 μL試驗(yàn)體積內(nèi)可以定量檢測(cè)出 50 amol～500 fmol 目標(biāo)寡核苷酸[13]。Li等發(fā)明一種檢測(cè)牛奶中β-酪蛋白的AuNPs比色法。該方法將抗體結(jié)合在AuNPs上，根據(jù)抗原抗體特異性結(jié)合，使分散的AuNPs聚集，膠體顏色由酒紅色逐漸變成無(wú)色，檢測(cè)限可低至 0.03 μg/mL[21]。由于AuNPs比色法具有簡(jiǎn)單、快速、成本低、肉眼可見(jiàn)等優(yōu)點(diǎn)[23-26]，因此本研究以Nb總蛋白為抗原制備多克隆抗體，從而制備抗體探針，以此來(lái)探究AuNPs比色法在Nb檢測(cè)中應(yīng)用的可行性，期望為AuNPs比色法今后在Nb檢測(cè)上的應(yīng)用打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

試驗(yàn)于2017年8月至2018年3月在中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)研究所病理研究室完成。

1.1 材料與主要試劑

1.1.1 病原來(lái)源 Nb由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)研究所家蠶生理與病理研究室保存，系利用純化的家蠶微孢子懸液（濃度108個(gè)/mL）給家蠶品種菁松×皓月4齡起蠶添食感染后，從患病家蠶中分離提取獲得。

1.1.2 主要儀器與試劑 玻璃珠（sigma-aldrich）購(gòu)自于西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司，研磨器購(gòu)自于美國(guó)Biospec公司，透射電子顯微鏡購(gòu)自于荷蘭Philips公司，Onedrop OD-1000紫外分光光度計(jì)購(gòu)自于上海吉盛醫(yī)學(xué)科技有限公司，檸檬酸三鈉購(gòu)自西隴化工股份有限公司，氯金酸購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑北京有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 納米金（AuNPs）制備 對(duì)100 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.01%的氯金酸溶液進(jìn)行加熱和攪拌（轉(zhuǎn)速500 r/min），煮沸后，快速加入1.8 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的檸檬酸三鈉溶液，持續(xù)煮沸，在溶液顏色穩(wěn)定為酒紅色后繼續(xù)加熱5 min，停止加熱并持續(xù)攪拌30 min[27]。即合成了檸檬酸三鈉包裹的納米金溶膠，自然冷卻至室溫后，定容至100 mL，4 ℃保存?zhèn)溆?。用透射電鏡拍攝和紫外-可見(jiàn)光譜掃描對(duì)所制備的納米金進(jìn)行表征。

1.2.2 家蠶微孢子蟲(chóng)總蛋白提取及其抗體制備 在珠磨式研磨器專(zhuān)用管中加入經(jīng)percoll純化的1 mL Nb（109個(gè)/mL）。之后加入酸洗玻璃珠，并以轉(zhuǎn)速為4 800 r/min進(jìn)行破碎，每次1 min，破碎6次。之后，破碎液中加入0.3 mL樣品裂解液（0.125 mol/l Tris-HCl、5% SDS、50%甘油、5% β-巰基乙醇），充分混勻，4 ℃孵育12 h，8 000 r/min離心10 min，之后將上清液進(jìn)行超濾，將Nb總蛋白置換到PBS中，超濾條件為4 ℃、4 000 r/min離心30 min，重復(fù)操作將樣品濃度調(diào)至 1 mg/mL。將所獲得Nb總蛋白作為抗原進(jìn)行抗體制備[德泰生物科技（南京）有限公司制備]。

1.2.3 抗體與AuNPs結(jié)合的最佳pH值 確定配置500 μL不同pH值（5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10）的納米金溶液，之后分別加入10 μL 0.5 mg/mL Nb多抗溶液，振蕩 20 min 后室溫放置10 min;然后分別加入50 μL的10% NaCl溶液，振蕩混合10 min，室溫下放置2 h，于波長(zhǎng)520 nm測(cè)定D值，繪制曲線(xiàn)[14，28]。

1.2.4 AuNPs與抗體結(jié)合的最佳濃度測(cè)定 將納米金pH值調(diào)至最適值，各EP管中加入500 μL納米金溶液，之后分別加入0、2.5、5.0、7.5、10.0、12.5 μL濃度為0.5 mg/mL的Nb抗體蛋白，振蕩20 min后室溫放置10 min;然后分別加入50 μL 的10% NaCl溶液，振蕩混合10 min，室溫下放置2 h，于波長(zhǎng)520 nm測(cè)其D值，繪制曲線(xiàn)[14，28]。

1.2.5 AuNPs探針制備 將50 mL AuNPs溶液調(diào)至最適pH值，加入適量Nb抗體蛋白后緩慢搖勻30 min，室溫靜置 30 min;加入10% BSA至終濃度為1%，室溫封閉30 min。12 000 r/min 離心30 min，棄上清，用5 mL稀釋液（20 nmol/L Tris-HCl，1% BSA）將沉淀重懸，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.6 納米金探針活性及其特異性測(cè)定 取10 μL納米探針溶液與5 μL 1 mg/mL Nb總蛋白溶液混合，37 ℃分別孵育30 min、1 h、2 h，觀(guān)察各組顏色變化。各取10 μL納米探針溶液，分別加入5 μL不同種類(lèi)蛋白作為抗原（Nb總蛋白、BSA、BmN 細(xì)胞總蛋白），蛋白濃度為1 mg/mL，進(jìn)行比色檢測(cè)。

1.2.7 納米金探針靈敏性測(cè)定確定最優(yōu)反應(yīng)條件，檢測(cè)不同濃度的Nb蛋白樣品（100.0、20.0、2.0、0.5、0.1、0.05、0 μg/mL）。

2 結(jié)果與分析

2.1 AuNPs的制備

應(yīng)用檸檬酸鈉還原法制備的AuNPs溶液呈現(xiàn)酒紅色、透光性好、沒(méi)有聚沉。由AuNPs的透射電鏡照片（圖1-A）可見(jiàn)，粒子呈較為規(guī)則的球形或近球形，分散均勻;圖1-B為AuNPs的紫外-可見(jiàn)吸收光譜，在523 nm處出現(xiàn)了紫外特征吸收峰，根據(jù)納米金最大吸收峰與粒徑存在的線(xiàn)性關(guān)系式[29]（y=0.427 1x+514.56，y表示最大吸收峰，x表示納米金粒徑），計(jì)算出所制備納米金粒徑約為20 nm。

2.2 Nb總蛋白抗體制備

純化后的Nb多克隆抗體通過(guò)ELISA法測(cè)定其效價(jià)>1 ∶ 512 000，SDS-PAGE檢測(cè)顯示，抗體純度在95%以上。Western blot試驗(yàn)結(jié)果（圖2）顯示，Nb總蛋白抗體能夠特異性識(shí)別Nb，并且可以同時(shí)檢測(cè)到Nb的多種蛋白。

2.3 最適標(biāo)記pH值和最適抗體量

由圖3-A可知，在pH值為8.5時(shí)納米金和Nb總蛋白抗體結(jié)合情況最佳。由圖3-B可知，500 μL納米金溶液中添加≥5 μL質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL的Nb抗體溶液后的趨勢(shì)無(wú)明顯變化，表明此時(shí)的抗體蛋白已經(jīng)足夠與AuNPs形成穩(wěn)定的復(fù)合物。

2.4 AuNPs探針活性及其特異性測(cè)定

由圖4可知，AuNPs探針檢測(cè)Nb總蛋白，混合1 h后，檢測(cè)溶液顏色出現(xiàn)明顯變化（由紅色變?yōu)樽仙? h后，檢測(cè)溶液顏色逐漸變?yōu)樗{(lán)色。當(dāng)加入BSA和BmN細(xì)胞蛋白時(shí)，檢測(cè)溶液顏色保持不變。只有檢測(cè)物為Nb蛋白時(shí)，檢測(cè)溶液中納米金才會(huì)聚集變色。

2.5 AuNPs比色法靈敏性測(cè)定

不同濃度的Nb蛋白樣品（100.0、20.0、2.0、0.5、0.1、0.05、0.0 μg/mL） 與納米金探針混合后，37 ℃下孵育2 h。由圖5可知，當(dāng)目標(biāo)檢測(cè)物濃度低于2 μg/mL時(shí)，檢測(cè)液顏色不會(huì)明顯改變，因此納米金探針檢測(cè)目標(biāo)物最低濃度為 2 μg/mL，即檢測(cè)量為10 ng。

3 討論與結(jié)論

在弱堿環(huán)境下，AuNPs帶負(fù)電荷，易與蛋白質(zhì)分子的正電荷基團(tuán)結(jié)合。由于這種靜電結(jié)合方式不會(huì)改變蛋白質(zhì)的生物活性，因而被廣泛應(yīng)用到生物檢測(cè)領(lǐng)域內(nèi)[14]。本試驗(yàn)利用檸檬酸三鈉還原法制備的AuNPs分散均勻，形狀規(guī)則，平均粒徑為20 nm，適合進(jìn)行標(biāo)記[14，22]。本試驗(yàn)確定的最佳標(biāo)記pH值為8.5，這與之前研究報(bào)道IgG標(biāo)記時(shí)，AuNPs所用pH值為8.5[14，22]相一致。 AuNPs溶液pH值會(huì)顯著影響納米金顆粒與抗體蛋白之間的結(jié)合。當(dāng)AuNPs溶液的pH值等于或略高于蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)呈中性，此時(shí)蛋白質(zhì)與AuNPs相互間靜電作用力最小，但蛋白質(zhì)分子表面張力卻最大，處于微水化狀態(tài)，易吸附在AuNPs表面，形成蛋白層，阻止AuNPs聚集，從而達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)[14，29]。

根據(jù)Li等研究報(bào)道，AuNPs比色法要求將抗體結(jié)合在AuNPs，根據(jù)抗原抗體特異性結(jié)合，使分散的AuNPs聚集，這表明至少需要2種探針才能確保在檢測(cè)單一目標(biāo)蛋白時(shí)AuNPs會(huì)聚集[21]。由于本試驗(yàn)所制備的Nb抗體能夠檢測(cè)出多種Nb蛋白，所以在AuNPs比色檢測(cè)Nb時(shí)就無(wú)須制備2種探針，大大降低檢測(cè)成本。之前文獻(xiàn)報(bào)道，膠體金免疫層析法用于檢測(cè)微孢子蟲(chóng)時(shí)會(huì)遇到檢測(cè)時(shí)部分微孢子蟲(chóng)沉附于樣品墊及結(jié)合墊表面，只有懸浮的微孢子到達(dá)檢測(cè)區(qū)[30]。納米金比色法避免以上問(wèn)題出現(xiàn)，因?yàn)榇朔椒z測(cè)樣品為可溶性蛋白，但是納米金比色法也存在Nb蛋白提取費(fèi)時(shí)、損耗問(wèn)題。本試驗(yàn)的AuNPs比色法能夠檢測(cè)出最低Nb蛋白量為10 ng，須要耗時(shí)2 h，這2項(xiàng)指標(biāo)與Li等的研究報(bào)道納米金比色法檢測(cè)β-酪蛋白的檢測(cè)所需要的最低蛋白量和檢測(cè)時(shí)間[21]有一定差距，可能是由于目標(biāo)檢測(cè)物不同及靶向蛋白提取時(shí)損耗等所致。本試驗(yàn)為AuNPs比色法在家蠶微孢子蟲(chóng)檢測(cè)中的應(yīng)用提供了理論基礎(chǔ)，但要在實(shí)際檢驗(yàn)工作中應(yīng)用，還須要進(jìn)一步優(yōu)化試驗(yàn)條件和試驗(yàn)方法。

試驗(yàn)所制備的AuNPs分散均勻，形狀規(guī)則，適合進(jìn)行標(biāo)記。Nb抗體與AuNPs（20 nm）結(jié)合最佳濃度為每500 μL AuNPs溶液中添加5 μL 0.5 mg/mL抗體蛋白，標(biāo)記最佳pH值為8.5。AuNPs比色法能夠最低檢測(cè)出Nb蛋白量為10 ng。

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