不同肉質(zhì)顏色蘿卜DFR基因表達差異分析

陳發(fā)波 高健 姚啟倫

摘要：為了探明DFR基因的表達量與蘿卜紅色素含量之間的關(guān)系，以16個色素含量不同的蘿卜品種為研究材料，測定肉質(zhì)根色素含量和DFR基因的表達量，并進行方差分析。結(jié)果表明，不同類型蘿卜品種間色素含量存在真實的差異，16個蘿卜品種間色素含量變幅在0.01‰～25.43‰，平均值為7.40‰。采用RT-PCR法定量分析DFR基因相對表達量，結(jié)果表明，DFR基因在16個品種蘿卜中的表達差異達到了極顯著水平，DFR基因表達量在0.077 9～6.639 3 之間，平均值為1.574 1。對16個蘿卜品種的DFR基因表達量與色素含量進行相關(guān)分析，結(jié)果表明，DFR基因相對表達量與色素含量之間的相關(guān)系數(shù)為0.89，達到了極顯著水平，說明DFR基因的表達量越高，蘿卜紅色素的含量越高。推測DFR基因可能是蘿卜紅色素合成的關(guān)鍵基因，可將其作為蘿卜或其他作物色素生產(chǎn)基因工程的候選基因。

關(guān)鍵詞：紅心蘿卜;紅色素;RT-PCR;DFR基因;表達量;方差分析

中圖分類號： S631.101? 文獻標志碼： A? 文章編號：1002-1302（2019）12-0182-04

紅心蘿卜別稱胭脂蘿卜，是十字花科蘿卜屬蘿卜種中的一個地方品種，在1979年蔬菜品種調(diào)查中確認為重慶涪陵特產(chǎn)[1]。紅心蘿卜具有心皮全紅、色澤鮮美的特點，用以制作泡菜、蘿卜干等，口感清脆。此外在紅心蘿卜中提取的紅色素不僅可以作為食品添加劑，還具有抗氧化、抗痛風等功效，其應(yīng)用前景廣闊。涪陵紅心蘿卜在涪陵及周邊區(qū)縣均有栽種，是非常具有地方特色的蔬菜品種。但由于人們長期以來的自繁自種及紅心蘿卜與其他蘿卜品種容易相互授粉，紅心蘿卜的一些優(yōu)良性狀已逐步退化，如紅心性狀普遍退化，亟待人們對其色素合成相關(guān)基因展開研究，以保護和利用這一特色農(nóng)業(yè)資源。目前人們對于涪陵紅心蘿卜的研究主要集中在新品種選育[1-3]、相關(guān)性狀關(guān)系[4-6]與蘿卜紅色素的提取工藝[7-8]等方面，而關(guān)于基因表達量與色素含量之間的關(guān)聯(lián)性分析報告較少。二氫黃酮醇-4-還原酶（DFR）是植物花青素合成途徑中的關(guān)鍵酶，它在不同植株間具有高度的同源性。DFR基因為保守基因[9-10]，其表達存在時空差異性[11]，并且受多種因素的限制，如GA、NaCl、光照和UV-A等[12-14]。盡管DFR基因的相關(guān)特性及其在色素合成過程中的重要作用已逐漸為人所知，但其在紅心蘿卜色素合成中的作用尚不清楚。本研究通過分析DFR基因在不同肉質(zhì)顏色蘿卜中的表達差異，探尋DFR基因與蘿卜肉質(zhì)根顏色形成的關(guān)系，從分子水平解析紅心蘿卜紅色素合成的機制，對改善紅心蘿卜優(yōu)良性狀、提高其利用價值具有重要意義，為通過基因工程手段提高紅心蘿卜的蘿卜紅色素含量提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

試驗選用16份來自長江師范學院的不同肉質(zhì)顏色蘿卜品種，材料編號及相關(guān)表型性狀見表1。

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗設(shè)計 于2015年9月至2016年1月在長江師范學院試驗地進行田間試驗，采用隨機區(qū)組設(shè)計，設(shè)置2次重復，每個品種種植3行，每行12株，行距50 cm，株距33 cm。2015年9月23日播種，2015年9月30日出苗，出苗后 100 d，進行色素含量測定和肉質(zhì)根總RNA的提取，每個處理取中間10株獲取數(shù)據(jù)資料。

1.2.2 蘿卜肉質(zhì)根色素含量的測定 16個不同肉質(zhì)顏色蘿卜品種肉質(zhì)根的色素含量依照呂發(fā)生等提出的方法[15]提取測定，其操作步驟如下：（1）稱取檸檬酸16.958 0 g、磷酸二氫鈉13.500 0 g配制成pH值為3.0的緩沖液1 000 mL，稱取蘿卜紅色素 0.205 2 g，加入95 %乙醇1 mL為標準品溶液。然后分別吸取標準品溶液1～13 mL并用緩沖液定容至 100 mL，在 520 nm 處測吸光度，繪制標準曲線。（2）將新鮮肉質(zhì)根清洗、擦干，切成小顆粒充分混勻，立即稱取鮮樣測定肉質(zhì)根含水量，余下部分用漿渣自動分離機獲取汁液，攪勻之后取8～10 mL汁液在離心機中以 4 000 r/min 離心5 min，離心完成后汲取1 mL上清液，用磷酸二氫鈉緩沖液定容到 100 mL，然后在分光光度計中檢測520 nm波長下的吸光度。（3）1 000 g新鮮肉質(zhì)根的蘿卜紅含量C鮮（‰）=v×y。其中，汁液容積v（mL）=1 000×肉質(zhì)根含水量（%）;汁液濃度y（g/mL）由標準曲線的回歸方程計算。

1.2.3 蘿卜肉質(zhì)根總RNA的提取 本次蘿卜肉質(zhì)根總RNA提取方法參照柱式植物總RNA抽提純化試劑盒（SK8661）提取，試劑盒組成成分（表2）及具體操作步驟如下。

首先按照試劑盒說明在GT溶液、NT溶液中加入相應(yīng)量的無水乙醇，混合均勻后在室溫下密封保存?zhèn)溆茫看问褂煤笞⒁鈱⑵可w旋緊，保持GT溶液、NT溶液中的乙醇含量（18 mL GT溶液中加入12 mL無水乙醇，36 mL GT溶液中加入24 mL無水乙醇;6 mL NT溶液中加入24 mL無水乙醇，12 mL NT溶液中加入48 mL無水乙醇）。最后在1.5 mL RNase-free的離心管加入450 μL Buffer Rlysis-PG后備用。

（1）取蘿卜肉質(zhì)根組織25～50 mg于研缽中，加入少許液氮迅速研磨成粉末，并將其全部轉(zhuǎn)移到1.5 mL離心管中，立刻振蕩將之混勻，在室溫中放置5 min后置于4 ℃離心機中以12 000 r/min離心3 min，將離心后的上清液轉(zhuǎn)移到 1.5 mL RNase-free離心管中，然后加入二分之一體積的無水乙醇，并充分混合均勻。（2）將吸附柱放入收集管中，用移液器將上述離心管中溶液全部加至吸附柱中，靜置1 min，在室溫下以12 000 r/min離心1 min后將收集管中的廢液倒掉;加入500 μL GT溶液，靜置1 min，在室溫下以10 000 r/min離心1 min后將收集管中的廢液倒掉;加入500 μL NT溶液，靜置1 min，在室溫下以10 000 r/min離心1 min后將收集管中的廢液倒掉。（3）將吸附柱放回收集管中，以12 000 r/min離心2 min后將吸附柱取出放入1.5 mL RNase-free離心管中，在吸附柱中間加入30～50 μL DEPC-treated ddH2O，靜置2 min后以12 000 r/min離心2 min，將最后得到的RNA溶液置于 -70 ℃ 冰箱中保存或留待后續(xù)試驗使用。

1.2.4 DFR引物設(shè)計 選用Primer 5軟件設(shè)計目的基因和內(nèi)參基因的上下引物堿基序列。依據(jù)美國國立生物信息網(wǎng)（NCBI）發(fā)布的DFR基因堿基序列，設(shè)計DFR基因的引物序列：DFR-F：5′-TCATCGGTTCATGGCTCGT-3′ 59.1，DFR-R：5′-CCGTTTATGGCGTCATCGTA-3′，擴增產(chǎn)物全長共184 bp;內(nèi)參基因（Actin）的引物序列：Actin-F：5′-TATGAGCAAAGAGATCACAGCACT-3′，Actin-R：5′-TGAGGGAAGCAAGAATGGAA-3′，擴增產(chǎn)物全長共113 bp。DFR基因引物和內(nèi)參基因（Actin）引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。

1.2.5 RNA反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA 使用第一鏈cDNA合成試劑盒合成第一鏈cDNA，操作流程如下：（1）將以下試劑加入0.2 mL PCR管中：總RNA 5 μL、0.2 μg/μL Random Primer p（dN）1 μL和Rnase-free ddH2O 5 μL;（2）70 ℃溫浴5 min;（3）冰浴10 s，將如下試劑加入離心后溶液中：10 U/μL AMV Reverse Transcriptase 2.0 μL、20 U/μL Rnase inhibitor 1.0 μL、10 mmol/L dNTP Mix 2.0 μL、5×Reaction Buffer 4.0 μL，總體積共20.0 μL;（4）37 ℃溫浴5 min;（5）42 ℃溫浴60 min;（6）70 ℃溫水浴10 min后立即終止反應(yīng);（7）將上述溶液-20 ℃保存或后續(xù)研究使用。

1.2.6 熒光定量PCR測定 將上述合成的cDNA樣品稀釋8倍作為模板上機檢測，然后配置反應(yīng)混合液（表3）和設(shè)置PCR循環(huán)條件（表4），完成上述步驟后，將反應(yīng)混合液加入96孔板后放在RT-PCR儀中開始擴增反應(yīng)。得到產(chǎn)物的擴增曲線與溶解曲線后，采用2-ΔΔCT法[16]計算DFR基因初始模板數(shù)量的相對表達量（以內(nèi)參基因Actin為標準）。

1.3 數(shù)據(jù)分析

用DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)對16種不同肉質(zhì)顏色蘿卜的DFR基因表達量（相對定量）和肉質(zhì)根色素含量進行方差分析，然后將DFR基因表達量與色素含量進行相關(guān)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同蘿卜品種色素含量分析

對16個蘿卜品種的色素含量進行方差分析，結(jié)果（表5）表明，不同類型蘿卜品種間色素含量存在真實差異。16個蘿卜品種的色素含量和多重比較結(jié)果見圖1。由圖1可知，16個蘿卜品種間色素含量變幅在0.01‰～25.43‰，平均值為 7.40‰。其中編號14蘿卜品種色素含量最高（25.43‰），編號3和編號4蘿卜紅色素含量最低（0.01‰）;編號14（25.43‰）、編號15（23.48‰）和編號16（22.58‰）蘿卜品種色素含量顯著高于其他種蘿卜品種;編號10、編號11、編號12和編號13蘿卜品種色素含量分別為10.58‰、8.68‰、7.26‰ 和8.34‰;編號8蘿卜品種色素含量為4.53‰;編號5、編號6、編號7和編號9蘿卜品種紅色素含量分別為 2.41‰、1.25‰、2.57‰和1.00‰;編號1、編號2、編號3和編號4蘿卜肉質(zhì)根品種幾乎不含蘿卜紅色素。

為進一步分析不同類型蘿卜肉質(zhì)根紅色素含量的變化情況，將16個品種的蘿卜按照皮和肉質(zhì)的顏色分為5個類型：白皮白心（編號1、編號2、編號3和編號4），紅皮白心（編號5、編號6和編號7），綠皮紅心（編號8），紅皮花心（編號9、編號10、編號11、編號13、編號15和編號16），紅皮紅心（編號12和編號14）。方差分析結(jié)果（表6）和多重比較結(jié)果（圖2）表明，5種不同肉質(zhì)顏色蘿卜間肉質(zhì)根紅色素含量存在極顯著差異，說明紅色素含量與肉質(zhì)顏色有關(guān)。由圖2可知，紅皮紅心蘿卜色素含量最高，為22.83‰，其次為紅皮花心蘿卜（7.172‰）、綠皮花心蘿卜（4.530‰）、紅皮白心蘿卜（2.077‰）和白皮白心蘿卜（0.065‰）。

2.2 不同蘿卜品種DFR基因表達量分析

以從蘿卜肉質(zhì)根提取的RNA反轉(zhuǎn)錄合成的第一鏈cDNA為模板，以內(nèi)參基因（Actin）為標準，采用RT-PCR擴增后得到溶解曲線和擴增曲線， 采用2-ΔΔCT法計算16個品種

蘿卜的DFR基因表達量（相對定量），并對其進行方差分析（表7）。結(jié)果表明，DFR基因在16個品種蘿卜中的表達差異達到了極顯著差異水平。由圖3可知，編號16蘿卜品種的DFR基因表達量最高，達到6.639 3，編號1、編號2、編號3、編號4、編號5、編號6、編號7、編號8、編號9、編號10、編號12和編號13蘿卜品種DFR基因表達量變幅為0.077 9～1.059，編號11、編號14和編號15蘿卜品種的表達量分別為3.049 0、5.309 7和4.222 1。

方差分析結(jié)果（表8）表明，5種不同肉質(zhì)顏色蘿卜品種間DFR基因相對表達量存在極顯著差異。由圖4可知，紅皮紅心蘿卜的DFR基因表達量最高，為5.390 4，紅皮花心蘿卜基因表達量為1.198 5，白皮白心蘿卜的相對定量最低，為 0.091 4，而紅皮白心蘿卜和綠皮紅心蘿卜DFR基因表達量分別為0.674 6和0.632 9。

2.3 不同蘿卜品種DFR基因表達量與蘿卜紅色素含量相關(guān)分析

為了探明DFR基因表達量與蘿卜肉質(zhì)根紅色素含量的關(guān)系，采用DPS數(shù)據(jù)處理軟件對16個蘿卜品種的DFR基因表 達量和蘿卜肉質(zhì)根色素含量進行相關(guān)分析。結(jié)果表明，DFR基因表達量與紅色素含量之間的相關(guān)系數(shù)為0.89，達到了極顯著水平，說明DFR基因的表達量越高，紅色素的含量越高。

3 結(jié)論與討論

已有研究表明，DFR是植物花色素苷合成途徑中的關(guān)鍵酶，大量學者在矮牽牛、金魚草、擬南芥、三葉草、蘭花、非洲菊等多種作物方面進行了研究[13]，但是關(guān)于涪陵紅心蘿卜方面的研究卻鮮有報道，僅有孫玉燕等研究了DFR基因在白肉蘿卜與紅肉蘿卜在不同發(fā)育階段的表達模式[17]，卻未對DFR基因與紅心蘿卜色素含量進行相關(guān)分析，而弄清DFR基因的表達量與蘿卜紅色素含量之間的關(guān)聯(lián)將有利于更好地改善紅心蘿卜色素含量。本研究中，DFR基因的相對定量與肉質(zhì)根紅色素含量之間的相關(guān)系數(shù)為0.89，達到了極顯著水平，說明DFR基因的表達量越高，紅色素的含量越高，DFR基因可能是紅色素合成過程中的關(guān)鍵基因。這與文樵夫等的研究結(jié)果[18]類似，他們的研究結(jié)果表明海棠葉片的DFR基因表達量與葉色密切相關(guān)，葉色越紅的海棠，其葉片中花色素苷含量和DFR基因的表達量相對較高。此外馬春雷等發(fā)現(xiàn)不同茶樹品種中總兒茶素含量隨著LAR和DFR基因表達量增加而增加，而其他基因的表達量多少則與總兒茶素含量變化無關(guān)，因此推斷出DFR基因可能是茶樹黃酮類代謝過程中的重要基因[19]。以上研究結(jié)果表明，DFR基因的表達量與色素積累關(guān)系密切，在色素合成過程中發(fā)揮著重要作用。DFR基因在花色苷合成途徑中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，許多學者將DFR基因作為候選基因，從分子水平上改善植物的色素含量，并且已經(jīng)取得了一定的成效。宋峰將毛白楊DFR基因轉(zhuǎn)入煙草中，發(fā)現(xiàn)外源DFR基因能夠改變煙草花瓣的顏色[20]。許志茹等研究發(fā)現(xiàn)，使煙草DFR基因過量表達后，花色能夠明顯加深，而將蕪菁的DFR基因RNAi載體遺傳轉(zhuǎn)化煙草后觀察到花色變淺[13]。由此，筆者認為在今后紅心蘿卜紅色素含量育種中，可以將DFR作為蘿卜基因工程育種的候選基因。

在植物色素合成通路中有許多基因都會影響色素的積累，如CHI、CHS和ANS等，然而本研究只對紅心蘿卜肉質(zhì)根成色過程中的1個基因DFR進行了初步的分析，今后有待于進一步地深入開展紅心蘿卜色素合成分子機理研究。

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