改良的QuEChERS/UPLC法測(cè)定魚組織中磺胺甲唑、乙?；前芳走蚺c甲氧芐啶

劉永濤，韓 剛，宋金龍，董 靖，胥 寧，楊移斌，楊秋紅，艾曉輝*

(1.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院 長(zhǎng)江水產(chǎn)研究所，湖北 武漢 430223；2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部水產(chǎn)品質(zhì)量安全控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100141;3.湖北省水產(chǎn)品質(zhì)量安全工程技術(shù)研究中心，湖北 武漢 430223)

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

Waters Acquity UPLC超高效液相色譜帶紫外檢測(cè)器(TUV,美國(guó)Waters公司)；Mettler-Toledo AE-240電子天平(瑞士梅特勒-托利多公司)；Hitachi 20PR-520型自動(dòng)高速冷凍離心機(jī)(日本日立公司)；FS-1高速勻漿機(jī)(華普達(dá)教學(xué)儀器有限公司)；調(diào)速混勻器(上?？等A生化儀器制造廠)；HGC-12氮吹儀(Hengao T&D公司)。

50 mmol/L磷酸鹽緩沖溶液(pH 7.0)：稱取磷酸二氫鈉3.12 g溶于蒸餾水，定容至100 mL(A液)；稱取磷酸氫二鈉7.17 g溶于蒸餾水，定容至100 mL(B液)。量取39 mL A液和61 mL B液混合，定容至400 mL，即得。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 魚組織的預(yù)處理魚取血后，有磷魚去除鱗片，取自然比例的帶皮肌肉、肝臟、腎臟和鰓等組織，無鱗魚直接取自然比例的帶皮肌肉、肝臟、腎臟和鰓等組織。血液樣品以3 500 r/min離心5 min后，取血漿置于離心管中，于-18 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?；其它樣品均質(zhì)后，于-18 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 魚血漿樣品的處理采用液-液萃取法進(jìn)行血漿樣品的前處理：取血漿樣品在室溫下自然解凍，準(zhǔn)確量取1 mL血漿置于10 mL離心管中。加入1 mL 50 mmol/L磷酸鹽緩沖溶液(pH 7.0)，渦旋振蕩30 s，再加入5 mL乙酸乙酯，渦旋振蕩30 s，8 000 r/min離心5 min，取上層乙酸乙酯層置于另一10 mL離心管中。向殘?jiān)屑尤? mL乙酸乙酯重復(fù)提取1次，合并提取液于另一10 mL離心管中，置45 ℃氮吹儀上氮吹至干，加入1 mL初始流動(dòng)相溶解殘?jiān)瑴u旋振蕩30 s，10 000 r/min離心5 min，液體過0.22 μm針式尼龍濾頭后，進(jìn)行UPLC測(cè)定。

1.2.3 自然比例帶皮肌肉、肝臟、腎臟和腮組織樣品的處理采用改良的QuEChERS方法進(jìn)行樣品前處理：將自然比例帶皮肌肉、肝臟、腎臟和腮組織樣品在室溫下自然解凍，分別稱取上述樣品2.0 g置于15 mL離心管中，加入6 mL乙腈，渦旋振蕩混勻30 s，超聲提取1 min，再加入2 g無水硫酸鎂，渦旋振蕩30 s，8 000 r/min離心5 min，取上清液置于另一15 mL離心管中。向殘?jiān)屑尤? mL乙腈重復(fù)提取1次，合并提取液于15 mL離心管中，在該離心管中加入500 mg無水硫酸鎂和100 mg C18粉渦旋振蕩30 s，5 000 r/min離心5 min，將乙腈層轉(zhuǎn)移至15 mL離心管中，置50 ℃氮吹儀上氮吹至干，加入2 mL初始流動(dòng)相溶解殘?jiān)?，渦旋振蕩30 s，10 000 r/min離心5 min，下層液體過0.22 μm針式尼龍濾頭后，進(jìn)行UPLC測(cè)定。

1.2.5 色譜條件色譜柱：Acquity UPLC?BEH C18(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)；柱溫：30 ℃；流速：0.3 mL/min；進(jìn)樣量：5 μL；紫外檢測(cè)波長(zhǎng)：270 nm，數(shù)據(jù)模式：吸光度-基線中值濾波(MBF)模式；流動(dòng)相：A為甲醇，B為0.1%乙酸水溶液。梯度洗脫程序：0.0～1.0 min，15%A；1.0～2.0 min，15%～25%A；2.0～3.0 min，25%～35%A；3.0～7.0 min，35%A；7.0～8.0 min，35%～15%A；8.0～9.0 min，15%A。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的優(yōu)化

圖1 0.1 mg/L標(biāo)準(zhǔn)溶液(A)與50 μg/kg斑點(diǎn)叉尾鮰自然比例帶皮肌肉空白加標(biāo)(B)的色譜圖Fig.1 Chromatograms of 0.1 mg/L standard solution(A) and 50 μg/kg spiked channel catfish muscle and skin in natural proportions(B)

2.2 樣品前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

2.2.2 帶皮肌肉、肝臟、腎臟、鰓樣品前處理?xiàng)l件的優(yōu)化對(duì)于魚的帶皮肌肉、肝臟、腎臟等樣品，干擾測(cè)定的主要成分為脂肪和蛋白質(zhì)等物質(zhì)。分別考察了甲醇、乙腈和乙酸乙酯作為提取劑的效果，發(fā)現(xiàn)甲醇作為提取劑時(shí)提取液很難揮干。乙酸乙酯作為提取劑時(shí)，提取液中脂肪濃度高，增加了凈化難度。而乙腈因?qū)χ镜奶崛÷实?，且可以沉淀蛋白被推薦作為提取劑[19]。本實(shí)驗(yàn)最終選擇乙腈作為帶皮肌肉、肝臟、腎臟、鰓樣品的提取劑。

圖2 組合凈化劑的用量對(duì)目標(biāo)物回收率的影響Fig.2 Effect of combined clean-up reagent amount on the recoveries of target compounds

QuEChERS方法的常用凈化劑有無水硫酸鎂、C18粉和N-丙基乙二胺(PSA)。其中，無水硫酸鎂可除去樣品中的水分和沉淀部分蛋白；C18粉可吸附溶液中弱極性的脂肪、多環(huán)芳烴等干擾物；PSA主要用于去除糖類、脂肪酸等極性干擾物，但其對(duì)磺胺類藥物有明顯吸附[20]。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇無水硫酸鎂作為除水和蛋白沉淀劑，無水硫酸鎂+C18粉作為凈化劑，除去提取液中的水分和脂肪。以自然比例帶皮肌肉組織中加標(biāo)0.5 mg/kg的回收率作為指標(biāo)，對(duì)無水硫酸鎂(200、500、900 mg)和C18粉用量(50、100、150 mg)進(jìn)行了優(yōu)化。由圖2可知，以500 mg無水硫酸鎂+100 mg C18粉為凈化劑時(shí)的效果最佳，因此選其作為帶皮肌肉、肝臟、腎臟、鰓樣品的凈化劑。

2.2.3 定容溶液的選擇分別采用乙腈-甲醇-2%乙酸水溶液(5∶10∶85，體積比)[21-22]和初始流動(dòng)相甲醇-0.1%乙酸水溶液(15∶85,體積比)作為樣品殘?jiān)亩ㄈ萑芤?，樣品定容后過0.22 μm針式尼頭濾頭進(jìn)行UPLC分析。結(jié)果表明，以前者為定容溶液時(shí)，定容液中的雜質(zhì)對(duì)TMP的定量造成干擾。而以甲醇-0.1%乙酸水溶液(15∶85)為定容溶液時(shí)，3種分析物的峰形對(duì)稱且無干擾峰(見圖1B)。因此，最終選擇甲醇-0.1%乙酸水溶液(15∶85)為定容溶液。

2.3 方法的線性關(guān)系

2.4 回收率、相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差、檢出限與定量下限

分別在5種魚組織空白樣品中添加5個(gè)濃度水平的3種目標(biāo)物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行回收率實(shí)驗(yàn)，每個(gè)加標(biāo)濃度做6個(gè)平行，結(jié)果見表1。由表1可知，3種目標(biāo)物的平均回收率為68.2%～97.3%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為1.7%～13%。采用本方法測(cè)定加標(biāo)樣品，分別以大于3倍和10倍信噪比計(jì)算方法檢出限和定量下限，結(jié)果顯示，3種目標(biāo)物在5種魚組織中的檢出限均為25 μg/kg，定量下限均為50 μg/kg。參照歐盟對(duì)磺胺類藥物和甲氧芐啶在自然比例的帶皮魚肌肉中的最高殘留限量100 μg/kg和50 μg/kg[12]，本方法的檢出限和定量下限均滿足檢測(cè)要求。

表1 魚組織中磺胺甲唑、乙?；前芳走蚝图籽跗S啶的回收率與相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)Table 1 Recoveries and relative standard deviations(RSD)of SMZ,N-ac-SMZ and TMP in fortified fish tissue samples(n=6)

*standard deviation

2.5 方法應(yīng)用

3 結(jié) 論