何敏, 彭桉平, 徐寧, 吳煒霖, 王云秀, 何曉紅, 黃憲章, 柯培鋒△
廣東省中醫(yī)院 1檢驗醫(yī)學(xué)部, 2風(fēng)濕科(廣東廣州 510120)
髓源性抑制細(xì)胞(myeloid-derived suppressor cells,MDSCs)是一群異質(zhì)性的、具有免疫調(diào)控功能的細(xì)胞群體。在腫瘤研究領(lǐng)域,因MDSCs有抑制功能可引起腫瘤逃逸而被廣泛研究[1-2]。近年來MDSCs的研究逐步拓展到自身免疫疾病領(lǐng)域。在多種自身免疫性疾病的動物模型中發(fā)現(xiàn)MDSCs大量聚集,并參與炎癥免疫應(yīng)答,其作用逐步得到重視。有意思的是不同于腫瘤相關(guān)的MDSCs,多項研究認(rèn)為自身免疫疾病相關(guān)MDSCs有促炎作用,可促進(jìn)疾病的發(fā)展[3]。這些結(jié)果表明MDSCs的功能會受到免疫微環(huán)境的影響而發(fā)生改變,是一群可塑性很強的免疫細(xì)胞,在細(xì)胞免疫治療中有可能發(fā)揮重要的作用。雷公藤在臨床上廣泛應(yīng)用于抗炎、抗免疫排斥及自身免疫病的治療,具有抗炎和免疫調(diào)控雙重功效。雷公藤內(nèi)酯醇(triptolide,TPT)是雷公藤的主要活性單體,研究表明TPT對多種免疫細(xì)胞,如單核/巨噬細(xì)胞、Th17細(xì)胞等都具有重要的調(diào)控作用,然而TPT能否調(diào)控MDSCs的分化和功能尚鮮見報道。本研究采用流式細(xì)胞術(shù)檢測了類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis,RA)患者循環(huán)MDSCs的比例,分析其與疾病活動度的相關(guān)性;進(jìn)而觀察TPT對RA患者中MDSCs比例和MDSCs分泌的主要產(chǎn)物關(guān)鍵功能因子精氨酸酶-1(arginase-1,Arg-1)的影響,為TPT抗RA治療提供新的視角和實驗依據(jù)。
1.1 材料
1.1.1 主要試劑和藥物 淋巴細(xì)胞分離液購自Axis-Shild PoCAS公司;細(xì)胞培養(yǎng)試劑和TRIzol購自Invitrogen公司;二甲基亞砜(DMSO)購自Ameresco公司;粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)購自R&D systmen;抗人CD33、HLA-DR和CD11b等流式抗體購自BD Bioscience公司;逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Fermentas公司;熒光定量PCR試劑盒購自Promega公司;引物由Takara公司合成;鼠抗人Arg-1抗體購自Cell Signaling Technology公司;兔抗人GAPDH抗體購自Abcam公司;TPT(純度為99.78%)購自Sigma。TPT用DMSO溶解,使用前用細(xì)胞培養(yǎng)液稀釋至工作濃度,DMSO的終濃度低于0.01%。
1.1.2 研究對象 選擇2018年1—6月于廣東省中醫(yī)院就診的RA患者25例(RA患者組)。其中,男7例,女18例,年齡21~73歲,平均(50.84±14.51)歲。根據(jù)腫脹關(guān)節(jié)數(shù)、壓痛關(guān)節(jié)數(shù)、C反應(yīng)蛋白、紅細(xì)胞沉降率等臨床檢測指標(biāo),計算DAS28評分,分為兩組:活動組(n=15)和穩(wěn)定組(n=10)。RA的診斷符合2010年美國風(fēng)濕病學(xué)會/歐洲抗風(fēng)濕聯(lián)盟推薦的RA分類標(biāo)準(zhǔn),所有患者近半年均未使用免疫調(diào)節(jié)藥物。另選15名健康志愿者作為健康對照組,男5例,女10例,年齡21~69歲,平均(43.47±13.86)歲,無腫瘤及自身免疫疾病病史。本研究通過廣東省中醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理學(xué)委員會批準(zhǔn),所有患者和志愿者均已簽署知情同意書。
1.2 方法
1.2.1 外周血單個核細(xì)胞(PBMC)的分離和培養(yǎng) 收集RA患者和健康人外周靜脈血,乙二胺四乙酸(EDTA)鈉鹽抗凝。采用淋巴細(xì)胞分離液通過密度梯度離心法分離出PBMC。加入含10%人胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液培養(yǎng)。分別加入0、1、5、10 nmol/L的TPT,48 h以后流式細(xì)胞術(shù)檢測MDSCs占單個核細(xì)胞的比例。
1.2.2 MDSCs的分離與培養(yǎng) PBMC用流式細(xì)胞分選(fluorescence activated cell sorting,F(xiàn)ACS)洗液50 μL重懸,加入CD11b和CD33抗體10 μL/106細(xì)胞,4℃避光孵育30 min,洗滌2次,重懸于FACS液中。采用貝克曼庫爾特MofloAstrios EQ流式細(xì)胞分選儀,分選CD33+CD11b+細(xì)胞,收集于RPMI RPMI-1640培養(yǎng)基中。
分選后的MDSCs于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng),mTesR-1細(xì)胞培養(yǎng)基加入GM-CSF (20 ng/mL)培養(yǎng),根據(jù)實驗情況分別加入0、1、5、10 nmol/L的TPT干預(yù),48 h后收集細(xì)胞,分別提取RNA和蛋白用于檢測Arg-1的mRNA和蛋白表達(dá)水平。
1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測MDSCs細(xì)胞比例 細(xì)胞表面染色按照常規(guī)染色方法進(jìn)行操作。收集各組細(xì)胞,制備100 μL細(xì)胞懸液,加入抗人PE-CD11b抗體,抗人FITC-CD33抗體,抗人APC-HLA-DR抗體進(jìn)行染色,4℃避光孵育30 min,洗滌2次,重懸后采用BD Canto Ⅱ流式細(xì)胞儀檢測,F(xiàn)ACS Diva7.0軟件分析流式檢測結(jié)果。
1.2.4 qRT-PCR檢測Arg-1 mRNA表達(dá)水平 按照TRIzol試劑說明書操作提取細(xì)胞總RNA,用微量核酸定量儀Nanodrop2000c測定RNA和純度和濃度,提取后的RNA置于-80℃冰箱中保存。取1 μg RNA于42℃逆轉(zhuǎn)錄,以GAPDH為內(nèi)源對照,進(jìn)行熒光定量PCR,檢測Arg-1的mRNA表達(dá)水平。PCR程序為95℃預(yù)變性10 min,95℃10 s,60℃ 30,擴(kuò)增40個循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后確認(rèn)定量PCR的擴(kuò)增曲線和熔解曲線,結(jié)果以目的基因與相應(yīng)的GAPDH比值表示。引物序列如下:Arg-1:上游引物:5′- CTGGCAAGGTGGCAGAAGTC-3′,下游引物:5′- ATGGCCAGAGATGCTTCCAA-3′;GAPDH 上游引物:5′-TGTTCGTCATGGGTGTGAACCA-3′, 下游引物:5′-GTCATGAGTCCTTCCACGATACCA-3′。
1.2.5 Western blot檢測Arg-1蛋白 Western blot檢測Arg-1蛋白水平的變化:MDSCs經(jīng)不同濃度的TPT作用48 h后,收集各組細(xì)胞,加入蛋白抽提裂解液抽提細(xì)胞總蛋白,冰浴15 min,離心收集細(xì)胞總蛋白。蛋白提取物經(jīng)考馬斯亮藍(lán)法定量后,30 μg上樣至8%的SDS-聚丙烯酰胺凝膠,電泳,常規(guī)轉(zhuǎn)膜;后者經(jīng)5%脫脂奶粉封閉后,分別與1∶1 000稀釋度的相應(yīng)一抗(抗Arg-1抗體、抗GAPDH抗體)和適宜稀釋度的二抗(羊抗鼠/兔Ig-HRP)孵育1 h,PBST洗膜。最后用ECL顯色系統(tǒng)顯色,顯影和定影。
2.1 RA患者外周血MDSCs的頻率升高 流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示:RA患者組與健康對照組外周血MDSCs(CD11b+HLA-DR-CD33+)比例差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)?;顒咏MMDSCs占PBMC比例為(5.32±2.49)%,明顯高于穩(wěn)定組(2.33±1.26)%和健康對照組(1.78±0.68)%,見圖1。
2.2 RA患者外周血中Arg-1的表達(dá)水平升高 RA患者組的Arg-1較健康對照組明顯升高,且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),見圖2。
2.3 TPT下調(diào)RA患者外周血中MDSCs水平 TPT從5 nmol/L濃度開始就能夠下調(diào)MDSCs的細(xì)胞水平(P<0.05)。且隨濃度升高,抑制作用增強,見圖3。
2.4 TPT抑制MDSCs Arg-1的表達(dá) TPT能夠呈劑量依賴性地下調(diào)RA患者M(jìn)DSCs中Arg-1的mRNA和蛋白表達(dá)水平,見圖4。
RA是一種慢性、進(jìn)行性的自身免疫疾病,其發(fā)病率和致殘率高,嚴(yán)重危害人類健康。雖然發(fā)病機制尚未明確,研究表明免疫異常致使機體自身耐受破壞在RA發(fā)病過程中起著關(guān)鍵作用。MDSCs是一群來自于骨髓的非成熟細(xì)胞,最早于1987年在荷瘤小鼠中發(fā)現(xiàn),在腫瘤發(fā)生時發(fā)生大量聚集、擴(kuò)增,并可以抑制腫瘤免疫逃逸。近年來在自身免疫性疾病中的作用被重新認(rèn)識,認(rèn)為其有可能參與了自身免疫病的病理進(jìn)程(Ref)。Yi等[4]從實驗性自身免疫性腦脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE)動物模型發(fā)現(xiàn),雖然分離出的MDSC能抑制T細(xì)胞增殖,但卻可以在IL-6和TGF-β協(xié)同作用下促進(jìn)Th17細(xì)胞分化,用吉他西濱選擇性剔除MDSCs后Th17細(xì)胞減少。King等[5]的結(jié)果也表明內(nèi)源性的MDSCs并不能抑制自身免疫性疾病的進(jìn)展,甚至?xí)又夭∏?。盡管不同研究得出的結(jié)論可能與所關(guān)注的細(xì)胞亞群和所處的炎癥環(huán)境不同有關(guān),但是這些結(jié)果提示MDSCs有可能是一把“雙刃劍”,其功能會受到環(huán)境的影響,在不同疾病中發(fā)揮促炎或者抑炎的功能。
A:流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果;B:各組MDSCs占PBMC比例;*P<0.05
*P<0.05
*與0 nmol/L比較P<0.05
A:Arg-1 mRNA; B:Arg-1蛋白;*P<0.01
MDSCs的募集、擴(kuò)增和活化是其發(fā)揮免疫抑制功能的必要條件。為了探討MDSCs與RA之間的相互關(guān)系,我們首先用流式細(xì)胞術(shù)檢測了RA患者外周血中的MDSCs(CD33+CD11b+HLA-DR-)比例,發(fā)現(xiàn)RA患者活動期外周血MDSCs細(xì)胞比例不僅明顯高于健康對照組,而且高于疾病非活動組,這與Guo等[6]的結(jié)果一致,提示MDSCs有可能參與了RA的發(fā)病機制。體外實驗進(jìn)一步表明5 nmol/L 濃度的TPT即可下調(diào)MDSCs的比例,且呈現(xiàn)劑量依賴性。MDSCs有望成為TPT抗RA免疫治療的靶點。
MDSCs可以通過多種機制發(fā)揮其免疫調(diào)控作用,其中最直接的效應(yīng)是調(diào)節(jié)L-精氨酸代謝。MDSCs可以通過表達(dá)高水平的Arg-1,催化L-精氨酸代謝為L-鳥氨酸和尿素,從而大量消耗環(huán)境中的L-精氨酸,影響T細(xì)胞的增殖和活化[7]。與正常對照組相比,RA患者PBMC中的Arg-1表達(dá)水平明顯升高,約為對照組的2.5倍,其變化趨勢與外周血中的MDSCs比例一致。這些結(jié)果提示,在RA患者體內(nèi),Arg-1是MDSCs一個非常重要的效應(yīng)分子。
接下來我們應(yīng)用流式細(xì)胞儀分選純化MDSCs,并評價TPT對Arg-1表達(dá)的影響。結(jié)果表明:TPT能夠呈劑量依賴性的抑制Arg-1 mRNA和蛋白的表達(dá)(圖4)。盡管Arg-1在抑制T細(xì)胞增殖等方面有調(diào)控作用[8],新近文獻(xiàn)表明MDSCs及其產(chǎn)生的Arg-1中在自身免疫性疾病有可能有致病性。Wu等[9]在SLE患者和人源化小鼠中發(fā)現(xiàn),MDSCs通過Arg-1通路,促進(jìn)Th17細(xì)胞的分化。在小鼠MS模型中,加入Arg-1的抑制劑NOHA能夠緩解疾病[10]。但是TPT能否通過調(diào)控MDSCs的Arg-1通路,進(jìn)而影響Th17等細(xì)胞的分化,還有待更進(jìn)一步的研究。
綜上所述,本研究發(fā)現(xiàn)RA患者循環(huán)MDSCs比例升高,且表達(dá)功能分子Arg-1。加入TPT干預(yù)以后,可以有效抑制Arg-1的mRNA和蛋白水平,表明TPT不僅能調(diào)控MDSCs的分化,還能改變它的功能。這些結(jié)果提示MDSCs有可能是TPT作用的靶細(xì)胞,基于MDSCs和Arg-1的免疫有望成為RA等自身免疫性疾病的治療策略。