化學(xué)發(fā)光法聯(lián)合定量PCR用于嬰幼兒巨細(xì)胞病毒感染合并肺炎的診斷價值*

賴金甜， 李相新， 鄭芬， 黃振強(qiáng)， 譚汝宏

佛山市婦幼保健院檢驗(yàn)科(廣東佛山 528000)

人巨細(xì)胞病毒(HCMV)是一種皰疹病毒科β亞科的具有雙螺旋結(jié)構(gòu)的DNA病毒[1]，基因結(jié)構(gòu)復(fù)雜，堿基長度較長，屬于條件致病病毒，主要易發(fā)生在免疫功能低下的機(jī)體中，特別是身體機(jī)能正在發(fā)育和免疫力低下的嬰幼兒，并且容易繼發(fā)細(xì)菌或真菌的感染，大大增加了治療的難度，導(dǎo)致嬰幼兒的死亡率大大提高，嚴(yán)重威脅嬰幼兒患者的生命健康[2]。由于巨細(xì)胞病毒(CMV)具有組織和細(xì)胞的泛嗜性，因此在臨床上的表現(xiàn)各異，主要會引發(fā)泌尿生殖系統(tǒng)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)和肝臟、血液循環(huán)系統(tǒng)等并發(fā)癥，其中以并發(fā)肺炎最為常見[3]。我國是CMV感染的高發(fā)區(qū)域，有研究[4-5]發(fā)現(xiàn)在我國健康人群IgG抗體檢測中，CMV的陽性感染率高于70%，而孕產(chǎn)婦CMV的感染率更是高達(dá)90%，同時，3歲以下嬰幼兒的感染率也是高達(dá)80%，若嬰幼兒CMV合并肺炎患者無法得到及時準(zhǔn)確的診斷和治療，則會導(dǎo)致病程發(fā)展迅速，病情兇險，危及生命，因此，尋找臨床上的一種快速準(zhǔn)確的檢驗(yàn)方法對檢測嬰幼兒CMV感染并及時采取救治，具有非常重要的臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2016年10月到2018年8月在我院接受治療的嬰幼兒CMV合并肺炎感染的患兒89例，年齡為3個月至3歲，平均(2.1±0.2)歲，其中男童48例，女童41例；同時選擇在我院體檢的健康嬰幼兒83例作為健康對照組，男童43例，女童40例，年齡為0～3歲，平均(2.2±0.1)歲。診斷標(biāo)準(zhǔn)：(1)發(fā)熱并且持續(xù)3 d以上體溫>38℃；(2)呼吸困難、唇面紫紺、無痰性咳嗽、胸悶等；(3)胸片有間質(zhì)性肺炎表現(xiàn)；(4)關(guān)節(jié)痛；(5)胃腸道潰瘍、出血等；(6)具備以上臨床表現(xiàn)，排除其他微生物或病原體感染。經(jīng)檢驗(yàn)CMV-IgM和(或)CMV-DNA陽性者可診斷為CMV合并肺炎患兒。兩組患者在年齡和性別差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。本研究已獲得我院倫理委員會批準(zhǔn)，所有納入研究的嬰幼兒均獲得其監(jiān)護(hù)人的同意并簽署知情同意書。

1.2 樣本收集 抽取空腹受試者的靜脈血2 mL，室溫靜置1 h后，以2 500 r/min的轉(zhuǎn)速離心20 min，分離血清進(jìn)行檢測。

1.3 檢測方法 化學(xué)發(fā)光法：通過羅氏Cobase601電化學(xué)發(fā)光分析儀及其原裝試劑，嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行操作，其中IgM檢測結(jié)果以Index>0.50為陽性感染。熒光定量PCR法：采用ABI 7500型實(shí)時熒光定量PCR儀和中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司的試劑盒檢測CMV-DNA，其中以CMV-DNA≥1×103拷貝/mL為陽性。同時，利用ELISA試劑盒(均來自武漢華美生物基因工程有限公司)檢測血清中IFN-γ、IL-4和IL-6的表達(dá)含量，輔助對CMV合并肺炎嬰幼兒患者的檢測。

2 結(jié)果

2.1 CMV-DNA和CMV-IgM檢測結(jié)果 在89例CMV陽性嬰幼兒患者中，血清CMV-IgM陽性的有77例，血清中CMV-DNA陽性的有81例，雙陽性的有73例，雙陰性的有4例，血清中CMV-DNA陽性而CMV-IgM陰性的有8例，而血清中CMV-IgM陽性而CMV-DNA陰性的有4例。

2.2 兩組血清中IFN-γ、IL-4和IL-6的含量比較 CMV合并肺炎陽性患兒血清中IFN-γ的含量明顯高于健康對照組，而血清中IL-4和IL-6的含量明顯低于健康對照組，其組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 兩組患者血清中IFN-γ、IL-4和IL-6的含量比較

組別例數(shù)IFN-γIL-4IL-6CMV患兒8986.96±7.29*28.49±6.61*34.62±6.53*健康對照組8321.27±4.7658.39±10.0379.47±9.11

*與健康對照組比較P<0.05

2.3 早期診斷分析 多種方法聯(lián)合檢測CMV感染合并肺炎的敏感度為95.5%，特異度為91.6%，準(zhǔn)確率為96.2%。見表2和圖1。

表2 兩組患者血清中CMV-DNA聯(lián)合IFN-γ、IL-4和IL-6的早期診斷分析 %

圖1 多種方法聯(lián)合檢測嬰幼兒CMV感染合并肺炎的早期診斷ROC曲線分析

3 討論

CMV感染在大多數(shù)人一生的不同時期都可能會發(fā)生，與性別、年齡、生活環(huán)境、社會因素和經(jīng)濟(jì)條件等多種因素都有一定的相關(guān)性[6-7]。作為免疫力低下的群體代表之一，嬰幼兒是最容易受到CMV感染的，且CMV感染的同時，往往會影響到消化、呼吸、血液系統(tǒng)等，從而導(dǎo)致嬰幼兒營養(yǎng)不良、肺炎、肝功能損害、腎臟損害和血液系統(tǒng)疾病等，并且對器官造成不可逆的損傷，大大提高了病死率，威脅著患兒的生命健康[8]。研究顯示，0～1周歲嬰兒CMV陽性感染率高達(dá)80%，一旦機(jī)體免疫功能低下，就可以直接誘發(fā)巨細(xì)胞病毒的活化，引起活動性感染，其中在嬰幼兒患者中，最為常見的就是CMV合并肺炎[4]。由于對CMV肺炎早期缺乏特異性的檢測指標(biāo)，很容易會導(dǎo)致誤診，致使病情延誤；同時，由于CMV具有泛嗜性，可以在免疫力低下的患者中引起多個器官的病變，且臨床表現(xiàn)各異[4]，無法進(jìn)行有效的鑒別診斷，嚴(yán)重影響了嬰幼兒患者得到及時有效的救治，危害了嬰幼兒患者的健康安全[9]。因此，尋找一種更為快速準(zhǔn)確的早期檢測手段和檢測指標(biāo)成為了臨床研究的熱點(diǎn)。

當(dāng)機(jī)體感染CMV后，就會出現(xiàn)特異性的IgM、IgG、IgE、IgA等抗體，其中，當(dāng)CMV潛伏期感染10 d后即可在血清中檢測出特異性IgM抗體，而6周左右其抗體水平即可達(dá)到峰值，12～16周時，抗體消失[4]。因此，血清中IgM、IgG抗體的檢測結(jié)果呈現(xiàn)陽性，可以間接表示機(jī)體出現(xiàn)了CMV感染，或潛伏的CMV感染被活化或近期發(fā)生了CMV活動性感染，可見IgM、IgG是鑒別診斷CMV活動性感染的重要指標(biāo)[10]。目前，主要通過實(shí)驗(yàn)室病毒培養(yǎng)及病理鑒定HCMV感染作為主要的診斷方法和標(biāo)準(zhǔn)，但這種方法主要是觀察細(xì)胞病理學(xué)變化，檢測周期較長，無法實(shí)現(xiàn)臨床的快速檢測，而臨床上多采用ELISA法、化學(xué)發(fā)光法、膠體金法和熒光定量PCR法進(jìn)行檢測[11-13]?；瘜W(xué)發(fā)光法是一種分子發(fā)光光譜分析法，主要利用儀器對體系化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度的檢測，從而確定待測物含量的一種痕量分析方法，可以對IgM、IgG抗體水平進(jìn)行定量檢測，而且整個過程均由儀器完成，極大程度地避免了操作者、環(huán)境等外界因素對檢測過程和結(jié)果判斷的誤差，對于IgM、IgG抗體陽性的檢出率、敏感度、特異度均明顯優(yōu)于ELISA法和膠體金法，適用于臨床大樣本的初檢。本研究中，對89例CMV陽性患兒進(jìn)行檢測，血清CMV-IgM陽性的有77例，而血清中CMV-IgM陰性的有12例，陽性檢出率為86.51%，準(zhǔn)確率為87.2%，雖然陽性檢出率較高，但仍有一定程度的誤差。因此，本研究結(jié)合熒光定量PCR法來檢測血清中CMV-DNA，以期提高對CMV感染診斷的準(zhǔn)確率。熒光定量PCR法是檢測特異度和敏感度較高，且可以在低病毒含量下進(jìn)行有效檢測的一種技術(shù)，具有極高的臨床應(yīng)用價值，是診斷CMV感染較為敏感的方法之一[14-16]。本研究利用熒光定量PCR對89例CMV陽性患者進(jìn)行檢測，其中CMV-DNA陽性的有81例，而CMV-DNA陰性的有4例，陽性檢出率為91.01%，準(zhǔn)確率為89.5%，與對血清中CMV-IgM的檢測相比，一定程度上提高了對CMV感染檢測的準(zhǔn)確率。

此外，研究表明[17-18]，當(dāng)機(jī)體受到CMV感染后會出現(xiàn)的免疫紊亂的情況，而其機(jī)制非常復(fù)雜，目前主要認(rèn)為與機(jī)體內(nèi)細(xì)胞因子的作用和失衡具有密不可分的關(guān)系。細(xì)胞因子是一類小分子多肽類物質(zhì)，是由免疫細(xì)胞分泌，并對細(xì)胞功能發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用，一旦細(xì)胞因子水平發(fā)生失衡，則表明機(jī)體免疫功能出現(xiàn)了紊亂。機(jī)體內(nèi)Th1和Th2細(xì)胞是免疫細(xì)胞主要的分化形式，Th1細(xì)胞主要分泌IFN-γ、TNF-β等因子，介導(dǎo)了細(xì)胞毒性和炎癥反應(yīng)，而Th2細(xì)胞主要分泌IL-4、IL-6和IL-10等因子，主要通過刺激B細(xì)胞分泌大量免疫蛋白，參與體液免疫反應(yīng)[19]。因此，常常檢測IFN-γ、IL-4和IL-6的含量來反映機(jī)體的免疫應(yīng)答狀態(tài)。本研究發(fā)現(xiàn)，CMV合并肺炎陽性患者血清中IFN-γ的含量明顯高于健康對照組(P<0.05)，經(jīng)統(tǒng)計分析后得到診斷的準(zhǔn)確率為72.6%，閾值為95.0 pg/mL，而血清中IL-4和IL-6的含量明顯低于健康對照組(P<0.05)，兩個指標(biāo)診斷的準(zhǔn)確率分別為75.6%和67.6%，閾值分別為35.05 pg/mL和51.75 pg/mL，但統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)IL-6的含量檢測并不具有統(tǒng)計學(xué)意義，因此后續(xù)不納入聯(lián)合檢測內(nèi)。

綜上所述，通過ELISA法檢測血清中IFN-γ、IL-4和IL-6的含量變化，與化學(xué)發(fā)光法、熒光定量PCR法的檢測結(jié)果相結(jié)合，可以更加準(zhǔn)確地判斷機(jī)體是否發(fā)生了CMV活動性感染，對于早期快速準(zhǔn)確診斷CMV感染合并肺炎具有非常重要的指導(dǎo)意義。但本研究中臨床樣本量只有89例，樣本量較少，其檢測結(jié)果可能會存在一定程度的偏差，代表性不夠，之后的研究將會加大臨床樣本的收集和檢測，以期提高聯(lián)合檢測的準(zhǔn)確度和可信度。